木脂素的生物合成及其微生物法生產的研究進展

王煉，吳迪，周景文

（江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122）

引 言

木脂素是一類由兩分子苯丙素單元氧化聚合而成的植物次級代謝產物。木脂素主要功能是保護植物避免遭受食草動物和微生物的侵害，多具有抗細菌、抗病毒和抗真菌活性[1]。木脂素能抵御活性氧，保護種子中的油脂不被氧化。木脂素在月桂科植物中含量豐富，特別是潤楠屬、樟桂屬和甘蜜樹屬[2]。然而，植物天然產物通過植物生物質加工獲得，需要持續的土地、水和時間投入。蟲害或極端天氣造成木脂素含量的不確定性影響了植物天然產物的加工提取[3]。

代謝工程和合成生物學的發展，為微生物合成木脂素奠定了良好的基礎，如在大腸桿菌中合成木脂素的重要前體物松柏醇[4-5]和松脂素[6]，在釀酒酵母中合成松柏醇[7]和芝麻素[8]等。隨著木脂素在植物中的合成路徑不斷被解析，越來越多的人們關注采用微生物法合成木脂素的可行性。本文基于木脂素類化合物的結構和生物合成路徑的解析，總結了當前微生物法生產木脂素的研究進展，并對如何進一步提升微生物法合成木脂素類化合物的效率進行了展望。

1 典型的木脂素類化合物

木脂素類化合物根據結構類型分為8種(圖1)：芳基萘(arylnaphthalene)、芳基四氫萘(aryltetralin)、雙并四氫呋喃(furofuran)、二芐基丁內酯(dibenzylbutyrolactone)、二苯并環辛二烯(dibenzocyclooctadiene)、二芳基丁烷(dibenzylbutane)、二芐基丁酸乳酯(dibenzylbutyrolactol)、呋喃(furan)[9]。木脂素類化合物還能根據苯環和丙基側鏈的氧化程度分為3類：帶有C9(C9′)-氧的木脂素、無C9(C9′)-氧的木脂素和二羧酸木脂素。帶有C9(C9′)-氧的木脂素類研究最為廣泛，包括落葉松脂素(lariciresinol)、開環異落葉松脂素(secoisolaricisiresinol，SECO)、羅漢松脂素(matairesinol)等[10]。

1.1 芳基萘和芳基四氫萘類木脂素

芳基萘和芳基四氫萘類木脂素都具有顯著的生物活性，受到制藥工業的關注。其中，芳基萘木脂素是傳統中藥的成分，具有抗病毒、抗真菌、抗原生動物和抗血小板等活性[11]，典型的芳基萘類木脂素包括山荷葉素和賽菊芋黃素；芳基四氫萘類木脂素在傳統醫學中被廣泛用于各種疾病的治療[12]，鬼臼毒素和南燭木樹脂酚是芳基四氫萘類木脂素的研究熱點。

山荷葉素(diphyllin，圖2)來源于丘生閉花木(Cleistanthus collinus)，可以作為新型V-ATPase 抑制劑來治療胃癌，并且抑制Wnt/β-catenin 信號傳導中LRP6 的磷酸化[13]。山荷葉素能抑制食道癌細胞系TE-1和ECA-109的增殖和誘導S期阻滯；其還能通過調控mTORC1/HIF-1α-/VEGF 途徑阻礙血液轉移[14]。此外，山荷葉素還能誘導活性氧的產生來破壞沙門氏菌的生物膜[15]。

賽菊芋黃素(helioxanthin)從臺灣杉(Taiwania cryptomerioides Hayata)中分離得到。賽菊芋黃素能下調EGFR/ERK/c-fos 信號通路抑制COX-2表達,激活p27誘導G2/M 細胞周期阻滯，進而抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖[16]。賽菊芋黃素還能抑制腦腫瘤轉移，阻止黑色素瘤和腦內皮細胞的遷移[17]。

鬼 臼 毒 素（podophyllotoxin）從 桃 兒 七(Podophyllum emodi Wall) 和足葉草(Podophyllum peltatum L.)等鬼臼類植物中分離得到[18]。它被用作很多著名的抗腫瘤藥物的合成前體，包括依托泊苷(etoposide)、依 托 泊 福(etopophos) 和 替 尼 泊 甙(teniposide)[19]。Bala 等[20]發現鬼臼毒素在釀酒酵母中能抗輻射，為其他生物的抗輻射研究奠定了基礎。Casey 等[21]利用亞砜構建了簡短的立體選擇性鬼臼毒素全合成路徑，利用一鍋串聯共軛加成/醛醇/親電子芳族取代反應合成四氫化萘。Huang等[22]從桃兒七的根莖分離得到的內生菌TW5，發酵7 d后鬼臼毒素產量達到49.3 μg/g菌絲體干重。

圖1 木脂素的基本骨架Fig.1 Basic skeletons of lignans

圖2 典型木脂素的結構Fig.2 The structures of typical lignans

南燭木樹脂酚(lyoniresinol)具有抗氧化和抗突變活性，能通過減少酪氨酸酶的蛋白表達和活性抑制黑色素生成[23]。體內和體外實驗均表明南燭木樹脂酚可以在臨床皮膚治療中用作皮膚美白劑。南燭木樹脂酚可以從一些植物中提取，小果南燭提取出的產物的旋光性最高[24]。除了從植物提取外，還能通過纖維素酶水解南燭木樹脂酚糖苷合成。Takemoto 等[25]結合合成化學和植物細胞培養的方法合成南燭木樹脂酚。

芳基四氫萘衍生物例如鬼臼毒素目前只能依靠植物提取，芳基四氫萘木脂素需求量的持續增加使得自然資源消耗殆盡。由于生物合成路徑尚未被完全解析，依靠化學合成法生產具有生物活性和對映體選擇性的產物成為主要的合成方式。

1.2 雙并四氫呋喃類木脂素

雙并四氫呋喃類木脂素含有2,6-二芳基-3,7-二氧雜雙環辛烷骨架，又被稱為雙環氧木脂素[26]。連接方式、取代基和構型的不同造成雙并四氫呋喃類木脂素的種類十分豐富。結構上的變化賦予了雙并四氫呋喃類木脂素抗氧化、抗炎和抗菌活性，具有代表性的化合物包括松脂素和芝麻素。

松脂素(pinoresinol)屬于雙并四氫呋喃類木脂素，在木本植物和纖維植物中含量較多。松脂素通過改變細胞的生理和形態，抑制大腸桿菌(Escherichia coli)、 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)的生長[27]。從接骨木屬植物(Sambucus williamsii)中分離出的松脂素表現出抗真菌特性，對人類紅細胞不會造成影響[28]。松脂素還能改善記憶障礙并促進海馬LTP 的誘導，這可能和松脂素對AChE和鈣內流的影響有關[29]。

芝麻素(sesamin)以松脂素為前體合成，是芝麻種子主要的雙并四氫呋喃木脂素。芝麻油中的木脂素主要包括芝麻素(0.1%～0.6%)、芝麻林素(sesamolin，0.25%～0.3%)、芝麻酚(sesamol)和芝麻素酚(sesaminol)，這些成分可以幫助細胞抵抗酸敗[30]。長期服用芝麻素酚被認為可以抑制和阿爾茲海默癥相關的致病的胞外β-淀粉樣蛋白聚集[31]。它還可以被用作針對細胞周期蛋白D1 過表達癌癥的可能的抗癌藥物[32]。

在過去二十年里，很多天然來源的雙并四氫呋喃類木脂素被分離并鑒定出結構。雖然雙并四氫呋喃類木脂素，例如松脂素可以從谷物、豆類、水果和蔬菜中分離，但是分離產物的效率和產量較低。在含有6%的蔗糖的培養基中，金鐘連翹(Forsythia x intermedia)細胞懸浮培養(12±2)d 后，(+)-松脂素的對映體含量達到75%±5%[33]。隨著芝麻素及其衍生物的路徑被完全解析，人們可以嘗試在微生物細胞工廠中異源合成芝麻素。

1.3 二芐基丁內酯類木脂素

二芐基丁內酯類木脂素及其糖苷類化合物和它們的生理特性密切相關，其具有抗腫瘤、抗病毒、神經保護和抗炎等重要作用。羅漢松脂素和牛蒡酚是重要的二芐基丁內酯類木脂素，均對癌細胞系表現出明顯的細胞毒性[34]。

羅漢松脂素（matairesinol）屬于二芐基丁內酯類木脂素，存在于多種種子、蔬菜和水果中，具有抗氧化、抗雌激素、抗骨質疏松等活性，能減少激素依賴型癌癥的風險[35]。Choi 等[36]發現羅漢松脂素的抗骨質疏松活性主要通過p38/ERK-NFATc1信號通路表現，而不是抗吸收行為。在大鼠和人的尿液中，羅漢松脂素被腸道細菌轉化為腸二醇和腸內酯。羅漢松脂素通過細胞周期阻滯和細胞凋亡，對急性淋巴細胞白血病CCRF-CEM 細胞系產生細胞毒性[37]。瑞香和芫花被證實是通過開環異落葉松脂素脫氫酶(SDH)催化合成(+)-羅漢松脂素[38]。傳統的阿魏酸的氧化偶聯反應合成羅漢松脂素產量較低，Zhu等[39]利用區域選擇性氧化偶聯，以5-(叔丁基)-阿魏酸為前體合成羅漢松脂素，轉化率高達91%。

牛蒡酚(arctigenin)屬于二芐基丁內酯類木脂素，分布于巴丹果、雪蓮花、香榧和椰菜等，是牛蒡(Arctium lappa L.)種子的主要生物活性成分。利用牛蒡酚對原發性高血壓大鼠進行長期治療，可以明顯降低收縮血壓，改善大鼠的內皮功能障礙[40]。牛蒡酚通過STAT3 抑制作用增強癌細胞對順鉑的敏感性，促進順鉑誘導的癌細胞死亡[41]。此外，牛蒡酚還可以穿過血腦屏障，在大腦中與海藻酸鹽敏感的離子型谷氨酸受體相互作用[42]。因此，牛蒡酚還能作為抑制谷氨酸誘發的中樞神經系統反應的潛在藥物。

羅漢松脂素被證實通過開環異落葉松脂素脫氫酶催化SECO 的合成[38]；然而，牛蒡酚的生物合成路徑尚未解析，主要依賴于植物提取。天然的二芐基丁內酯類木脂素化合物及其衍生物為抗癌藥物的研發和篩選提供了豐富的資源庫。

1.4 其他木脂素類化合物

除了前面討論的芳基萘和芳基四氫萘類木脂素、雙并四氫呋喃類木脂素和二芐基丁內酯類木脂素(表1)，還有很多其他木脂素類化合物同樣具有重要的藥用價值。本文分別以五加胡前素、葉下珠脂素、蓽澄茄素和落葉松脂素介紹二苯并環辛二烯木脂素、二芳基丁烷類木脂素、二芐基丁酸乳酯類木脂素和呋喃類木脂素的基本性質、來源及藥用價值。

五加前胡素(steganacin)屬于天然的二苯并環辛二烯木脂素，于1973 年從劍葉菊(Steganotaenia araliacea)中分離。與微管蛋白中的秋水仙堿位點結合后，五加前胡素在體內表現弱的抗腫瘤活性[43]。五加前胡素的研究鮮有報道，目前尚未用于藥物治療。這可能是由于其結構復雜、合成難度大導致五加前胡素的產量極低。Augros 等[44]報道了五加前胡素中間產物的無過渡金屬的合成方式。五加前胡素的功能研究和藥物應用有待于其生物合成路徑的解析和化學合成法的探索。

葉下珠脂素(phyllanthin)屬于二芳基丁烷類木脂素，從大戟科植物葉下珠(Phyllanthus amarus)中分離。Ooi 等[45]發現葉下珠脂素通過誘導細胞凋亡抑制HepG2 的細胞增殖。Lam 等[46]構建了殼聚糖基微膠囊包裹葉下珠脂素，含有葉下珠脂素的微膠囊分別對人成纖維細胞與角質形成細胞、金黃色葡萄球菌表現出更高的抗氧化能力和生長抑制效果。Dunkoksung 等[47]探究了葉下珠脂素穿過極化Caco-2 的吸收能力和P-糖蛋白(P-gp)介導的藥物互作中的潛在作用；葉下珠脂素能通過跨細胞途徑被動擴散，干擾其他共同運輸的藥物的轉運。

表1 木脂素的種類及其典型化合物的基本性質Table 1 The categories of lignans and the basic characters of typical compounds

蓽澄茄素(cubebin)屬于二芐基丁酸乳酯類木脂素，分布在部分植物的木材、根和樹脂，具有鎮痛、消炎、抗錐蟲的活性[48]。蓽澄茄素及其內酯和酰胺基衍生物具有顯著的抗癌活性，Rajalekshmi 等[49]通過體外實驗檢測了蓽澄茄來源的(-)-蓽澄茄素及其衍生物對6 種人類癌細胞系(A549、K562、SiHa、KB、HCT116 和HT29)的抗癌活性。在部分被測試細胞系中，酰胺基衍生物表現出更高的抗癌活性。Niwa等[50]研究了(-)-蓽澄茄素對人肝癌細胞系的細胞毒性、致突變性和p38 MAP 激酶與GSTa2 的表達的影響，發現只有高濃度的蓽澄茄素導致明顯的細胞毒性。

落葉松脂素（lariciresinol）屬于呋喃類木脂素，具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗雌激素等生物活性[51]。Bajpai等[52]從菲律賓茜草(Rubia philippinensis)分離出落葉松脂素，檢測其針對食源性病原體金黃色葡萄球菌KCTC1621 和大腸桿菌O157∶H7 的抗菌能力。通過最低抑菌濃度(MIC)實驗發現，經過落葉松脂素處理的金黃色葡萄球菌KCTC1621 和大腸桿菌O157∶H7 的細胞壁形態遭到破壞。落葉松脂素還能破壞真菌質膜，抑制人類病原性真菌[53]。此外，落葉松脂素可能通過激活線粒體介導的細胞凋亡途徑抑制肝癌HepG2細胞[54]。

除了落葉松脂素，其他木脂素類化合物的研究主要限制于植物來源的低豐度。目前，已經篩選到一些菌株可以實現木脂素的轉化，例如(-)-蓽澄茄素還能通過土曲霉(Aspergillus terreus)和黑曲霉(Aspergillus niger)轉化為(-)-扁柏脂素和(-)-parabenzlactone，能顯著抑制口腔病原菌[55]；Xie 等[56]從人的糞便中篩選得到糞腸球菌(Enterococcus faecalis)PDG-1，可以將(+)-松脂素轉變為(+)-落葉松脂素。微生物合成法相比植物提取法，生產周期更短、產物濃度更高，是一種高效的生產替代方式。然而，大部分木脂素化合物的合成路徑尚未解析，限制了微生物合成法的應用。

2 木脂素類化合物的生物合成途徑

木脂素的生物合成引起了廣泛關注，其原因包括：(1)木脂素的生物合成涉及獨特的立體化學性質；(2)木脂素具有很多重要的臨床生物活性；(3)木脂素及其衍生物，如去甲木脂素通過生物合成大量積累在樹的心材區域[10]。苯丙氨酸和酪氨酸是單寧、木質素和木脂素合成的前體。苯丙氨酸通過苯丙氨酸解氨酶生成肉桂酸(圖3)，接著經過肉桂酸-4-羥化酶催化生成對香豆酸，或者以酪氨酸為底物通過酪氨酸解氨酶生成對香豆酸；再通過連續的羥基化、甲基化和還原反應生成咖啡酸、阿魏酸、松柏醇，最終得到松脂素[30]。由于其他木脂素類化合物的合成路線目前尚未被報道，本節主要介紹芝麻素及其衍生物、亞麻木酚素的生物合成路徑。

2.1 芝麻素及其衍生物的生物合成路徑

圖3 植物松脂素合成途徑Fig.3 The synthesis pathway of pinoresinol in plants

芝麻(胡麻科，芝麻屬)富含各種生物活性物質，包括木脂素、生育酚類似物、植物甾醇等。在芝麻種子里，兩分子松脂素之間形成亞甲基二氧橋合成(+)-胡椒醇，再以相同的方式合成(+)-芝麻素。Ono等[8]發現芝麻中(+)-芝麻素和(+)-胡椒醇的合成(圖4)都是經過CYP81Q1 催化。經比較，CYP81Q1 和同樣催化亞甲二氧橋形成的CYP719A1的氨基酸序列一致性只有24%。CYP81Q1 在芝麻中還存在兩種同源蛋白，分別是S.radiatum 來源的CYP81Q2 和S.alatum 來源的CYP81Q3。兩種蛋白和CYP81Q1 的結構相似，只有CYP81Q2 和CYP81Q1 表現出相同的NADPH 依賴型胡椒醇合成酶活性。利用LC-MS檢測S. alatum 的木脂素組成，主要有(+)-2-episesalatin、(+)-alatumin 和(+)-新木脂體柄果脂素[57]。共表達CYP81Q3和細胞色素還原酶(CPR1)的酵母細胞，加入(+)-表松脂素，被徹底轉化為(+)-新木脂體柄果脂素[57]。

圖4 芝麻素及其衍生物的天然合成路徑Fig.4 The native biosynthesis of sesamin and derivatives

芝麻林素的合成需要在呋喃和苯環之間插入非典型氧[58]，這個反應只在橢苞爵床(Justicia simplex)[59]和透骨草(Phryma leptostachya)中觀察到[60]。人們推測芝麻林素酚(sesamolinol)形成亞甲基二氧橋后轉化為芝麻林素。收集表達CYP81Q1 釀酒酵母的微粒體，與芝麻林素酚和NADPH 混合，產物中沒有檢測到芝麻林素。Murata 等[58]綜合遺傳、組學等方法鑒定了P450 單加氧酶CYP92B14 負責芝麻素加氧形成芝麻林素和芝麻素酚。以7R,7′S-samin為起始材料合成的呋喃木酚素和黃酮木酚素具有β-糖苷酶和自由基抑制活性。Tsai等[61]以芝麻林素為底物，通過酸催化合成了7R,7′S-samin；加入H2O2后，7R,7′S-samin轉化為7R,7′R-samin。

芝麻素酚三糖苷合成的關鍵酶的鑒定過程困難，影響因素包括：(1)芝麻的遺傳和基因組信息缺少；(2)大多數種子植物中的尿苷二磷酸(uridine diphosphate，UDP)-葡萄糖基轉移酶和細胞色素P450的同源基因較多；(3)很多底物或者中間產物含量低，缺乏用于體外實驗的商業化產品。Ono 等[62]通過多維組學的方法找到了一種新的UDP-葡萄糖基轉移酶，UGT94AG1 可以催化芝麻素酚三糖苷的形成。通過酵母雙雜實驗還發現，UGT71A9、UGT94AG1 和UGT94AA2 與膜結合蛋白CYP81G1相互作用，完成三糖苷的合成。

2.2 亞麻木酚素的生物合成路徑

大部分木脂素以糖基化形式存在于植物中，比如前面提及的芝麻素酚三糖苷。亞麻木酚素，又稱開環異落葉松脂素二葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside，SDG)，屬于亞麻籽中的糖基化木脂素。SDG 具有保護機體免受心血管疾病、糖尿病、癌癥和精神壓力的影響的特性[63]。SDG 還能被轉化為哺乳動物木脂素，具有作為抗癌藥物的潛力[64]。

松脂素首先通過雙功能的NADPH 依賴型松脂素/落葉松脂素還原酶(PLR)轉化為落葉松脂素和SECO(圖5)。von Heimendahl 等[65]從L.album 中分離出編碼PLR 的基因，通過異源表達證明其具備催化(+)-松脂素轉化為(-)-SECO 的能力。結合轉錄組和代謝產物分析發現菘藍(Isatis indigotica)中liPLR1對落葉松脂素的合成至關重要，而且通過RNA 干擾抑制liPLR1的表達顯著影響落葉松脂素合成[51]。擬南芥中的AtPLR 對松脂素表現出嚴格的偏好性，而對落葉松脂素的偏好性較低甚至無活性，這和其他植物來源的PLR 差異較大[10]。底物偏好性分析表明，擬南芥松脂素還原酶1(AtPrR1)可以利用(±)-松脂素為底物，AtPrR2只能利用(-)-松脂素。此外，來源于亞麻的轉錄因子LuWRKY36 通過其N 端的WRKY域和LuPLR1 啟動子的W 盒結合，上調LuPLR1 的表達[66]。

亞麻籽中的木脂素主要以糖基化形式存在，表明體內存在有關的酶負責SECO 的糖基化[67]。植物的糖基轉移酶是尿苷糖基轉移酶(UGT)，屬于家族1糖基轉移酶[68]。Barvkar 等[69]證明亞麻中存在137 種UGT，并認為UGT74S1 是催化種皮中SDG 合成的SECO 糖基轉移酶。Ghose 等[70]發現只有UGT74S1才能和UDP-葡萄糖反應合成開環異落葉松脂素單葡萄糖苷和SDG。Li等[71]從脫脂亞麻籽中分離和鑒定了可以在非嚴格厭氧條件下利用SDG 合成SECO的菌株，轉化效率超過80%。

3 木脂素類化合物的微生物法生產

微生物法生產植物天然產物具有很多優點，包括：(1)根據微生物細胞合成能力按需合成產品；(2)發酵工藝可以放大并且易于控制；(3)能合成比天然植物宿主純度和產量更高的植物天然產物及其中間代謝產物[3]。近年來，天然產物合成得到迅猛發展，比如利用釀酒酵母實現了大麻素和非天然結構類似物的從頭合成[72]，利用大腸桿菌成功合成紫杉醇前體紫杉二烯[73]和紫杉二烯氧化產物[74]。目前，松柏醇和松脂素的微生物法生產為復雜的木脂素化合物的生物合成奠定了良好的基礎。

3.1 木脂素前體物質合成的強化

松柏醇是一種天然的木質素單體，參與木質素、木脂素和黃酮木脂素的合成。松柏醇目前有兩種生產方式：化學合成法和微生物合成法。還原阿魏酸乙酯生產松柏醇是最常見的合成方式，這種方法原料和催化劑昂貴，反應條件苛刻，總收率低。此外，化學合成法還包括以阿魏酸、香草醛和乙酰阿魏酸為底物的合成方式，低產率和收率嚴重限制應用。

利用微生物法生產松柏醇反應條件溫和，合成產物的專一性高，具體方法包括酶法合成和從頭合成。Lv 等[4]以廉價的丁香酚為底物，在大腸桿菌體內表達簡青霉來源的香草醇氧化酶PsVAO 合成松柏醇。PsVAO 在催化過程釋放有害副產物H2O2，過量的H2O2積累會導致PsVAO 的活性受到抑制和細胞毒性。因為過氧化氫酶具備高過氧化氫酶活性和低過氧化物酶活性，所以選擇將不同來源的過氧化氫酶引入生物轉化系統。通過過氧化氫酶原位消除H2O2能解除H2O2對PsVAO 的限制、提高松柏醇產量和防止松柏醇過度氧化。最終，松柏醇的產量為22.9 g/L，轉化率為78.7%。Aschenbrenner 等[75]在大腸桿菌體內構建了木質素單體的合成路徑，加入2.5 mmol/L阿魏酸后，可以得到1.82 mmol/L松柏醇，遠高于其他肉桂酸衍生物的轉化效率。Chen 等[5]根據植物體內松柏醇合成路徑在大腸桿菌體內組合表達了TAL、4CL1、CCR 和ADH 實現對香豆醇的合成。然后，采用活性更高的HpaBC 替代植物來源的C3H 催化對香豆醇向咖啡醇的轉化。考慮到HpaBC 偏好以對香豆醇為底物，在發酵過程中優先積累對香豆醇。最終采用微生物共培養在大腸桿菌中重構松柏醇的從頭合成路徑，在2.5 L生物反應器上放大生產得到(124.9 ± 5.1) mg/L 松柏醇和(232.9±15.1)mg/L 咖啡醇。Yang 等[7]在釀酒酵母中從頭合成松柏醇時，選擇首先合成阿魏酸，通過將AtCOMT1、PaHpaB 和EcHpaC 整合到Ty4 位點后，再共表達At4CL5、AtCAD5 和AtCCR1，并結合NADPH的強化過表達zwf1和TYR1，松柏醇在搖瓶水平的積累量46.6 mg/L。在5 L 生物反應器中放大生產，釀酒酵母最終積累201.1 mg/L 松柏醇。酶法合成能夠獲得較高的松柏醇產量和底物轉化效率；從頭合成為工程菌株工業化生產提供了可能性。

圖5 亞麻木酚素和鬼臼毒素的生物合成路徑Fig.5 The biosynthetic pathway of secoisolariciresinol diglucoside and podophyllotoxin

在植物體內，兩分子松柏醇通過同化蛋白的催化生成松脂素。松柏醇的高效微生物合成為松脂素合成奠定了基礎。目前，松脂素的合成以酶法生產為主。酶催化中通過級聯反應實現產物的一步合成具有很多優勢，包括省時、省力、簡化多步反應，避免中間產物的分離和純化。Ricklefs 等[76]構建了香草醇氧化酶和漆酶偶聯的兩步一鍋法，利用丁香酚通過以松柏醇為中間產物合成松脂素。首先通過簡青霉來源的香草醇氧化酶PsVAO 和不同類型的細菌來源的漆酶共表達篩選最佳的合成松脂素的組合。再通過發酵條件的優化，松脂素最高產量達到1.6 g/L。在前期酶催化的基礎上，Ricklefs等[77]構建了三步一鍋法，利用全細胞催化合成了ee值高達98%的(+)-松脂素，通過表達金鐘連翹來源的松脂素/落葉松脂素還原酶(FiPLR)獲得了ee 值高達97%的(+)-松脂素。Lv 等[6]在體內構建了PsVAO和過氧化物酶共表達的體內H2O2自消除的松柏醇合成體系。為了平衡代謝流，PsVAO 和過氧化物酶采用不同的連接方式進行表達。通過發酵條件的優化，松脂素的產量達到11.29 g/L，轉化率為52.77%。在大腸桿菌中表達的過氧化物酶大部分屬于apo-蛋白，培養基中添加適量的5-氨基乙酰丙酸可以增加全蛋白的合成[78]。因此，增加大腸桿菌胞內血紅素合成可以提高過氧化物酶的活性。令人意外的是，在大腸桿菌體內表達不同拷貝數的hemA 和hemL 基因時，松脂素的產量均下降。利用過氧化物酶偶聯PsVAO 合成松脂素的過程還需要考慮從其他角度優化代謝過程，比如阻斷血紅素降解途徑[79]增加血紅素和過氧化物酶的結合，進一步提高丁香酚向松脂素的轉化效率。

3.2 芝麻素的酶法合成

木脂素化合物的合成主要通過植物提取法，微生物法生產鮮有報道。木脂素化合物的研究集中在木脂素化合物的衍生化、藥用價值和代謝路徑的解析。芝麻素及其衍生物的關鍵酶在釀酒酵母和大腸桿菌中的功能鑒定為木脂素的微生物法生產奠定了基礎。 Ono 等[8]在酵母INVsc 中表達CYP81Q1 后收集微粒體，并加入輔因子NADPH 和(+)-松脂素，反應結束后通過HPLC 檢測到(+)-胡椒醇和(+)-芝麻素的生成。Murata 等[58]從表達CYP92B14 和CPR1酵母細胞提取的微粒體，可以將芝麻素轉化為芝麻林素和芝麻素酚。通過比較發現，當CYP92B14 和CPR1 共表達時，催化活性會顯著提高；當CYP92B14 單獨表達時，只有微量的芝麻林素合成。以芝麻素為底物時，共表達CYP81Q1、CYP92B14和CPR1的酵母比單獨表達CYP92B14和CPR1 的細胞積累更多的芝麻林素和芝麻素酚，而且底物被完全消耗。另一方面，CYP81Q1 不能單獨作用于芝麻素，CYP92B14 不能單獨作用于松脂素和胡椒醇。CYP92B14和CYP81Q1在功能上的聯系說明功能互作的酶類存在新的結構和功能的關系。Chandra 等[80]在大腸桿菌中表達純化CYP81Q1 和CPR1 用于芝麻素的體外合成。在CPR1 存在的條件下，CYP81Q1 催化松脂素合成芝麻素的能力大幅度提升。考慮到PLR 或者是其他合成木脂素相關的細胞色素P450 基因屬于NADPH 依賴型，還需要進一步提高細胞內NADPH/NADP+的比例[81-83]，兼顧細胞生長和產物合成的平衡關系。此外，表達細胞色素P450 時還需要篩選合適的CPR 優化蛋白的表達水平[84]。

3.3 鬼臼毒素的微生物合成

目前，能用于植物法提取鬼臼毒素的植物種類稀少，包括桃兒七、足葉草的根莖。由于植物生長緩慢，而鬼臼毒素的需求量大，人們嘗試通過多種化學合成的方法生產鬼臼毒素。但是，化學合成法的產量低、成本高，不足以實現鬼臼毒素的商業化生產。鬼臼毒素的生物合成路徑未被完全解析，無法在微生物體內實現鬼臼毒素的異源合成。在植物體內，松脂素通過PLR 催化連續轉化為落葉松脂素和SECO，SECO 通過SDH 催化生成羅漢松脂素，羅漢松脂素經過一些尚未鑒定的步驟最終合成鬼臼毒素。Kuo 等[85]通過構建PLR 和SDH 的融合蛋白并在大腸桿菌中表達，以松脂素為底物合成羅漢松脂素(圖5)的轉化率能達到49.8%。從足葉草的根莖中分離出的內生真菌Phialocephala podophylli(菌株PPE7)在肉湯培養基中生長，能積累可檢測的鬼臼毒素。Arneaud 等[86]從PPE7基因組中克隆得到編碼SDH 的基因，在畢赤酵母(Pichia pastoris)體內成功實現SDH 的異源表達，并檢測到羅漢松脂素的生成。Marques 等[87]對桃兒七和足葉草進行了轉錄組測序和生物信息學分析，分別篩選到了負責催化pluviatolide 生成的CYP719A23 和CYP719A24。這種策略有利于鬼臼毒素后續反應的關鍵酶的鑒定，也為其他復雜木脂素化合物合成路徑的解析提供參考。

4 結論與展望

木脂素在植物界廣泛存在，在藥物和食物中應用較多，富含木脂素的食物可以降低患癌的風險。木脂素及其衍生物的有機合成已經引起了廣泛關注。遺憾的是，大部分木脂素的合成路徑解析尚未完成。例如，鬼臼毒素的合成路徑解析目前停留在(-)-pluviatolide。克隆和表征復雜木脂素的關鍵合成酶是實現微生物高效合成木脂素的基礎。目前，基因組測序發展到了納米孔測序，測序長度和速度進一步提升，為木脂素合成路徑的解析提供了更有力的支持。

利用酶法合成木脂素前體物的催化效率，能結合代謝工程和合成生物學的策略進一步實現優化。以廉價的丁香酚為底物，利用PsVAO 分別偶聯過氧化氫酶和過氧化物酶催化生成木脂素前體物松柏醇或松脂素產量已經達到較高水平，但是轉化效率依然受到限制。一方面，催化體系的酶活可能限制了丁香酚的轉化效率；另一方面，不同酶的表達強度的比例可能沒有達到最佳水平。松柏醇的從頭合成路徑需要篩選更加高效的甲基轉移酶，表達S-腺苷甲硫氨酸合成酶編碼基因metK 促進胞內甲基供體的合成來提高中間產物阿魏酸的合成速率。

通過大腸桿菌實現松脂素向羅漢松脂素在體內的生物轉化效率依然受到明顯的限制，還需要進一步優化代謝路徑，比如挖掘更高效的PLR 和SDH提高羅漢松脂素的產率，選擇合適的連接肽[88]優化PLR 和SDH 的表達水平。目前，基因片段的高效組裝[89]、模式微生物的啟動子文庫的構建和篩選[90-92]、高效的基因組編輯[93]和蛋白質的理性設計等為微生物細胞工廠的構建提供了優良的條件。木脂素合成代謝路徑的解析和微生物細胞工廠的優化，勢必為木脂素在微生物中的合成開啟新的時代。