蘇木酮A對(duì)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用

周小清，廖理曦，姜 勇，屠鵬飛，曾克武

北京大學(xué) 天然藥物與仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以系統(tǒng)性慢性炎癥為主的自身免疫性疾病[1]，其主要病理特點(diǎn)為關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生、滑膜襯里層增厚、多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和大量炎癥因子分泌等[2-3]，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、酸脹、晨僵、活動(dòng)受限[4]。RA 患者若不能及時(shí)得到有效的治療，可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形、殘疾等現(xiàn)象。目前RA 的治療藥物主要為非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、B 細(xì)胞抑制劑、細(xì)胞因子受體抑制劑等[5]，價(jià)格昂貴且伴有心血管和胃腸道出血、肝腎毒性和生長(zhǎng)抑制等不良反應(yīng)[6-8]，因此，開(kāi)發(fā)抗RA 的天然藥物尤為重要。

蘇木Caesalpinia sappanL.為豆科植物蘇木干燥的心材，具有活血化瘀、消腫止痛的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蘇木具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、免疫抑制等活性[9]。蘇木酮A 是蘇木的活性成分之一，可抑制腦部小膠質(zhì)細(xì)胞活化，具有抑制神經(jīng)炎癥作用[10]。目前尚無(wú)蘇木酮A對(duì)其他炎癥模型作用的相關(guān)報(bào)道，本研究旨在探討蘇木酮A 對(duì)牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的RA 大鼠的治療作用，為抗RA 藥物的研發(fā)提供思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量200 g，購(gòu)自北京維通利華有限公司，許可證號(hào)SYXK（京）2016-0041。動(dòng)物在（25±2）℃，12 h 光照/12 h 黑暗周期下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)LA2015206）。

1.2 細(xì)胞

小鼠單核巨噬細(xì)胞Raw264.7 購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。

1.3 藥品

蘇木酮A 由本實(shí)驗(yàn)室合成制備，HPLC 檢測(cè)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%，經(jīng)UV、MS、NMR 等方法確定其結(jié)構(gòu)，ESI-MSm/z: 283.4 [M－H]-；1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6)δ: 10.58 (1H,brs),9.57 (1H,brs),9.21 (1H,brs),8.24 (1H,s),7.72 (1H,d,J= 8.7 Hz),7.52 (1H,s),6.83 (2H,m),6.76 (1H,dd,J= 8.3,1.7 Hz),6.54 (1H,dd,J= 8.7,2.2 Hz),6.31 (1H,d,J=2.2 Hz),5.35 (2H,d,J= 1.6 Hz)。

1.4 試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)CM15019）、無(wú)酚紅DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)CM15020）、青霉素-鏈霉素溶液（批號(hào)CC004）均購(gòu)自北京中科邁晨科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)AB-fbs0500S）購(gòu)自北京百諾威生物科技有限公司；溴化噻唑藍(lán)四氮唑（MTT，批號(hào)88417）、脂多糖（批號(hào)L8880-10）、完全弗氏佐劑（批號(hào)F5881）、不完全弗氏佐劑（批號(hào)F5506）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（批號(hào)60291-1-Ig）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗體（批號(hào)66146-1-Ig）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）抗體（批號(hào)10375-2-AP），均購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；生物素標(biāo)記化山羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)A0277）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；牛Ⅱ型膠原（批號(hào)G810381）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；戊巴比妥鈉（批號(hào)T0894）購(gòu)自美國(guó)Merck公司；TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)G001-2）、一氧化氮測(cè)定試劑盒（批號(hào)A013-1-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；IL-6 ELISA 試劑盒（批號(hào)EM004-96）購(gòu)自ExCellBio 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)D103272）購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司。

1.5 儀器

Sunrise-Basic 酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan 公司；IX73倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；MJ-78A高壓滅菌鍋購(gòu)自上海施都凱儀器設(shè)備有限公司；SC-237 冰箱、BC/BD-H100 冰柜購(gòu)自青島澳柯瑪醫(yī)療器械有限公司；DW-86L626 超低溫冰箱購(gòu)自上海海爾特種電器有限公司。

2 方法

2.1 RA 大鼠模型的建立、分組與給藥

根據(jù)課題組前期研究[10]，大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、蘇木酮A（50 mg/kg）組，每組6 只。牛Ⅱ型膠原溶于醋酸配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的溶液，與完全弗氏佐劑按1∶1 混合配成乳劑I，與不完全弗氏佐劑按1∶1 混合形成乳劑Ⅱ。大鼠麻醉后，尾根部sc 0.1 mL 乳劑I，第7 天于尾根部sc 0.1 mL 乳劑Ⅱ，第14 天大鼠后肢紅腫，踝關(guān)節(jié)體積明顯增大，造模成功。蘇木酮A 溶于0.5%羧甲基纖維素鈉配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的溶液。蘇木酮A 組大鼠ig 藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig 等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)20 d。測(cè)量大鼠右后足的足趾容積。

2.2 大鼠踝關(guān)節(jié)組織的病理分析

大鼠脫頸椎處死，取右后足，固定、脫水、石蠟包埋后切片。切片以蒸餾水漂洗，依次用蘇木精、伊紅染料染色；脫水后用二甲苯透明，再用中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理變化。

切片按照TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色后，置磷酸鹽緩沖液（含0.05%聚山梨醇20）中洗滌，于顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)損傷情況。

2.3 大鼠踝關(guān)節(jié)組織中IL-6、TNF-α 和MMP-9的表達(dá)情況

踝關(guān)節(jié)組織切片用二甲苯脫蠟，用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。經(jīng)3%過(guò)氧化氫處理并漂洗后，用5%～10%山羊血清封閉，分別滴加IL-6、TNF-α和MMP-9 抗體并孵育，滴加生物素標(biāo)記化山羊抗兔IgG 抗體并孵育，PBS 洗滌后滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色。蘇木素復(fù)染后脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

Raw264.7 細(xì)胞用高糖DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/L 青霉素、100 μg/L 鏈霉素）培養(yǎng)，每天傳代1 次。

2.5 MTT 法檢測(cè)Raw264.7 細(xì)胞存活率

將Raw264.7 細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，設(shè)置對(duì)照組、模型組和蘇木酮A（2.5、5.0、10.0 μmol/L）組。蘇木酮A 溶于DMSO 配制成20 mmol/L 母液，用高糖DMEM 培養(yǎng)基分別稀釋為2.5、5.0、10.0 μmol/L 的溶液。模型組和給藥組加入脂多糖（1 μg/mL），給藥組另加入蘇木酮A，對(duì)照組加入不含藥物的高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。棄去上清液，加入MTT（0.5 mg/mL），孵育4 h；棄去上清液加入DMSO 溶解后，用酶標(biāo)儀于570 nm 檢測(cè)吸光度（A）并計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照

2.6 Raw264.7 細(xì)胞中一氧化氮水平測(cè)定

將Raw264.7 細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于48 孔板中，設(shè)置對(duì)照組、模型組和蘇木酮A（2.5、5.0、10.0 μmol/L）組。模型組和給藥組加入脂多糖（1 μg/mL），給藥組另加入蘇木酮A，對(duì)照組加入不含藥物的無(wú)酚紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。吸取上清液300 μL，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定一氧化氮水平。

2.7 Raw264.7 細(xì)胞中IL-6 水平測(cè)定

將Raw264.7 細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于48 孔板中，設(shè)置對(duì)照組、模型組和蘇木酮A（2.5、5.0、10.0 μmol/L）組。模型組和給藥組加入脂多糖（1 μg/mL），給藥組另加入蘇木酮A，對(duì)照組加入不含藥物的高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)8 h。吸取上清液100 μL，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-6 水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 蘇木酮A 對(duì)RA 大鼠足容積的影響

如圖1 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠足容積明顯增大（P＜0.01）；與模型組比較，蘇木酮A組大鼠足容積顯著減少（P＜0.05）。

3.2 蘇木酮A對(duì)RA 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化的影響

如圖2 所示，HE 染色可見(jiàn)模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜層相較于對(duì)照組明顯增厚；蘇木酮A 組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜形態(tài)明顯恢復(fù)，相較于模型組明顯變薄，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。TUNEL 染色可見(jiàn)模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織出現(xiàn)陽(yáng)性染色，提示存在細(xì)胞凋亡；蘇木酮A 組TUNEL陽(yáng)性染色區(qū)域減少，提示細(xì)胞凋亡受到抑制。表明蘇木酮A 能改善RA 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的損傷。

圖1 蘇木酮A 對(duì)RA 大鼠足容積的影響 ()Fig.1 Effect of sappanone A on foot volume in RA rats()

圖2 蘇木酮A 對(duì)RA 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化的影響(×10)Fig.2 Effect of sappanone A on histopathological changes of ankle synovium in RA rats (× 10)

3.3 蘇木酮A 對(duì)RA 大鼠踝關(guān)節(jié)組織中IL-6、TNF-α 和MMP-9 表達(dá)的影響

如圖3 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中IL-6、TNF-α 和MMP-9 表達(dá)升高，表明模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織出現(xiàn)炎性損傷；與模型組比較，蘇木酮A 組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中IL-6、TNF-α 和MMP-9 表達(dá)降低，表明蘇木酮A 可抑制RA 大鼠炎性因子的表達(dá)。

3.4 蘇木酮A 對(duì)Raw264.7 細(xì)胞存活率的影響

如圖4 所示，蘇木酮A（2.5、5.0、10.0 μmol/L）組Raw264.7 細(xì)胞存活率均大于80%。

3.5 蘇木酮A 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的Raw264.7 細(xì)胞一氧化氮和IL-6 水平的影響

圖3 蘇木酮A 對(duì)RA 大鼠踝關(guān)節(jié)組織中IL-6、TNF-α 和MMP-9 表達(dá)的影響Fig.3 Effect of sappanone A on expressions of IL-6,TNF-α and MMP-9 in ankle joint tissue of RA rats

如圖5 所示，與對(duì)照組比較，模型組一氧化氮和IL-6 水平顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，蘇木酮A（2.5、5.0、10.0 μmol/L）顯著抑制一氧化氮和IL-6 水平（P＜0.01），呈劑量相關(guān)性，表明蘇木酮A 可抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥。

圖4 蘇木酮A 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的Raw264.7 細(xì)胞活性的影響()Fig.4 Effect of sappanone A on viability of Raw264.7 cells induced by lipopolysaccharide ()

圖5 蘇木酮A 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的Raw264.7 細(xì)胞一氧化氮和IL-6 水平的影響 ()Fig.5 Effect of sappanone A on levels of nitric oxide and IL-6 in Raw264.7 cells induced by lipopolysaccharide ()

4 討論

RA 疾病發(fā)展迅速，如果患者在早期不能得到有效治療，則可能惡化成疾。RA 病理特征表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、滑膜細(xì)胞增生、炎癥因子大量釋放[2-3]。成纖維樣滑膜細(xì)胞是RA 患者滑膜組織中的主要細(xì)胞類型之一，被認(rèn)為是治療RA 的有效靶點(diǎn)[11-14]。因此，抑制滑膜細(xì)胞增生可作為治療RA 的指標(biāo)之一。促炎細(xì)胞因子IL-6 和TNF-α 作為重要的炎癥介質(zhì)參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，可作為RA 的評(píng)價(jià)指標(biāo)。MMP-9 具有降解和再塑造細(xì)胞外基質(zhì)的功能，參與機(jī)體中多種病理和生理過(guò)程[15]。MMP-9 的表達(dá)與活化可促進(jìn)RA 中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，參與患者骨組織的侵蝕和破壞[16]。

蘇木酮A 是從蘇木中發(fā)現(xiàn)的抗炎活性成分，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抑制神經(jīng)炎癥作用。本研究發(fā)現(xiàn)蘇木酮A 能有效抑制牛Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA 大鼠足腫脹、踝關(guān)節(jié)滑膜組織損傷和炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能為抑制滑膜組織細(xì)胞凋亡、成纖維細(xì)胞增殖和炎癥因子釋放；蘇木酮A 能顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的Raw264.7 細(xì)胞中炎性介質(zhì)一氧化氮和IL-6 的分泌，表明蘇木酮A 的抗RA 作用與抑制炎癥因子生成有關(guān)。本研究從體內(nèi)外探討了蘇木酮A 對(duì)RA 的治療作用，為抗RA 藥物的開(kāi)發(fā)提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突