基于UPLC-Q-TOF-MS技術的芪風固表顆粒血清藥物化學研究

鄭單單，魏文峰，霍金海，王偉明

黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036

芪風固表顆粒是黑龍江省中醫(yī)藥科學院自主研發(fā)的中藥新藥（發(fā)明專利號：CN1325098C，批準文號：國藥準字B20020410），該藥由黃芪、麥冬、防風、刺五加、炒白術、五味子6 味中藥組成，具有益肺、健脾、補腎、益衛(wèi)固表、補氣生津的功效，是治療表虛不固易感病癥有效方劑。文獻報道表明，芪風固表顆粒能止咳化痰，延長咳嗽潛伏期，又能緩解氣管炎癥，抑制肺組織病變，改善和治療支氣管炎和肺炎，減少肺部炎癥發(fā)作，能調節(jié)免疫功能，使機體免疫系統(tǒng)恢復到平衡狀態(tài)[1-4]。芪風固表顆粒的藥理作用已有初步研究，然而其藥效物質基礎尚未完全闡明。

中藥方劑成分復雜，口服給藥后，有效成分被直接吸收入血，或轉化為代謝產物被吸收入血。通過中藥血清藥物化學研究可以確立中藥中的有效成分，以此為指標建立定性、定量方法，從而使中藥及中藥復方質量標準化[5]。本研究利用中藥血清藥物化學方法初步研究芪風固表顆粒的入血成分，旨在明確其藥效物質基礎，進一步鎖定建立芪風固表顆粒質量標準化相關指標。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITYTMUPLC 液相色譜儀（美國Waters 公司）；AB Sciex 5600+型質譜儀、Analyst TF1.6 工作站（美國Sciex 公司）；PeakView 2.0 軟件、Metabolite pilot 2.0.2 軟件（美國Sciex 公司）；IKAMS3 digital 渦旋振蕩器（廣州儀科實驗室技術有限公司）；ST16R 型低溫高速離心機（美國Thermofisher Scientific 公司）；MTN-2800W 氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品

黃芪（批號20180909）、防風（批號DC1111）、麩炒白術（批號180602）、麥冬（批號180501）、五味子（批號20180325）、刺五加（批號20171121）以上6 味飲片均購于北京同仁堂（亳州）飲片有限責任公司，經黑龍江省中醫(yī)藥科學院霍金海副研究員鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 的干燥根；防風為傘形科植物防風Saposhnikovia di varicate(Turcz.) Schischk.的干燥根；麩炒白術為菊科植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖蜜制麩皮炒制品；麥冬為百合科植物麥冬Ophiopogon j aponicus(L.f)Ker-GawL 的干燥塊根；五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實；刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanax s enticosus(Rupr.et Maxim.) Harms 的干燥根和根莖或莖。

對照品升麻素苷（批號S-004-150421）、升麻素（批號 S-007-170426）、魯斯可皂苷元（批號L-009-171026）、芒柄花素（批號C-018-140128）均購于成都瑞芬思生物科技有限公司，質量分數＞98%。刺五加按《中國藥典》2015年版“刺五加水浸膏制備方法”制成刺五加浸膏。甲醇和乙腈（色譜級，Merck 公司）；甲酸（色譜級，F(xiàn)isher 公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 實驗動物

健康SD 雄性大鼠，體質量（240±20）g，SPF級，許可證號SCXK（黑）2019-001，由哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心提供。該實驗由黑龍江省中醫(yī)藥科學院動物倫理委員會批準，批準號：201903001。

2 實驗方法

2.1 芪風固表顆粒供試品的制備

按照2020 版《中國藥典》[6]規(guī)定，取黃芪3000 g、白術（炒）1000 g、五味子500 g，防風1000 g、麥冬1000 g，加水煎煮2 次，煮沸起開始計時，每次1 h，合并煎液，離心，濾過，靜置24 h，傾取上清液，加入刺五加浸膏75 g，濃縮至相對密度1.20～1.22（60 ℃）的清膏，趁熱加入糊精適量，混勻，60 ℃干燥，粉碎成細粉，加乙醇適量制粒，干燥。按《標準》的1/20 用藥量以上述方法，制備芪風固表顆粒供試品。

2.2 供試品溶液的制備

取供試品芪風固表顆粒粉末約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇水30 mL，密塞，稱定重量，超聲處理50 min，放冷至室溫，用50%甲醇水補足減失的質量后搖勻，5000 r/min 離心10 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.3 藥液的制備

取芪風固表顆粒供試品，加適量蒸餾水超聲溶解，配制成質量濃度1.08 g/mL 的芪風固表顆粒大鼠ig 藥液，儲存至4 ℃冰箱中，備用。

2.4 體內分析樣品的制備

取SD 大鼠，禁食12 h（自由飲水），給藥組按照9.0 g/kg（相當于人體臨床每日10 倍劑量）ig 給予芪風固表顆粒ig 藥液，空白組按照20.0 mL/kg ig給予蒸餾水。給藥1 h 后，ip 10%水合氯醛進行麻醉，腹主動脈取血，3000 r/min 離心10 min，取上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

取大鼠空白血清及給藥血清各1.2 mL，各加4.8 mL 甲醇，3000 r/min 渦旋震蕩90 s，4 ℃、13 000 r/min 離心10 min，取上清液，氮氣揮干，殘渣用150 μL 70%甲醇復溶，3000 r/min 渦旋震蕩90 s，4 ℃、13 000 r/min 離心10 min，取上清液，進樣3 μL 供UPLC-Q-TOF-MS 分析。

2.5 質譜條件

電噴霧正、負離子模式，正、負離子源電壓分別為5500 V、-4500 V，離子源溫度為550 ℃，霧化氣體為N2，霧化氣、輔助氣壓力均為379.2 kPa，氣簾氣壓力為241.3 kPa，裂解電壓為±80 V，碰撞能量為±35 eV，碰撞能量擴展均為15 eV。TOF/MS 掃描范圍為m/z100～1500，IDA 設置響應值超過100 cps的8個最高峰進行二級質譜掃描，Product Ion 掃描范圍為m/z50～1500，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。數據采集所用軟件為Analyst TF 1.6 software，數據處理軟件為Peakview 2.0-masterview 1.0。

2.6 色譜條件

Waters ACQUITYTMUPLC 液相色譜儀；ACQUITYTMBEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；ACQUITYTMUPLC BEH C18預柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；流動相0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；梯度洗脫：0→15 min，95%→50% A；15→18 min，50%→0 A；18→18.1 min，0→95% A；18.1→20 min，95% A。體積流量0.3 mL/min；樣品倉溫度4 ℃；進樣量8 μL；色譜儀流出液不分流直接進行正、負離子掃描檢測。

2.7 數據分析方法

利用Peakview 軟件通過對比給藥后血清和空白血清的質譜圖，扣除血清中的內源性成分，將剩余離子峰與體外藥材提取液離子峰的保留時間、質荷比及二級質譜圖進行對比，如果一致則確認為芪風固表顆粒中的原型成分；利用MetabolitePilot 數據處理軟件，導入化合物信息建立 Compound library，設置Biotransformation parameters，選擇I和II 相代謝途徑，設置Processing parameter，將空白血清及給藥血清樣品導入，篩選代謝產物，根據軟件數據結果和參考文獻資料推測其代謝產物。

圖1 正離子和負離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion current chormatograms in positive and negative ion mode

3 結果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS 色譜圖的采集

依據“2.5”項質譜條件及“2.6”項色譜條件分析樣本，在正、負離子模式下采集以上樣品的色譜圖，見圖1。

3.2 入血成分分析

本課題組前期已經應用UPLC-Q-TOF-MS 技術對芪風固表顆粒的化學成分進行了分析，在分析過程中根據精確相對分子質量、同位素豐度比、分子碎片峰，參考相關文獻、對照品色譜保留時間及二級譜圖，共推斷了110 個化合物，其中22 個來自黃芪，13 個來自防風，6 個來自白術，10 個來自麥冬，21 個來自五味子，14 個來自刺五加。本實驗在此基礎上根據“2.7”項下方法，結合以往文獻報道[7-11]，并參照對照品二級色譜圖，鑒定了大鼠口服芪風固表顆粒后血清中的37 個入血成分，其中17 個為原型成分，20 個為代謝產物，并對其來源進行了歸屬，結果見表1。

3.3 主要色譜峰的質譜分析

3.3.1 原型成分 共鑒定和表征出17 個原型成分，分別以化合物3、9 為例說明推測過程。

化合物3：正離子模式下，其在含藥血清總離子圖與芪風固表顆粒總離子流圖中升麻素的保留時間基本一致，二級質譜碎片一致，準分子離子峰m/z307 [M＋H]＋相對豐度最強，擁有共同二級碎片m/z289、259、235 等，見圖2，參考文獻報道[7]，對比升麻素對照品的二級質譜圖，故推測其結構為升麻素，可能的裂解途徑見圖3。

化合物9：正離子模式下，其與芪風固表顆粒總離子流圖中魯斯可皂苷元的保留時間基本一致，二級質譜碎片一致，準分子離子峰m/z431 [M＋H]+相對豐度較強，擁有共同二級碎片m/z395、269 等，見圖4，參考文獻報道[8]，對比魯斯可皂苷元對照品的二級質譜圖，故推測其結構為魯斯可皂苷元，可能的裂解途徑見圖5。

表1 芪風固表顆粒入血成分分析結果Table 1 Chemical composition analysis results of Qifeng Gubiao Granules

續(xù)表1

續(xù)表1

圖2 升麻素正離子模式下的MS/MS 質譜圖Fig.2 MS/MS mass spectrum of atractylodin in a positive mode

3.3.2 代謝產物 根據“2.7”項下方法結合Metabolite Pilot 代謝物數據處理軟件給出的代謝物最優(yōu)化峰匹配，最終推測20 個代謝產物，以化合物27、36 為例說明鑒定過程。

圖3 推測的升麻素裂解途徑Fig.3 Speculative cleavage pathway of atractylodin

圖4 魯斯可皂苷元正離子模式下的MS/MS 質譜圖Fig.4 MS/MS mass spectrum of ruscogen in positive mode

圖5 推測的魯斯可皂苷元裂解途徑Fig.5 Speculative cleavage pathway of ruscogen

化合物27：刺五加中的刺五加苷類成分是其主要活性部位，紫丁香苷是主要成分之一。紫丁香苷是苯丙醇的苷類化合物，該化合物在體內發(fā)生I 相水解反應，失去脫氧葡萄糖水解為苷元，其苷元脫氧后苯環(huán)上的羥基發(fā)生硫酸酯化，形成硫酸酯化代謝產物。代謝物在負離子模式下，準分子離子峰m/z273 [M－H]-，比紫丁香苷準分子離子峰m/z371 [MH]-少98，提示其失去脫氧葡萄糖脫氧后硫酸酯化，結合碎片m/z191、153 等，與紫丁香苷二級碎片比較，符合其裂解過程，結合文獻報道[9]，紫丁香苷苷元苯環(huán)上的羥基可能發(fā)生硫酸酯化。紫丁香苷失去脫氧葡萄糖脫氧后硫酸酯化產物和紫丁香苷在負離子模式下的質譜匹配度見圖6，可能的裂解途徑見圖7。

化合物36：芒柄花素是來自黃芪的黃酮類化合物，易發(fā)生II 相代謝反應，A 環(huán)7 位羥基發(fā)生葡萄糖醛酸化，生成芒柄花素葡萄糖醛酸化產物。該產物在負離子模式下，準分子離子峰m/z443 [MH]-，比異微凸劍葉莎醇準分子離子峰m/z301 [MH]-多142，表明化合物發(fā)生葡萄糖醛酸化，結合其特征碎片m/z267、251、223 等，與芒柄花素二級碎片比較，符合其葡萄糖醛酸化過程，參考文獻報道[10-11]，芒柄花素A 環(huán)7 位羥基易發(fā)生葡萄糖醛酸化，同時芒柄花苷在大鼠體內發(fā)生I 相代謝水解后，生成芒柄花素，亦可能有相同代謝產物。芒柄花素葡萄糖醛酸化產物和芒柄花素在負離子模式下的質譜匹配度見圖8，推測的裂解途徑見圖9。

圖6 紫丁香苷失去脫氧葡萄糖脫氧后硫酸酯化產物和紫丁香苷負離子模式下的質譜圖Fig.6 Mass spectra of sulphate conjugation after lost deoxyglucose and oxygen of syringin in negative mode

圖7 推測的紫丁香苷失去脫氧葡萄糖脫氧后硫酸酯化產物裂解途徑Fig.7 Speculative cleavage pathway of sulphate conjugation after lost deoxyglucose and oxygen of syringin

圖8 芒柄花素葡萄糖醛酸化產物和芒柄花素在負離子模式下的質譜圖Fig.8 Mass spectra of glucuronidation of formononetin in negative mode

圖9 推測的芒柄花素葡萄糖醛酸化產物裂解途徑Fig.9 Speculative cleavage pathway of glucuronidation of formononetin

4 討論

本實驗在取血方式上，選取腹主動脈取血，腹主動脈取血的取血量較大，更適合用于后續(xù)的樣品制備。在樣品處理方法上，比較了甲醇沉淀法、固定相萃取-甲醇洗脫法2 種血清處理方法，結果顯示，甲醇沉淀法檢測到的血中移行成分較多，故選擇甲醇沉淀法作為血清最佳處理方法。在釆血時間上考察了0、0.5、1、2、4、8、12、24 h 共8 個不同時間點，結果在給藥1 h 后采血所檢測的色譜峰數目最多、響應值最強，故選擇給藥1 h 后采血為最佳采血時間點。

在大鼠ig 芪風固表顆粒ig 藥液后的含藥血清中共鑒定出37 個入血成分，包括17 個原型成分，20 個代謝產物。其中來自黃芪的多為黃酮類成分，黃芪中的芒柄花素及其苷類、毛蕊異黃酮及其苷類等黃酮類成分，能抗病毒[12]，改善肺纖維化肺功能[13]，還能通過降低模型動物的脾細胞輔助T 細胞1/輔助T 細胞2（T helper 1 cell/T helper 2 cell，Th1/Th2)和高細胞增殖活性等改善其機體免疫功能失調，又能增強機體的耐力[14]。防風的主要成分升麻素等色原酮及其苷類，具有解熱抗炎[15]作用。刺五加中的紫丁香苷等刺五加苷類[16]及有機酸類等成分，可能具有抗疲勞[17]，調節(jié)免疫功能等多重作用。五味子具有免疫調節(jié)作用[18]。麥冬中的主要皂苷元魯斯可皂苷元具有抗炎作用，馬麗等[19]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，魯斯可皂苷元可顯著抑制細胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導的急髓白血病HL-60 細胞與人臍靜脈內皮ECV304 細胞之間的黏附作用，從而發(fā)揮抗炎活性。結合各味藥傳統(tǒng)功效及現(xiàn)代藥理學研究，初步可以推斷，本次實驗分析所得入血的37 種成分可能為其體內發(fā)揮作用的藥效物質基礎。

實驗中運用中藥血清藥物化學方法及UPLC-Q-TOF-MS 技術，簡單、快捷分析了中藥復方芪風固表顆粒中的入血成分，初步探究了該方的藥效物質基礎，進一步鎖定其質量控制指標性成分，為其質量標準的提升研究提供依據，為傳統(tǒng)品種的二次開發(fā)提供了良好的參考依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突