凝血酶激活纖溶抑制物基因CPB2單核苷酸多態性與不明原因復發性流產的關聯探討

廣東省深圳市大鵬婦幼保健院（518120）胡春青 劉玉美 唐曉勇 雷永革

URSA是臨床婦產科較為常見的疾病，即指發生連續兩次及以上，無法找到明確原因的復發性流產[1]。近年來，隨著人們生活方式的改變，臨床中URSA發生率呈現逐漸升高趨勢，不僅對女性順利生育造成影響，且對社會、夫妻生活造成一系列問題。有文獻顯示，早期URSA發生中，TAFI水平表達異常；TAFI高水平表達，對降低URSA風險具有一定作用。鑒于此，本研究將100例URSA患者作為研究對象，對TAFI基因CPB2單核苷酸多態性進行分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2019年7月～2020年6月我院和深圳市光明區人民醫院婦產科收治的100例URSA患者作觀察對象，將其設為觀察組；所有患者均符合相關診斷標注，患者年齡18～40歲，平均（28.1±7.2）歲。篩選同期正常健康孕齡期女性200例，年齡19～39歲，設為對照組，平均年齡（27.5±6.8）歲，其中非孕100例、在孕100例。兩組婦女基本資料均衡可比（P＞0.05）。

1.2 方法 所有研究對象均于清晨空腹抽取外周靜脈血5ml，其中3ml于一次無抗凝劑的干燥管內于室溫靜置30min后，離心(3500r/min)5min，用作檢測血清中PAI-1水平。另外2ml靜脈血于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管內，混勻，用于PAI-1基因單核苷酸多態性分析。所有樣本均于-20℃保存備用，統一進行批檢。

儀器與試劑：AE275全自動酶標分析儀試劑購于上海太陽生物技術有限公司；DNA 提取試劑盒購于美國AXYGEN公司；ABI7500型實時定量突光聚合酶鏈式反應儀由美國ABI公司提供；基因SNP多態性分析試劑盒購自上海吉凱公司。

附表1 兩組CPB2 SNPs基因型與等位基因頻率分布

附表2 兩組CPB2 SNPs連鎖不平衡分析

附表3 兩組PAI-1基因4G/5G多態性分布

PAI-1水平檢測：采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清中PAI-1水平，操作均嚴格按試劑和儀器說明書進行，檢測前對儀器進行保養、校正，檢測時同時設計空白孔、陰陽孔及質控孔，待上述所有檢測孔的OD值均在參考有效范圍內才進行標本結果判讀，否則重新進行檢測。

PAI-1基因單核苷酸多態性分析[2]：（1）基因DNA提取：使用DNA提取試劑盒抽提標本中DNA；（2）PCR法目的片段擴增；（3）引物設計：參照文獻設計PCR引物序列（廣州金域檢測中心提供），PAI-1基因啟動子區引物序列：①4G上游引物：5′-GTCTGGACACGTGGGGA-3′；②5G上游引物：5′-GTCTGGACACGTGGGGG-3′；③陽性對照上游引物：5′-AGCTTTTACCATGGTAACCCC T G G T-3′；④共同下游引物：5′-CAGGTCACTGTGGAGTTATC-3′。4G和5G分別在2個反應體系中進行：一管加入引物①、③、④；另一管加入引物②、③、④。經PCR反應和瓊脂糖凝膠電泳。

結果判斷[3]：4G和5G的PCR產物長度均為135bp，陽性對照段PCR產物長為256bp，若只出現4G則為4G/4G基因型；只出現5G則為5G/5G基因型；4G和5G同時出現為4G/5G基因型。部分PAI-1基因單核苷酸多態性分析將送往廣州華銀檢驗中心進行檢測、確認分析。

1.3 統計學 將數據納入SPSS21.0統計軟件中進行分析，計數資料比較采用x2比較，以率（%）表示；計量資料比較采用t檢驗，以（±s）表示，若P＜0.05則表示差異顯著，有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組CPB2 SNPs基因型與等位基因頻率分布 研究顯示，rs1926447、Rs2277440、Rs9316179、Rs7337140、Rs3742264、Rs2296642等6個已知SNP點位在兩組中分布符合Hardy-Weinberg平衡，且呈現多態性（P＞0.05）。觀察組Rs9316179等位基因C、Rs7337140等位基因G、Rs3742264等位基因A、Rs2296642等位基因C頻率分布均低于對照組（P＜0.05）；經Bonferroni多重檢驗校正分析顯示，兩組婦女Rs9316179、Rs7337140基因型、等位基因頻率分布對比，有統計學意義（P＜0.05），詳見附表1。

2.2 分析GPB2 SNPs連鎖不平衡 研究顯示，觀察組婦女Rs3742264-rs9316179點位組合中GGTT頻率顯然高于對照組婦女，有統計學意義（P＜0.05），且經FDR、Bonfermni多重檢驗校正結果顯示P＜0.05，詳見附表2。

2.3 兩組PAI-1基因4G/5G多態性分布 研究顯示，觀察組URSA患者等位基因4G、基因型頻率4G/4G顯然高于對照組（P＜0.05）；與5G/5G基因型比較，URSA的發生與4G純合子婦女、攜帶4G等位基因婦女相關，OR為4.822、2.810。而同時兼有PAI-1基因4G/4G基因型患者，發生URSA風險更高（P＜0.01）（CI：2.294～7.366），詳見附表3。

3 討論

URSA是臨床婦產科常見疾病，其病因復雜，目前尚不完全清楚，大部分學者認為與男性精液異常、內分泌失調、感染性疾病、解剖學結構畸形、遺傳異常等存在相關性。一般而言，健康女性妊娠期機體中纖維蛋白溶解酶、抗凝物質水平下降，促凝血因子水平呈現升高，機體血液呈現高凝狀態，極大增加妊娠期高危并發癥風險；且孕婦長期處于這種狀態，可造成外周凝血功能異常，胎盤微血管血栓風險增高，對胎兒血供、胎盤血供造成影響，增加流產發生率[4]。

目前，已有研究認為，在局部凝血-纖溶系統中TAFI對精確調控起到重要作用。TAFI介導的蛋白C介導凝血抑制與纖溶抑制，在血栓調節蛋白作用下，可對機體凝血功能進行精確調控，同時對血栓引起的下游炎癥反應起到共同抑制效果，同時，TAFI不影響血栓外正常凝血功能，僅對局部纖溶抑制進行調控。目前，已有較多研究證實，CPB2基因多態性點位與突變點位與TAFI相關[5]。

本研究經Bonferroni多重檢驗校正分析顯示，兩組婦女Rs9316179、Rs7337140基因型、等位基因頻率分布對比P＜0.05，與URSA發生呈現負相關。觀察組婦女Rs3742264-rs9316179點位組合中GGTT頻率顯然高于對照組婦女（P＜0.05），且經FDR、Bonfermni多重檢驗校正結果顯示P＜0.05，因此，本研究認為，rs9316179不具有臨床效應，在兩組rs9316179分布差異中由強連鎖導致。

PAI-1具有防止血栓形成的功能，被認為是纖溶酶原激活物主要抑制因子。當該基因點位突變是纖溶酶原激活物（PA）與PAI動態平衡被打破，PA與PAI-1結合，形成一種無活性、穩定的復合物，增加血栓形成風險[6]。有研究認為，PAI-1基因轉錄與PAI-1基因啟動區域4G等位基因相關，有助于促進該基因表達[7]?；颊唧w內PAI-1水平中，5G/5G型體內PAI-1濃度最低、4G5G雜合子基因攜帶者次之、4G4G純合子基因攜帶者濃度最高[8]。

本研究顯示，URSA患者等位基因4G、基因型頻率4G/4G顯然高于對照組（P＜0.05）；與5G/5G基因型比較，URSA的發生與4G純合子婦女、攜帶4G等位基因婦女相關，OR為4.822、2.810。而同時兼有PAI-1基因4G/4G基因型患者，發生URSA風險更高（P＜0.01）（CI：2.294～7.366）。

綜合以上，URSA婦女中普遍存在CPB2基因遺傳易感，PAgT（ADP）水平在rs3742264基因型間存在差異，rs3742264等位基因A是URSA保護等位基因，對婦女妊娠具有積極作用；PAI-1基因4G/5G多態性與URSA發生存在密切相關性。