氨基酸轉化三七花中稀有人參皂苷及提取液對脂多糖誘導的RAW264.7細胞活性的影響

邵紫君，李志滿，于鵬程，陳建波，李珊珊，孫印石*

1.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130033

2.中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112

三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen 為五加科人參屬植物，已有600年以上的藥用歷史，是我國名貴中藥材。由于療效確切、效果顯著，近些年來三七的應用越來越廣泛，受到不少重視養生、健身人士的追捧。但遺憾的是三七一直未能進入“藥食同源”目錄，三七產業發展遭遇了政策瓶頸。《中國藥典》規定三七的藥用部位為根和根莖[1]，三七花（Panax notoginsengflower）作為三七的副產物，一直未能得到有效的開發與利用。可喜的是在2016年云南省衛生和計劃生育委員會正式批準三七花可以按照當地特有的食品原料進行管理，標志著三七花正式進入食品行業[2]。三七花中含有人參皂苷、維生素、氨基酸等多種營養成分，其中人參皂苷是三七花中的主要有效成分[3-6]。根據結構不同，人參皂苷可分為達瑪烷型和齊墩果酸型。其中，達瑪烷型中四環三萜類人參皂苷分為原人參二醇型皂苷［如人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd（Rb1、Rb2、Rc、Rd）］和原人參三醇型皂苷［如人參皂苷Re、Rg1（Re、Rg1）］[7]。此外，還有一些次級人參皂苷，它們在原材料中含量很低，如人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5［20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5］等這些人參皂苷可以經過一定的加工獲得，它們被稱為稀有人參皂苷[8]。現有研究表明，稀有人參皂苷對一些疾病有顯著的療效，如對抑郁癥、糖尿病和炎癥疾病具有良好的藥理作用[9]，對肝癌、肺癌、胃癌等癌細胞的凋亡有顯著的影響[10]。隨著科學研究的深入，市場對稀有人參皂苷的需求正在增加，所以探尋一種高效綠色的稀有人參皂苷富集方法至關重要。

稀有人參皂苷可以通過蒸煮[11]、酸水解[12]、微生物降解和金屬離子催化[13-15]等手段來進行富集。但這些方法既復雜又耗時，并對外源添加物的專屬性和反應條件要求較高，容易造成環境污染。據報道，天冬氨酸可通過降解原人參二醇組總皂苷來獲得稀有人參皂苷[16]。但這種轉化技術對原材料要求較高，轉化方法復雜、成本高，不適用于工業化生產。而三七花中皂苷含量豐富，位居三七各部位首位[17-18]，但關于三七花中稀有人參皂苷的轉化未見報道。本實驗研究了氨基酸種類、氨基酸濃度、反應溫度、反應時間和液固比對三七花中稀有人參皂苷轉化的影響。并進一步比較了轉化前、后三七花提取物對脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7 細胞抗炎活性的影響，以期為三七花的開發利用提供新的思路。

1 材料

1.1 材料和試劑

三七花，購自云南省文山市三七藥業批發行，經吉林農業大學李偉教授鑒定為五加科人參屬植物三七P.notoginseng(Burk.) F.H.Chen 的干燥花（4年生）；RAW264.7 小鼠巨噬細胞，由中國醫學科學院細胞中心提供；對照品精氨酸（Arg，批號1008J033）、組氨酸（His，批號816L031）、天冬氨酸（Asp，批號1784M052）、谷氨酸（Glu，批號1005L047）和賴氨酸（Lys，批號2395H145），北京索萊寶科技有限公司；對照品人參皂苷20(S)-Rg3（批號Z15D8X50607 ）、 20(R)-Rg3（批號YA0417YA14）、Rk1（批號P20N6F6254）、Rg5（批號P26N7F25707）、Rg1（批號Z13O8L45576）、Re（批號H15M6X1）、Rb1（批號Z16J9X52719)、Rb2（批號P25D8F51140）、Rc（批號Z10J6B1）、Rd（批號Z13O8L45576）、LPS（批號S18A9168132），質量分數均≥98%，上海源葉生物科技有限公司；乙腈和甲醇，色譜純，美國Fisher 公司；DMEM 培養基、胎牛血清和PBS，Gibco 公司；CCK-8，日本同仁有限公司；NO 試劑盒，碧云天試劑公司；IL-6 ELISA 試劑盒，愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BioTek Epoch2 酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；Acquity UPLC H-Class 超高效液相色譜儀，PDA檢測器，英國Waters 公司；EX125D2H 電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；GZX-9140 MBE 數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；C18Sep-Pak?SPE 液相色譜柱，愛爾蘭賽分科技公司；Milli-Q Advantage A1 超純水機，美國密理博公司；0.22 μm 有機系針頭式過濾器，天津市津騰實驗設備有限公司；LDZM-40KCS-II 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術有限公司；CO2培養箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；7A07015 顯微鏡，奧林巴斯（中國）有限公司；TGL-16G 醫用離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Alpha 1-4LD plus 凍干機，德國Christ 公司。

2 方法與結果

2.1 原材料處理

取三七花60 ℃烘干、粉碎過60 目不銹鋼篩網獲得原藥材粉末，放于陰涼干燥處，備用。

2.2 人參皂苷的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 準確稱取20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5各5 mg 于5 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容；配制成混合對照品母液。準確吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL 于5 mL 量瓶中，定容，-20 ℃條件下儲存。

2.2.2 供試品溶液的制備 取各反應后的上清液，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，收集濾液，作為供試品溶液，待上機分析。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Acquity UPLC?BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為水-乙腈，梯度洗脫程序：0～5.8 min，13%～22%乙腈；5.8～18.75 min，22%～38%乙腈；18.75～22.05 min，38%～40%乙腈；22.05～23.55 min，40%～45%乙腈；23.55～24.25 min，45%～58%乙腈；24.25～30.00 min，58%～62%乙腈；30.00～30.75 min，62%～80%乙腈；30.75～37.75 min，80%～100%乙腈；37.75～40 min，0%～87%水；柱溫35 ℃；體積流量0.4 mL/min；進樣量3 μL；檢測波長203 nm。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品儲備液，按“2.2.3”項下色譜條件進行測定，以色譜峰峰面積為縱坐標（Y）、對照品質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程、相關系數（R2）和線性范圍分別為20(S)-Rg3Y＝3.31×106X－2.18×104，R2＝0.999 4，線性范圍20.2～323.2 μg/mL；20(R)-Rg3Y＝2.26×106X－1.30×104，R2＝0.999 4，線性范圍20.6～329.6 μg/mL；Rk1Y＝4.72×106X－114，R2＝0.999 3，線性范圍20.8～332.8 μg/mL；Rg5Y＝8.66×106X－4.82×104，R2＝0.999 3，線性范圍20.6～329.6 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取同一質量濃度的混合對照品溶液3 μL，按“2.2.3”項下色譜條件進行分析，連續進樣9 次，測定20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5峰面積的RSD 分別為1.88%、2.33%、1.67%、2.67%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 精密吸取同一轉化后三七花提取液樣品6 份，精密吸取6 份供試品溶液3 μL，按“2.2.3”項下色譜條件進行分析，測定20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的峰面積，通過回歸方程計算轉化后三七花樣品中20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的含量及RSD。結果表明20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5質量濃度的RSD 分別為1.64%、1.33%、2.68%、1.44%，表明本實驗重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 精密吸取轉化后三七花提取液樣品3 μL，分別在0、2、4、8、16、24 h 按“2.2.3”項下色譜條件進行分析，測定20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5峰面積的RSD 值分別為2.68%、1.73%、2.47%、2.39%。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取轉化后三七花提取液樣品6 份，加入適量的20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5對照品，按照“2.2.2”項下方法操作，按“2.2.3”項下色譜條件進行分析，測定得到4 種人參皂苷的平均加樣回收率分別為99.74%、99.83%、98.35%、99.64%，RSD 分別為3.25%、2.87%、2.31%、3.89%，表明加樣回收率良好。

2.3 數據處理

用GraphPad Prism 5 軟件分析數據，所有數據均采用±s表示，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析，P＜0.05 為顯著性差異具有統計學意義。

2.4 氨基酸種類對稀有人參皂苷轉化含量的影響

選擇5 種氨基酸分別與三七花粉末進行反應。反應條件參考文獻報道[19]，即氨基酸濃度為5%，反應時間為1 h，液固比為20 mL/g，反應溫度為120 ℃。使用UPLC 測定20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的含量，所有樣品重復3 次。2 種酸性氨基酸和3 種堿性氨基酸對4 種稀有人參皂苷轉化的影響如表1 所示，Asp、Glu、His、Lys 和Arg 對稀有人參皂苷的轉化含量依次減弱，其中，酸性氨基酸對稀有人參皂苷群的轉化含量顯著高于堿性氨基酸（P＜0.05）。Asp 和Glu 對4 種稀有人參皂苷的總轉化含量分別為（28.90±0.45）mg/g 和（27.56±0.48）mg/g。這與夏娟[15]的研究結果一致。與孫成鵬等[13]報道的檸檬酸轉化稀有人參皂苷轉化含量相比，可提高1.28 倍，因此最終選定Asp 作為最佳催化劑。

2.5 反應條件優化

考察了反應溫度（80、90、100、110、120 ℃）、Asp 濃度（1%、3%、5%、10%、20%）、液固比（10、20、30、40、50 mL/g）和反應時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對稀有人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5轉化含量的影響。根據上述單因素試驗的結果，設計了4 因素3 水平的正交試驗對提取工藝進一步優化，所有樣品重復3 次。

表1 不同氨基酸種類對稀有人參皂苷轉化的影響 ( = 3)Table 1 Effects of different amino acids on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

表1 不同氨基酸種類對稀有人參皂苷轉化的影響 ( = 3)Table 1 Effects of different amino acids on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

上標含相同字母表示無顯著性差異，否則表示有顯著性差異（P＜0.05）The superscript containing the same letter means that there is no significant difference,otherwise it means that there is a significant difference (P < 0.05)

氨基酸 質量分數/(mg·g-1)20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5 總量His 1.68±0.12 1.35±0.11 2.80±0.06 0.54±0.02 6.37±0.08c Lys 1.06±0.04 0.70±0.04 1.49±0.15 0.22±0.04 3.47±0.07d Glu 10.40±0.77 3.87±0.33 6.12±0.42 7.17±0.47 27.56±0.48b Asp 10.71±0.77 3.34±0.32 6.27±0.45 8.58±0.26 28.90±0.45a Arg 0.95±0.09 0.67±0.07 1.40±0.04 0.20±0.02 3.22±0.08d

2.5.1 反應溫度對稀有人參皂苷轉化含量的影響研究表明，鮮人參加工為紅參的過程中，稀有人參皂苷的含量會明顯增加，表明溫度是影響稀有人參皂苷形成的重要因素。本實驗研究結果（表2）表明，隨著溫度的升高，4 種稀有人參皂苷的轉化含量呈現逐漸升高又下降的趨勢。在110 ℃時，4 種稀有人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的轉化含量最高，分別為（11.08±0.88）、（3.63±0.60）、（6.63±0.52）、（8.06±0.38）mg/g，與其他組比較有顯著性差異（P＜0.05）。因此，最終選定110 ℃作為最優的反應溫度。

2.5.2 Asp 濃度對稀有人參皂苷轉化含量的影響本實驗研究結果表明（表3），隨氨基酸濃度的增加（1%～5%），稀有人參皂苷的轉化含量隨Asp 濃度增加而增加。在5%時稀有人參皂苷的轉化含量達到最高，20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5分別為（15.49±1.15）、（3.77±0.57）、（9.51±0.98）、（11.17±0.52）mg/g，并與其他組比較有顯著性差異（P＜0.05）。當氨基酸濃度超過5%時，稀有人參皂苷的轉化含量逐漸減少。因此，最終選定Asp 最適宜的濃度為5%。

表2 不同溫度對稀有人參皂苷轉化的影響 ( = 3)Table 2 Effects of different temperatures on transformation of rare ginsenosides ( = 3)

表2 不同溫度對稀有人參皂苷轉化的影響 ( = 3)Table 2 Effects of different temperatures on transformation of rare ginsenosides ( = 3)

上標含不同字母表示有顯著性差異（P＜0.05）The superscript containing the different letter means that there is a significant difference (P < 0.05)

溫度/℃ 質量分數/(mg·g-1)20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5 總量80 0.46±0.02 0.36±0.01 0.23±0.01 0.23±0.01 1.29±0.01e 90 1.12±0.20 1.12±0.06 0.72±0.04 0.77±0.04 3.73±0.08d 100 2.60±0.07 2.27±0.05 1.41±0.16 2.17±0.01 8.50±0.70c 110 11.08±0.88 3.63±0.60 6.63±0.52 8.06±0.38 29.41±0.59a 120 5.95±3.20 2.72±0.53 3.50±1.94 4.16±2.27 16.33±2.08b

表3 不同Asp 濃度對稀有人參皂苷轉化的影響 ( = 3)Table 3 Effect of different Asp addition on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

表3 不同Asp 濃度對稀有人參皂苷轉化的影響 ( = 3)Table 3 Effect of different Asp addition on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

上標含不同字母表示有顯著性差異（P＜0.05）The superscript containing the different letter means that there is a significant difference (P < 0.05)

ASP 濃度/% 質量分數/(mg·g-1)20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5 總量1 6.39±0.11 4.00±0.06 3.83±0.09 4.09±0.19 18.31±0.11e 3 11.08±0.88 3.63±0.60 6.62±0.52 8.06±0.38 29.41±0.59c 5 15.49±1.15 3.77±0.57 9.51±0.98 11.17±0.52 39.95±0.80a 10 12.61±0.64 2.32±0.01 7.78±0.29 7.78±0.29 30.49±0.31b 20 8.53±0.24 1.47±0.50 5.51±0.70 6.75±0.26 22.27±0.16d

2.5.3 液固比對稀有人參皂苷轉化含量的影響液固比對稀有人參皂苷群轉化的影響如表4 所示，隨著液固比的增加，稀有人參皂苷的轉化含量呈現先增加后降低的趨勢，在20 mL/g 時轉化含量達到最高，20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5分別為（15.48±1.15）、（3.77±0.57）、（9.51±0.98）、（11.17±0.52）mg/g，且顯著高于其他組的轉化含量（P＜0.05）。最終選定最適宜的液固比為20 mL/g。

2.5.4 反應時間對稀有人參皂苷轉化含量的影響反應時間對稀有人參皂苷的影響如表5 所示。稀有人參皂苷的含量隨反應時間的增加而逐漸增加。當反應2.0 h 時，4 種稀有人參皂苷的轉化含量達到最高，20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5分別為（15.49±0.64）、（3.77±0.57）、（9.51±0.98）、（11.17±0.52）mg/g，且顯著高于其他組（P＜0.05）。當反應時間超過2.0 h 后，稀有人參皂苷的總量沒有繼續增長。這可能是因為隨著反應時間的增加，底物被不斷消耗，并且有效成分在達到最大值后有效碰撞減少，含量變化趨于平坦。考慮未來規模化生產，低能耗高產率的原則，最終選定2.0 h 為最佳反應時間。

表4 不同液固比對稀有人參皂苷轉化的影響 ( = 3)Table 4 Effect of different liquid-solid ratios on transformation of rare ginsenosides ( = 3)

表4 不同液固比對稀有人參皂苷轉化的影響 ( = 3)Table 4 Effect of different liquid-solid ratios on transformation of rare ginsenosides ( = 3)

上標含不同字母表示有顯著性差異（P＜0.05）The superscript containing the different letter means that there is a significant difference (P < 0.05)

液固比/(mL·g-1) 質量分數/(mg·g-1)20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5 總量10 10.43±0.09 3.26±0.15 6.87±0.19 9.36±0.14 29.92±0.14e 20 15.48±1.15 3.77±0.57 9.51±0.98 11.17±0.52 39.94±0.80a 30 14.93±0.38 3.85±0.26 8.45±0.02 10.80±0.20 38.04±0.22b 40 14.36±0.58 3.94±0.08 8.22±0.15 10.54±0.23 37.06±0.25c 50 14.08±0.51 2.88±0.15 7.75±0.15 10.47±0.13 35.18±0.23d

表5 不同反應時間對稀有人參皂苷轉化的影響 ( = 3)Table 5 Effects of different time on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

表5 不同反應時間對稀有人參皂苷轉化的影響 ( = 3)Table 5 Effects of different time on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

上標含相同字母表示無顯著性差異，否則表示有顯著性差異（P＜0.05）The superscript containing the same letter means that there is no significant difference,otherwise it means that there is a significant difference (P < 0.05)

反應時間/h 質量分數/(mg·g-1)20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5 總量0.5 6.43±0.11 4.05±0.16 3.95±0.18 4.25±0.21 18.53±0.25e 1.0 12.10±0.78 3.83±0.72 6.75±0.58 8.08±0.39 30.02±0.31c 1.5 10.43±1.15 3.25±0.15 6.88±0.20 9.36±0.14 29.92±0.14d 2.0 15.49±0.64 3.77±0.57 9.51±0.98 11.17±0.52 39.95±0.80a 2.5 14.93±0.24 3.85±0.26 8.45±0.02 10.80±0.20 38.04±0.22a 3.0 14.36±0.56 3.94±0.08 8.22±0.15 10.54±0.23 37.06±0.25b

2.5.5 正交試驗結果 由于多個因素對稀有人參皂苷的轉化都存在一定的影響，優化提取工藝是稀有人參皂苷轉化的重要步驟。通過前期單因素試驗結果，以反應溫度（A）、Asp 濃度（B）、液固比（C）、反應時間（D）為考察因素，每個因素設置3 個水平，進行采用L9(34)正交試驗，正交試驗設計與結果見表6，方差分析見表7。由表6 可見，對稀有人參皂苷轉化總轉化含量的影響因素大小排列為A＞C＞D＞B，最佳轉化條件是A3B2C3D2。由方差分析可知，溫度對轉化含量影響顯著，Asp 濃度、液固比、時間對轉化含量影響不顯著。因此最佳的轉化條件是溫度為120 ℃、Asp 濃度為5%、液固比為30 mL/g 和反應時間為2.0 h。

表6 三七花中稀有人參皂苷轉化L9(34)正交試驗結果Table 6 L9(34) orthogonal test results of conversion of rare ginsenosides from PNF

表7 正交試驗方差分析Table 7 ANOVA of orthogonal test

2.6 結果驗證

按照正交試驗篩選出的最優條件A3B2C3D2進行驗證，重復5 次，結果顯示，轉化后4 種稀有人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的轉化含量分別為（17.80±0.43）、（5.40±0.64）、（10.62±0.68）、（13.10±0.22）mg/g，平均的總轉化含量為（47.12±0.52）mg/g，表明本實驗確定的稀有人參皂苷的轉化方法穩定且轉化效率高。三七花皂苷轉化前后對比圖如圖1 所示。

2.7 轉化前后三七花提取物對 LPS 刺激RAW264.7 細胞活力的影響

據現有文獻報道，三七花對耳廓炎癥、滲出性炎癥以及小鼠或大鼠踝關節腫脹、足腫脹等均有抑制作用[19-21]。并能顯著抗5-羥色胺、組胺及緩激肽所致大鼠皮膚毛細血管通透性增加，還可減少炎癥滲出物中的PGE 含量[22-23]。說明三七花具有良好的消腫抗炎功效。而稀有人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5對于炎癥反應也有顯著抑制[24-25]。因此，對比轉化前后三七花提取物對LPS 刺激RAW264.7 細胞的炎癥反應。

圖1 三七花轉化前 (a)、后 (b) 人參皂苷UPLC 對比圖Fig.1 UPLC comparison of PNF before (a) and after (b)ginsenoside transformation

RAW264.7 小鼠巨噬細胞用DMEM 培養基（含10%胎牛血清，鏈霉素和青霉素總含量為1%的雙抗）培養傳代，培養箱設置條件為37 ℃、5% CO2。將RAW264.7 細胞以2×104/孔的密度接種于96 孔板上，培養24 h 后進行分組處理，正常組：不做任何處理，正常培養12 h，炎癥模型組：1 μg/mL LPS持續刺激細胞12 h，轉化前后三七花提取液處理組：1 μg/mL LPS 和提取液（1.562、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000、200.000 μg/mL）共同處理細胞12 h。12 h 后每孔加入10 μL CCK-8，孵育2 h，酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度（A）值，計算增殖指數。

增殖指數＝A處理/A對照

由圖2 可知，與對照組相比，LPS 顯著促進巨噬細胞的增殖（P＜0.05），與LPS 組相比，轉化后三七花提取物在質量濃度為1.56～200 μg/mL，對LPS 誘導的RAW264.7 的增殖具有顯著抑制作用（P＜0.05）。在質量濃度≥6.250 μg/mL 時，與三七花提取物相比，轉化后三七花提取物更能顯著抑制LPS 引起RAW264.7 細胞的增殖（P＜0.05）。

2.8 轉化前后三七花提取物對RAW264.7 細胞NO分泌的影響

圖2 三七花提取物轉化前后對LPS 刺激RAW264.7 細胞吞噬活性的影響 ( = 3)Fig.2 Effect of PNF extract on phagocytic activity of RAW264.7 cells stimulated by LPS ( = 3)

NO 在炎癥反應過程中大量表達，是炎癥發病機制中的重要信使[26]。RAW264.7 細胞以8×104/孔的密度接種于96 孔板，培養24 h，1 μg/mL LPS 刺激細胞2 h，1 μg/mL LPS 和提取液（1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）共同處理細胞12 h，收集細胞上清液，按NO 試劑盒說明操作，測定細胞上清液中NO 的含量。

由圖3 可知，與對照組相比，模型組RAW264.7細胞NO 分泌水平顯著升高（P＜0.05）。轉化前三七花提取物對LPS 誘導的RAW264.7 細胞中NO 具有顯著抑制作用的最低質量濃度為3.125 μg/mL，而轉化后三七花提取物具有顯著抑制作用的最低質量濃度為1.562 μg/mL。并且在相同質量濃度中，轉化后三七花提取物更能顯著抑制 LPS 引起RAW264.7 細胞中NO 的分泌（P＜0.05）。

圖3 三七花提取物對LPS 刺激RAW264.7 細胞NO 釋放量的影響 ( = 3)Fig.3 Effect of extract from PNF on release of NO from RAW264.7 cells stimulated by LPS ( = 3)

2.9 轉化前后三七花提取物對RAW264.7 細胞白細胞介素-6 (IL-6) 分泌的影響

小鼠巨噬細胞RAW264.7 在LPS 的誘導下會釋放出大量的促炎因子IL-6，細胞中促炎因子分泌的增加可加速炎癥的發展[27]。RAW264.7 細胞以8×104個/孔的密度接種于96 孔板，培養24 h，1 μg/mL LPS 刺激細胞2 h，1 μg/mL LPS 和提取液（1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）共同處理細胞12 h，收集細胞上清液，按IL-6 ELISA試劑盒說明操作，測定細胞上清液中IL-6 的含量。

從如圖4 可以看出，模型組IL-6 的分泌顯著高于對照組（P＜0.05）。與模型組相比，轉化前三七花提取物在質量濃度大于3.125 μg/mL 時，可顯著抑制IL-6 的釋放（P＜0.05），而轉化后三七花提取物在質量濃度大于1.56 μg/mL 時，就可以顯著抑制促炎因子IL-6 的釋放（P＜0.05）。在相同質量濃度中，轉化后三七花提取物對IL-6 抑制率顯著高于轉化前三七花提取物（P＜0.05）。

圖4 三七花提取物對LPS 刺激RAW264.7 細胞IL-6 釋放量的影響 ( = 3)Fig.4 Effect of PNF extract on release of IL-6 from RAW264.7 cells stimulated by LPS ( = 3)

3 討論

本研究添加食品級氨基酸，通過單因素實驗和正交試驗探索了一種安全高效綠色的將三七花中原有人參皂苷轉化為稀有人參皂苷的方法。結果表明，添加Asp 可以顯著增加三七花中稀有人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的含量，這可能是因為Asp 是酸性氨基酸，在熱裂解的條件下，較高濃度的H+和較多的二醇組皂苷顯著促進了水解反應的發生。人參二醇組皂苷在C-20 位的糖苷鍵斷裂生成中間產物20(S)-Rg3和20(R)-Rg3，再進一步脫水水解成稀有人參皂苷Rk1和Rg5，這大大促進了稀有人參皂苷的生成。

LPS 是全身炎癥反應綜合癥的一種重要致病因子，可與巨噬細胞表面抗原識別受體相結合而刺激細胞[28-29]，繼而激活多條炎癥通路，產生一系列促炎因子，引起機體嚴重的炎癥反應[30-32]。適度的巨噬細胞增殖可提高機體抵御外界和修復機體損傷的能力，而過度刺激會引起細胞的免疫反應，導致細胞凋亡和機體損傷。因此本實驗運用此炎癥模型對轉化后三七花與轉化前抗炎效果進行比較，探究轉化后三七花的藥理作用。在轉化前后的三七花提取物對LPS 誘導RAW264.7 細胞活性、NO 的分泌和炎癥因子IL-6 的釋放量的影響進行了考察中可以看出，與三七花提取物相比較，轉化后三七花提取物對LPS 誘導RAW264.7 細胞炎癥反應有更好的抑制作用（P＜0.05）。這有可能是因為稀有皂苷的增加，根據文獻記載稀有人參皂苷 20(S)-Rg3、20(R)-Rg3可通過調節iNOS的表達抑制NO的產生，抑制LPS 或UV 照射誘導的細胞ROS 水平[24]；人參皂苷Rg5可以通過抑制LPS 與巨噬細胞Toll 樣受體（TLR）-4 結合而減輕肺部炎癥[33]；Rk1和Rg5對TNF-α/IFN-γ-和LPS 誘導的趨化因子和細胞因子的產生有明顯的抑制和下調作用，抑制這些介導因子的產生可降低LPS 誘導的RAW264.7 細胞NO 和ROS 的生成[25]。因此，稀有皂苷的增加可能是轉化后三七花對于LPS 誘導RAW264.7 細胞炎癥反應有顯著抑制的原因。但其抗炎機理有待進一步驗證。本論文對稀有人參皂苷的轉化提供了新的綠色、安全和高效的轉化方法，為三七花的生產與利用提供了新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突