Müller細胞與視網膜神經再生研究進展

賈茜鈺，藍詩翰，單 亭，葉河江，陳 婕

0引言

視網膜退行性病變(retinal degenerative，RD)是我國及發達國家嚴重影響視力甚至導致失明的一類疾病，如青光眼、視網膜色素變性、視網膜脫離、年齡相關性黃斑變性等，其主要病理過程為視網膜神經元凋亡。視網膜病變過程中會出現一系列神經元和神經膠質細胞的重塑改變[1]，Müller細胞(Müller glial cells，MGCs)是貫穿視網膜全層的主要神經膠質細胞，Müller細胞的神經源潛能可通過其靶向特異性激活相應信號通路，啟動膠質反應去分化為神經元，目前RD研究更注重減緩神經元凋亡進程，而忽視了Müller細胞對神經再生的調控作用，故本文以Müller細胞與神經再生研究進行綜述。

1 Müller細胞簡介

Müller細胞是一種特殊的膠質細胞，其功能多樣性和獨特的徑向形態使其成為視網膜神經元再生治療的靶點。Müller細胞穿過所有的視網膜層長度(Lc)約為250μm，其胞體耦合神經細胞突觸，監測視網膜穩態[2]。Müller細胞具有一系列重要功能：(1)負責視網膜光傳導：Müller細胞作為視網膜上活光纖來收集入射光，引導光線穿過視網膜組織走向最外層的光感受器；(2)參與視網膜發色團再循環：Müller細胞轉化11順式視黃醛后，發色團返至視錐細胞上，重新開始視覺周期[3]；(3)參與建立血-視網膜屏障(BRB)：Müller細胞可通過分泌相關因子增加內皮屏障致密性從而增強視網膜內外屏障功能，對視網膜免疫至關重要；(4)保護視網膜神經元免受興奮性毒性影響：當氧化應激發生時，Müller細胞釋放谷胱甘肽，使谷氨酸轉化為無毒的谷氨酰胺，中和活性氧(ROS)以防神經元受興奮性毒性影響[4-6]；(5)離子緩沖及水通道調節：Müller細胞表達多種電壓門控離子通道和多種神經遞質受體[7]。神經元活動期間，神經元釋放鉀離子(K+)，Müller細胞通過主動或被動轉運吸收K+，并且將多余的K+重新分配到神經視網膜外—玻璃體液、視網膜下腔及血液中，緩沖K+不平衡[8]，鉀離子通道和Müller細胞水通道蛋白4共同調控來保持視網膜水穩態；(6)Müller細胞向神經元提供葡萄糖：Müller細胞為視網膜神經元節省氧氣，通過厭氧降解自身葡萄糖，產生大量乳酸，而被光感受器優先吸收[9]。此外，Müller細胞可以產生神經營養因子和保護因子，如血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、膠質細胞神經營養因子(GDNF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)等，以上因子通過自分泌和旁分泌方式激活相應靶向信號通路，誘導Müller細胞重編程、增殖，與視網膜微循環、神經再生關聯緊密[3]。

2 Müller細胞調節視網膜神經再生的因素

2.1視網膜神經再生過程視網膜損傷和疾病導致神經元變性凋亡時，受損區域丟失的神經元不會自發替換，細胞凋亡最終導致視力喪失。斑馬魚的Müller細胞對視網膜損傷的反應是啟動膠質反應去分化，其特征是細胞肥大和增加膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達，使駐留在內核層的Müller細胞在損傷后增殖，進行運動間核遷移，不對稱分裂致多能祖細胞形成，隨后遷移到丟失的光感受器神經元空白處，迅速增殖，表明Müller細胞是再生神經元祖細胞的替代來源，具有視網膜內源性干細胞的特性[10](圖1[3])。近年來研究證明，除魚類外，鳥類、脊椎動物及人類的Müller細胞也會采取干細胞樣狀態，產生視網膜神經元[11-13]。研究表明，Müller細胞可定向分化為視桿細胞[14]，影響視網膜光感受器功能進而調控神經元重塑[15]，并且Müller細胞中的免疫球蛋白樣受體B影響視網膜神經再生[16]，表明Müller細胞作為視網膜神經元替代治療的內源性種子細胞，在視網膜神經再生過程中起到重要作用[17-18]。

2.2 Müller細胞特異性靶向Müller細胞是與各級神經元保持功能緊密聯系的重要膠質細胞，為神經元靶向提供營養支持。裴雪婷等[19]研究表明直接作用于Müller細胞的中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(MANF)通過調控p44/42MAPK信號通路對神經元具有保護作用。李宗義等[20]通過構建Müller細胞結合人源促紅細胞生成素穩轉株可減慢神經元損傷進程，說明Müller細胞可作為治療視網膜神經變性的靶向細胞。研究發現在視黃醛結合蛋白1基因的部分調控區域進行條件性Müller細胞消融的轉基因模型小鼠中，調控Müller細胞的睫狀神經營養因子(CNTF)可減少光感受器細胞凋亡[21]。Müller細胞作為CNTF反應性細胞類型在視網膜退行性病變神經元保護中占重要地位[22]。除此之外，在神經再生基因治療及病毒轉染治療中Müller細胞特異性靶向可有效降低視網膜其他類型細胞對載體或藥物的無效攝取，間接對神經元細胞起到支撐作用[23]。視網膜下通過轉導作用于Müller細胞慢病毒載體更易于轉染光感受器細胞和色素上皮細胞[24]，有效的Müller細胞轉基因表達可以通過神經膠質特異性啟動子來驅動，如GFAP、波形蛋白、分化簇44(CD44)，研究表明含有膠質細胞特異性啟動子的慢病毒載體可在Müller細胞中有效轉導并指導持續的轉基因表達。外源性干細胞移植促進Müller細胞增殖重編程可用于視網膜神經再生的實驗治療[25]。

圖1 Müller細胞與視網膜神經再生示意圖。

2.3 Müller細胞神經源潛能—視網膜神經再生關鍵因素Müller細胞可作為神經元再生潛能靶細胞主要是由于Müller細胞與祖細胞存在重疊的再生基因。Yu等[26]研究證明電刺激通過調控bFGF途徑觸發遺傳性視網膜色素變性小鼠模型Müller細胞重新進入細胞周期動員內源性祖細胞逆轉光感受器細胞，產生新的光感受器細胞。Conedera等[27]實驗運用局灶性二極管激光器損傷斑馬魚視網膜，造模后Müller細胞表達GFAP，磷酸化p44/42MAPK(Erk1/2)和增殖細胞核抗原(PCNA)上調。王芳等[28]建立N-甲基-N-亞硝脲(MNU)感光細胞凋亡模型發現造模2d后Müller細胞開始分泌神經干細胞相關因子，繼而增殖去分化展現干細胞特征。董曉飛等[29]將N-甲基-d-天門冬氨酸(NMDA)神經毒素混合液注射于實驗大鼠玻璃體腔，分離Müller細胞進行體外培養后移植入自發性遺傳性視網膜變性大鼠視網膜下腔，結果顯示神經干細胞占總細胞量比重過半，誘導產生神經干細胞特性，Müller細胞可以有效延緩模型大鼠視網膜光感受器細胞變性。Ooto等[30]研究發現NMDA誘導視網膜神經節細胞(RGCs)損傷可引起Müller細胞增殖，并產生具有神經元細胞分化標志物的新細胞。外源性晶狀體伴視神經損傷，可誘導Müller細胞活化，對視神經損傷后RGCs具有保護作用[31]。

3調控Müller細胞增殖分化相關通路及因子

Müller細胞是視網膜受損后神經細胞再生的主要來源，其可通過信號級聯重新編程獲得視網膜干細胞特性，去分化增殖為視網膜前體細胞。參與Müller細胞增殖和分化的信號通路主要有Wnt/Gsk3β/β-catenin信號通路、MAPK-Erk信號通路、JAK/STAT3信號通路、Notch信號通路等。

3.1 Wnt/Gsk3β/β-catenin信號通路β-連環蛋白(β-catenin)是一種多功能蛋白，與T細胞因子、淋巴蛋白增強因子家族成員協作，將細胞表面Wnt和鈣黏蛋白與基因表達聯系起來，Wnt蛋白分泌脂質修飾糖蛋白，結合Frizzed家族受體調節β-catenin穩定，糖原合酶激酶3β(Gsk3β)則通過磷酸化調節β-catenin穩定。研究表明，抑制Wnt表達可抑制損傷視網膜的祖細胞形成，此外Gsk3β抑制劑在斑馬魚視網膜再生研究中通過β-catenin信號通路激活Müller細胞重編程和祖細胞形成[32-33]。Yao等[34]實驗表明β-catenin的基因轉移可刺激Müller細胞增殖，繼β-catenin基因轉移后，細胞周期激活Müller細胞重新編程產生光感受器細胞。

3.2 MAPK-Erk信號通路在視網膜損傷研究中，Müller細胞衍生祖細胞的產生是由表皮生長因子(EGF)和MAPK-Erk信號通路所介導，作用可能是EGF和成纖維細胞生長因子(FGF)受體通過絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)和細胞外信號調節激酶(Erk)調節衍生祖細胞功能[35]。

3.3 JAK/STAT3信號通路JAK非受體酪氨酸激酶，通過介導細胞因子磷酸化STAT3，誘導Müller細胞重編程和視網膜再生；JAK/STAT3信號通路在膠質細胞的發育和神經損傷后胚胎干細胞自我更新能力的維持過程中作用明顯。近年研究發現Müller細胞中STAT3的表達在視網膜損傷后增強，激活的Müller細胞以及增殖的前體細胞高表達，使用JAK/STAT3信號通路抑制劑可抑制hbegfa、Ascl1a、lin-28等再生相關基因表達，并減弱視網膜再生，由此可見JAK/STAT3信號通路在Müller細胞重編程和視網膜再生中起著關鍵作用[36-37]。

3.4 Notch信號通路Notch信號可調節神經元生長，與神經元受損后的修復及再生密切相關[38]。研究發現Notch信號通路在斑馬魚視網膜再生過程中起抑制作用，在視網膜受損魚類中Müller細胞數量減少；在雞視網膜病變中Notch信號起促增殖作用，表明Notch信號通路與反應的Müller細胞數量和視網膜損傷的程度相關，Notch通路既可以抑制又可以促進Müller細胞增殖，且對于抑制干細胞的分化發揮了重要作用[39]。

3.5其他相關因子斑馬魚視網膜再生相關轉錄組分析表明視網膜損傷后斑馬魚快速誘導轉錄因子和生長因子，如hbegfa和腫瘤壞死因子α(TNFα)[40]，它們由Müller細胞表達，以自分泌、旁分泌的方式刺激祖細胞形成和增殖，損傷誘導Ascl1a基因表達導致細胞分化，激活促增殖程序。Ascl1a刺激lin-28基因表達，通過調節Wnt信號影響Müller細胞重編程和增殖。Ascl1a亦可調節胰島素樣相關因子表達，影響Müller細胞重編程和祖細胞周期退出，在輕度損傷的斑馬魚視網膜中，STAT3基因的表達可能先于Ascl1a[41]，而損傷依賴性Ascl1a的表達僅限于重編程的Müller細胞衍生的祖細胞[42]。近期實驗研究表明，在NMDA小鼠模型中Ascl1強表達可誘導Müller細胞的神經源性狀態，但在出生后第16d，Ascl1過表達，Müller細胞失去神經源性能力，成熟Müller細胞神經源性能力的喪失伴隨著染色質可及性的降低，說明表觀遺傳因素限制了再生[43]。但運用組蛋白脫乙?；敢种苿┛烧T導成年小鼠視網膜損傷后Müller細胞產生神經元。離體Müller細胞研究表明Müller細胞在48h內上調細胞周期調節因子，表達神經源性因子Ascl1、Pax6和Vsx2，且高達60%的細胞重新進入細胞周期，Müller細胞后代亞群開始表達轉錄因子和神經元標志物，而不是神經膠質標志物，此過程表明神經再生[44]。除此之外，表皮細胞生長因子(HB-EGF)、成纖維細胞生長因子2(FGF2)、谷氨酸鹽及其擬似物α-Aminadipate等因子與Müller細胞轉化為視網膜神經元相關[39]。MicroRNA驅動基因調控機制可促進發育過程中從視網膜祖細胞獲取Müller細胞譜系過程，誘導其對視網膜變性的響應以及Müller細胞增殖分化[45]。另有研究表明，ARS2-FLASH介導的組蛋白mRNA可調節視網膜祖細胞周期和神經膠質細胞命運，影響Müller細胞和感光細胞分化改變[46]。

4總結和展望

視網膜神經再生是復雜的過程，基于Müller細胞特性研究神經保護機制及對神經元再生的調控作用，對實現神經再生和視覺重建精準靶向治療具有重要指導意義。近年視網膜神經再生研究具有顯著進步，已證明Müller細胞可作為視網膜神經再生關鍵靶點，但仍有些問題亟待研究。人類視網膜神經再生機制如何？免疫性方面Müller細胞的異質性如何？如何有效激活Müller細胞神經源啟動膠質反應去分化為神經元？有待進一步研究，理清這些問題，將為視網膜退行性病變的治療提供新思路。