基于金剛烷-二氧雜環丁烷化學發光探針的研究進展

江龍，王開杰，孔晴，陸晟，陳小強

（南京工業大學化工學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京211816）

引 言

化學發光不需要外部光源的激發，是由分子間特定的化學反應產生的光發射現象，特定的化學反應一般是指經過氧化還原反應使分子處于高能態，隨后躍遷至基態而產生的化學發光，這種發光現象避免了外部光源激發所引起的光散射和自體熒光的干擾，具有高靈敏度、高精確度等優點。常見的化學發光主要分為四大類：一是魯米諾及其衍生物類，該類化學發光在堿性環境中發射藍色光[1]，主要被應用于胺、多肽、硫醇的標記中[2-6]；二是光澤精及吖啶酯類，同樣此類化學發光也需要在堿性溶液中進行，由于該類化學發光體系有量子產率高等優點，主要用于抗壞血酸、多巴胺、免疫球蛋白、酶、光遺傳學等試劑的檢測[7-11]；三是過氧化草酸酯類，該類化學發光探針最大的亮點是發光最適宜的pH 為7.5，接近人體生理條件[12-14]，主要應用于活性氧過氧化氫、免疫學分析[15-21]；最后一類是1,2-二氧雜環丁烷類。相較于前三類而言，1,2-二氧雜環丁烷類不需要額外的氧化劑(雙氧水、氧氣、高錳酸鉀等)參與，簡化了分析過程，提高了檢測靈敏度，擴大了化學發光的應用領域。

20 世紀80 年代，自Schaap 課題組報道第一例1,2-二氧雜環類化學發光探針以來，眾多科研工作者對該類探針進行了廣泛探索[22-27]。基于上述1,2-二氧雜環丁烷類化學發光的諸多優點，該類探針被廣泛應用在離子、活性氧硫、生物標志酶的識別以及發光材料等四大方面。其發光機理如圖1所示。

圖1 金剛烷-二氧雜環丁烷的發光機理Fig.1 Luminescence mechanism of adamantane-dioxane

保護基(PG)在特定的反應條件下脫去形成酚氧負離子，經過化學反應引發電子交換發光機制(CIEEL)分解產生激發態的苯甲酸酯，隨后躍遷回基態而產生化學發光[27-28]。本綜述著重介紹近幾年來金剛烷-二氧雜環丁烷類化學發光探針在離子檢測、活性物種、酶識別以及化學發光材料方面的進展。

1 氟離子檢測

陰離子在生物組織生長中起著重要的作用，因此近年來開發陰離子檢測和識別的方法備受關注。氟是人體重要的微量元素之一，氟化物主要以氟離子的形式存在，其主要分布在人體的骨骼和牙齒中，適量的氟含量能預防骨骼疏松和齲齒等疾病[29-31]，過量的氟攝入可能會導致結石或者癌癥的發生[32-33]。

2014 年Akkaya 課題組[34]報道了檢測F-的化學發光探針1(圖2)。該探針結構高度對稱，且分子結構中存在兩個自脫除的基團，探針選擇性識別F-后，分子內發生電子轉移，脫去兩個CO2分子，相對于只含一個發光團的探針結構，增加了發光團的數量，從而增強了化學發光強度。2017 年，該課題組在探針1的基礎上開發了另外一種用于選擇性檢測F-的化學發光探針2[35](圖3)。與探針1 不同的是該分子是一種自反饋型探針，該探針在選擇性識別F-后，本身又會自發地釋放F-，進一步增加了裂解后的探針數量，增強了化學發光強度。該探針水溶性較差、量子產率低的缺點，限制了其使用范圍。因此，此類氟離子探針的水溶性和量子產率有待進一步提高。

圖2 探針1的分子結構Fig.2 Structure of probe 1

圖3 探針2的分子結構Fig.3 Structure of probe 2

圖4 探針3和4的分子結構Fig.4 Structures of probes 3,4

2019年本課題組Gu等[36]報道了基于金剛烷-二氧雜環丁烷的化學發光探針3(圖4)，并在3 的識別基團鄰位引入吸電子基團丙烯酸甲酯得到探針4(圖4)，其化學發光壽命和波長得到很大的改善。在此基礎上分別構建了與表面活性劑Emerald-Ⅱ聯用的復合體系，實現了水溶液和生物體內氟離子的檢測，且具有很好的選擇性和較低的生物毒性。

2 活性物種的檢測

生物活性物種，主要包括活性氧、活性氮、活性硫等，是細胞內重要的一類分子，參與細胞內信號的傳導、免疫與代謝等生物學事件。在生物體內，這些活性物種的水平異常與心血管疾病、癌癥等重大疾病[37-39]的發生有很高相關性。檢測活性物種的方法一般有電子順磁共振法[40]、熒光分析法[41]、高效液相色譜法[42]、化學發光法等。化學發光法因其具有高信噪比、操作簡單等優點，已成為目前最主要檢測活性物種的分析方法之一。

Cao 等[43]在2015 年報道了3 例基于1,2-二氧雜環的化學發光探針5、6、7(圖5)，并比較了這三種探針對H2S的檢測性能。在加檢測物后，5、6、7三種探針發光強度分別增加了5 倍、4 倍、12 倍。由此可見苯環上X 位置被Cl 取代后的探針7 發光效果最好，其檢測限為5.4 μmol/L。影響化學發光的因素是苯酚-酚氧負離子之間的平衡和苯酚氧原子上的電荷密度。在pH 為7.4 的條件下，這三例探針的發光強度是由前者決定的，而探針7是最容易電離的，因此發射出最強的化學發光。這為進一步開發適用于生理環境的化學發光探針提供了研究基礎。

圖5 探針5～7的分子結構Fig.5 Structures of probes 5—7

2017 年Hananya 等[44]報道了一種用于檢測1O2的化學發光探針8、9(圖6)。探針8可以和1O2反應形成二氧雜環丁烷，隨后二氧雜環丁烷經化學激發分解，從而釋放出非常強的綠光。為了能夠實現在細胞中對1O2的檢測，將細胞穿透肽(CPP)連接到探針8的丙烯酸基團上得到探針9。在熒光共聚焦顯微鏡下可以觀察到探針9 可以很好地滲透入HeLa 細胞中成像[圖6（b）]。最后，探針9可以在光動力療法作用模式下對HeLa細胞內的1O2實現了有效的檢測和成像[圖6（b）]。這為化學發光探針進入細胞實現自發光成像提供了新的策略。

Turan 課題組[45]報道了2 個基于二氧雜環丁烷的化學發光探針10、11(圖7)，用于實現對H2O2的檢測。在向探針10 和11 的溶液中加入H2O2后，都可以觀察到亮藍色的光，兩例探針的檢測限分別為240 μmol/L 和75 μmol/L，探針11 具有更低的檢測限，并且在加入同等量的H2O2后，探針11 的發光強度更強。作者對檢測機理進行了探究，認為探針11的發光強度更強是因為該探針含有兩個自脫除的基團，增加了激發的化學發光基團數量，從而增強了化學發光強度。這種增強化學發光強度的方式為其他發光探針的設計提供了有益的探索。

由于熒光探針需要外部激發光的激發，由外部激發光所帶來的光散射常常對檢測造成干擾，而自發光不需要外部激光的導入，因此規避了以上缺陷。2018年，Yang課題組[46]根據Payne/Dakin反應機理，設計并合成了基于熒光發射用于檢測H2O2的熒光探針12 和13(圖8)。2020 年，同樣基于該檢測機理，Ye 等[47]合作報道了一例可用于細胞和動物活體中過氧化氫實時監測的化學發光探針14(圖8)。在沒有任何激發光的存在下，探針14 溶液中加入10個當量的H2O2后，該溶液的發光強度在3 min 內提高了430 倍。其機理在于探針14 與H2O2反應后，水楊醛被氧化為鄰苯二酚，隨后進行醚裂解，最后進行化學激發從而釋放化學發光。

圖6 探針8化學發光機理(a)及探針9細胞滲透共聚焦熒光成像與檢測1O2的細胞成像圖(b)[44]Fig.6 Chemiluminescence mechanism of probe 8(a)and cell permeability confocal fluorescence imaging and cell imaging for detection of 1O2 of probe 9(b)

圖7 探針10、11的分子結構Fig.7 Structures of probes 10,11

圖8 探針12～14的分子結構及發光機理Fig.8 Structures and luminescence mechanism of probes 12—14

3 酶的檢測

酶是生物體內一種重要的生物大分子，生物體內各種生物事件的運轉都離不開酶的參與，另外酶的活性還與腫瘤疾病的發生有關[48]。目前判斷腫瘤的惡化程度常通過核磁共振、正電子發射斷層掃描等技術，這類方法比較煩瑣且分辨率較低。隨著人們對酶的認識越來越深入，發現多種酶在腫瘤中的表達異于正常組織，因此，酶的過量表達常作為腫瘤標志物來判斷疾病的發生，例如β-半乳糖苷酶[49]、硝基還原酶[50-52]、組織蛋白酶B[53]等常常作為腫瘤的標志酶。

圖9 探針15的分子結構Fig.9 Structure of probe 15

Gnaim 等[54]報道了通過化學發光模式實時監測藥物前體探針15 在細胞內被活化的過程(圖9)。他們選擇了單甲基澳瑞他汀E并將其修飾制備了藥物前體，該藥物前體可被β-半乳糖苷酶激活。在β-半乳糖苷酶的存在下，藥物前體被活化伴隨著綠光的發射，發光強度隨著藥物前體濃度的增加而增加。這種以化學發光監控藥物的釋放具有低背景干擾等優點，因此具有很大的應用空間。

Eilon-Shaffer 等[55]報道了兩種基于二氧雜環丁烷的化學發光探針16和17用于識別β-半乳糖苷酶(圖10)。兩個探針的區別是探針17在酚羥基的鄰位引入了吸電子基——氯。酚環上的氯取代基是為了在切割β-半乳糖苷酶底物后降低所釋放發射物的pKa值，這樣的pKa可以使二氧雜環丁烷的化學激發在生理條件下發生。在pH 等于5.5時，探針17具有更高的發光信號，約是探針16 的20 倍，另外，探針17 的光穩定性比16 的更好。在細胞成像中，兩個探針和CT26-LacZ 在相同條件下共孵育后，觀察到探針17 的發光強度更高，約是探針16 的10 倍。為了更好地使探針在細胞內成像，他們在探針16和17 的結構中引入了具有高溶解度和腫瘤定位作用的多肽-CGKRK，得到探針18、19。探針19 實現了患有CT26-Lac Z腫瘤小鼠體內的化學發光成像。

一直以來，在水環境下金剛烷-二氧雜環丁烷類化學發光探針的化學發光效率較低，為了解決這一難題，可將探針與環糊精結合形成超分子化合物，該超分子化合物的水溶性和發射波長得到了很大改善。基于此，Gnaim 等[56]報道了二氧雜環丁烷化學發光探針20、23 和環糊精(TMCD)形成1∶1 主客體復合物探針21、22、24(圖11)。在水溶液中，探針20幾乎不發光，而形成的主客體復合物21則會發出亮光，強度約為探針20 的60 倍。隨后，將熒光素染料共價連接到TMCD 上，得到化合物TMCD-FITC，再將探針20 包進TMCD-FITC 得到新的超分子復合物22。在水溶液中，復合物22的發光強度約是探針20 的1500 倍。為了實現這種主客體復合物在體內外成像的應用，他們將化學發光探針23 和TMCDFITC 結合得到復合物24，復合物24 在HEK-293-LacZ 細胞中進行孵育，隨后觀察到了很強的化學發光信號。

Cheng 等[57]報道了一例用于肝中毒過程檢測的化學發光探針25(圖12)。該研究的亮點在于包含兩個成像通道——近紅外和化學發光通道，即探針既可以通過化學發光通道檢測超氧負離子(O2?-，CF3SO3—為其識別基團)，也可以通過近紅外通道檢測Caspase-3(-DVED-AC 為其識別基團)，且兩通道之間相互獨立，互不影響。在肝中毒小鼠模型中也成功驗證了探針25的雙功能成像能力。另外，用探針25 檢測到肝中毒的時間比組織學分析提前了17.5 h，這充分體現了化學發光法在生物檢測和成像應用中的優勢。

圖10 探針16～19的分子結構及探針19的腫瘤活體成像圖[55]Fig.10 Structures of probes 16—19 and in vivo tumor imaging of probe 19[55]

圖11 探針20～24的分子結構Fig.11 Structures of probes 20—24

Das 等[58]合作報道了一種基于碳青霉烯功能化的化學發光探針26，該探針可以成功檢測活細菌中碳青霉烯酶的活性（圖13）。探針26 作為碳青霉烯酶的底物可被該酶選擇性水解，然后進行1,6-消除反應，并通過快速化學激發發射出綠光。探針對碳青霉烯酶的檢測限低至0.06 mU/ml。

圖12 探針25的分子結構及發光機理Fig.12 Structure and luminescence mechanism of probe 25

圖13 探針26的分子結構Fig.13 Structure of probe 26

乏氧是實體腫瘤的常見特征，這是由氧氣供需不平衡引起的。隨著腫瘤細胞中乏氧的產生，硝基還原酶(NTR)表達水平會提高。因此NTR 可作為生物乏氧的常見標志，廣泛用于評估腫瘤的乏氧程度。Sun 等[59]報道了一種高水溶性化學發光探針27，該探針可用于動物體內硝基還原酶(NTR)的高靈敏度檢測和成像（圖14）。探針本身不發光，而接觸NTR 后，探針分子對硝基芐基部分轉化為4-羥胺芐基，然后進行1,6-重排消除并引發電子轉移，導致二氧雜環丁烷分解，隨后產生強化學發光輸出信號。經硝基還原酶處理后，探針27發光強度增加了6000倍，化學發光強度與NTR 濃度在3～55 ng/ml 范圍內呈正比，檢測限低至0.947 ng/ml。此外，探針27 成功監測了腫瘤小鼠在不同氧含量(100%、21%、7%～10%)條件下的內源性NTR成像。

同樣，Cao 等[60]設計報道了兩種基于金剛烷-1,2-二氧雜環丁烷化學發光反應的成像探針28和29，它們在生理pH 下與硝基還原酶反應后均可立即發光（圖15）。但探針28 與硝基還原酶反應后發光強度只增加了約5 倍，而探針29 增加了約170 倍。另外，探針29 的選擇性也明顯優于探針28，這是由于探針29分子中的醚鍵更穩定，導致發光背景大大降低。此外，探針29還成功應用于乏氧條件下硝基還原酶的體內成像。

圖14 探針27的分子結構及在不同氧氣含量下的活體成像圖[59]Fig.14 Structure of probe 27 and in vivo imaging under different oxygen conditions[59]

圖15 探針28、29的分子結構及探針29的活體成像圖[60]Fig.15 Structures of probes 28,29 and in vivo imaging of probe 29[60]

Shabat 課題組[61]首次報道了用于組織蛋白酶B檢測和成像的化學發光探針30、31、32、33(圖16)。在向上述4 例探針溶液中加入組織蛋白酶B 后均觀察到化學發光，其中，探針33 的檢測限為76.29 μU/ml。更重要的是探針33 的發光強度遠高于其他三個探針，這可能是因為該探針在探針32的結構上引入了水溶性強且具有定位作用的多肽KAPGC。隨后，對探針33 進行了細胞成像研究，在該探針和Raw 264.7、CT26 分別進行孵育后化學發光產生，實現了對細胞中組織蛋白酶B的檢測。

Zhang 等[62]在2020 年報道了基于次序激活的雙重鎖定化學發光染料探針34、35(圖17)。設計新策略是將識別過程和光子釋放過程次序觸發，成功實現了檢測物的特異性識別與光控的次序性響應。底物分子首先與分析物通過識別作用生成具有穩定的化學發光中間體，該中間體是導致化學發光的關鍵，并隨著識別過程逐漸累積；隨后，在光控作用下生成1,2-二氧雜環丁烷的高能結構，最后釋放出明亮的化學發光。利用該策略設計合成了檢測β-半乳糖苷酶的探針34 以及活性氧過氧化氫的探針35。這種雙鎖-次序性響應的設計新策略，有效地解決了傳統輝光型發光檢測過程的光子不可控、發光信號弱的難題。

金剛烷-二氧雜環丁烷類化學發光探針因其本身發光效率低，發射波長短，使其在細胞及活體應用中受到了一定的限制。但經過相應結構的修飾，比如引入環糊精、強吸電子基團、細胞穿透肽等，其發光強度及水溶性得到很大的改善。基于此，該類探針已被廣泛應用于細胞及活體中的酶活性檢測。

4 化學發光材料

單分子化學發光探針存在兩個不足：(1)發射波長較短；(2)水溶性、穩定性較差。這些不足之處限制了其在生物學上的應用。在此基礎上，很多研究著重于解決上述問題。解決方法主要是把該類化學發光探針與環糊精復合構成超分子體系或者與半導體結合構建納米粒子。

Ni 等[63]在2019 年報道了具有聚集誘導發射(AIE)特性的近紅外余輝發光納米粒子探針36(圖18)。該納米粒子合成方法是用脂質體-PEG2000通過納米共沉淀法包裹36a 和化合物36b。發光機理是近紅外熒光分子36a在白光照射下產生1O2，1O2隨后氧化化合物36b 形成二氧雜環丁烷36c，36c 隨后發生自分解形成激發態的36d，其躍遷回基態伴隨著自發光的產生，隨后將能量轉移回近紅外熒光分子36a，最終釋放近紅外余輝發光，并持續10 d 以上。在體內的NIR 余輝信號可以在正常組織(例如肝臟)中快速淬滅，而在腫瘤中可以長時間發光，從而導致超高的腫瘤-肝臟信號比(比熒光成像的要高近100 倍)。因此，納米顆粒36 在癌癥手術中可提供精確的圖像引導。

Roda 等[64]在2012 年報道了一種摻雜二氧雜環丁烷的二氧化硅納米顆粒探針37(圖19)，這種納米顆粒可以作為生物分析中超靈敏的熱化學發光標記。納米顆粒探針37 的熱化學發光發射可以在低溫(低于100°C)下觸發，由于基于吖啶基類1,2-二氧雜環丁烷分子在每個納米粒子中負載量大(約104個)，發光信號被大大放大，并且由于能量轉移到熒光受體雙嘧達莫上，而提高了發射效率。

Andronico 等[65]報道了基于熱化學發光的半導體聚合物點探針38(圖20)。他們通過納米共沉淀法，將熒光分子38a、聚合物38b、二氧雜環丁烷衍生物38c合成單分散的熱致發光半導體聚合物點探針38。半導體聚合物點探針38 表現出很好的時間穩定性。每個半導體聚合物點探針38 里大約摻雜了20 個二氧雜環，它的發光強度大大增強；另外，該聚合物點在加熱至110℃時，1, 2-二氧雜環丁烷分解生成電子激發態的38d，該產物與摻雜的熒光分子38a 產生FRET 效應，從而產生強烈的紅光。隨后，他們將鏈霉親和素共價結合到該聚合物表面上，以應用到生物檢測中。在免疫測定中，半導體聚合物點探針38 檢測免疫球蛋白G(lgG)的檢測限低至13 nmol/L，動態范圍擴展至230 nmol/L。

圖16 探針30～33的分子結構Fig.16 Structures of probes 30—33

圖17 發光機理及探針34、35的分子結構Fig.17 Luminescence mechanism and structures of probes 34,35

Sijbesma 課題組[66]報道了關于二氧雜環丁烷摻入熱塑性彈性體中得到化學發光材料探針39、40、41的工作(圖21)。其過程是二氧雜環丁烷單元被嵌入到聚四甲氧基聚合物主鏈中，施加應變后，四元環斷裂導致聚合物測試樣品發光。他們以上述三種不同結構為基礎，從聚合物總分子量、二氧雜環單元含量、氫鍵以及所受應力強弱四個維度探討了對發光強度的影響，證明了該聚合物發光強度與上述四個維度呈正相關性。

馬林斯效應是指橡膠類材料在應力超過最大承受值時發生應力軟化的現象[67-72]。Clough 等[73]研究了共價鍵斷裂在機械記憶各向異性中的作用。在填有二氧化硅的聚二甲基硅氧烷中的機械發光交聯劑受到應力會誘導發光，這是由于該交聯劑中所包含的二氧雜環丁烷可在強制誘導鍵斷裂時發光，基于該機理，設計并合成了填充彈性體發光材料探針42(圖22)。在該材料中，二(金剛烷基)-1,2-二氧雜環丁烷作為發光基團是通過共價結合的，該材料在受到一定外部應力的作用下，基團中心四元環共價鍵優先斷裂，隨后發出化學發光，以達到實時可視化監測機械應力變化的作用。

圖18 納米粒子36的合成過程及發光機理Fig.18 Synthesis and luminescence mechanism of nanoparticle 36

圖19 二氧化硅納米顆粒37的結構和發光機理Fig.19 Structure and luminescence mechanism of silica nanoparticles 37

圖20 半導體聚合物點38的結構和發光機理Fig.20 Structure and luminescence mechanism of semiconducting polymer dots 38

圖21 化學發光材料39～41的結構Fig.21 Structures of chemiluminescence materials 39—41

圖22 化學發光材料42的發光機理及結構Fig.22 Luminescence mechanism and structure of chemiluminescence material 42

Cui等[74]報道了一類半導體納米顆粒，可用于藥物誘導的癌癥免疫激活的體內化學發光成像。該類半導體納米顆粒分別由三種不同的半導體聚合物SP1、SP2、SP3 與金剛烷-二氧雜環底物組成，其中半導體和金剛烷-二氧雜環底物分別作為化學發光的受體和供體，其結構分別為探針43、44、45(圖23)，半導體聚合物本質上是有熒光的，但只有在O2?-的激活下才會變成化學發光。當納米顆粒探針43、44 被O2?-激活后發黃綠色光(540 nm)，而納米顆粒探針45被O2?-激活后發近紅外光(700 nm)，可靈敏地檢測出毒性T細胞中較高的O2?-水平，因此將其與其他細胞(包括癌癥和正常細胞)區分開。

金剛烷-二氧雜環丁烷類化學發光探針因結構中過氧橋鍵的不穩定性，易受力或者熱等外部因素的干擾而斷裂，致使化學發光的產生。利用這種特性，熱致發光材料、彈性材料等被開發出來。同樣，納米粒子因其有良好的生物相容性、結構易修飾等優點，眾多納米粒子包裹該類化學發光探針生物材料也被開發出來。

5 總結與展望

本文基于金剛烷-二氧雜環丁烷類化學發光機理、結構特點、識別機理等，介紹了此類化學發光探針在離子檢測、活性物種和生物標志酶的識別以及發光材料等方面應用的特點和優勢。雖然這類化學發光探針有諸多優點，也取得了一定的進展，但仍然還有一些亟待解決的問題。

圖23 半導體納米粒子43～45的結構及檢測機理Fig.23 Structures and detection mechanism of semiconductor nanoparticles 43—45

（1）該類化學發光探針合成路線較長，需要繼續開發出更加優良的合成方法學。

（2）這類化學發光探針顯著的缺點是水溶性較差，一定程度上限制了生物學應用，目前改良水溶性問題的方法還是比較單一且合成復雜。

（3）為了使金剛烷-二氧雜環丁烷類化學發光探針有更好的生物學應用，在探針結構中引入強吸電子基團更好地改善了探針發光效率，但解決方式單一，需要探索更廣泛的方法。

發射波長處于近紅外窗口更有利于生物學應用，但該類探針單分子發射波長并不能達到近紅外窗口。目前大量研究是聚焦于延長發射波長，解決方式主要有：與環糊精構建超分子體系或者與具有聚集誘導發光性能的熒光探針構建納米粒子。但是目前這些方法實施后，發射波長最多能達到近紅外窗口Ⅰ(NIR-Ⅰ，700～900 nm),仍需要開發處于近紅外窗口Ⅱ(NIR-Ⅱ，1000～1700 nm)的化學發光探針。