銀翹散及其拆方對流感病毒感染自然殺傷細胞活性的影響及轉錄組的比較分析

陳 蓓，馬 榮，陳能斌，周德潤，王湛鈞

1.新疆醫科大學第一附屬醫院 藥學部，新疆 烏魯木齊 830011

2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，中西醫結合臨床研究所，上海 200437

3.上海市中醫藥研究院，中西醫結合臨床研究所，上海 200437

4.華東理工大學生物工程學院，上海 200237

銀翹散出自清代吳塘所著的《溫病條辨》，為辛涼解表的代表方劑，其主要功用為辛涼透表、清熱解毒，是臨床上治療流行性感冒的常用中醫藥方劑。銀翹散原方由連翹（30 g）、金銀花（30 g）、桔梗（18 g）、薄荷（18 g）、淡竹葉（12 g）、荊芥穗（12 g）、淡豆豉（15 g）、牛蒡子（18 g）、生甘草（15 g）為散，以鮮蘆葦根煎湯服用?，F代藥理學研究證明，銀翹散能夠降低流感病毒感染小鼠死亡率及肺部病毒載量、延長小鼠生存周期[1-2]。在胸腺缺陷小鼠 [T 細胞缺陷，自然殺傷（natural killer，NK）細胞正常] 模型中，NK 細胞活性在流感病毒感染后第1 天顯著升高，第3、5、7 天明顯降低；銀翹散各劑量組NK 細胞活性在流感病毒感染后第3、5、7 天較模型組有明顯提高[3]。本課題前期研究表明，在SCID 小鼠（T 和B 淋巴細胞缺陷，NK細胞活性較正常小鼠高）模型中，NK 細胞活性在流感病毒感染第3 天開始降低；經銀翹散治療后，NK 細胞活性有所提高，并且各劑量組間體現出一定的量效關系[4]，同時銀翹散還能夠增強抗病毒免疫應答相關細胞及因子水平[5-6]。

對于不同的免疫狀態，流感病毒均能使NK 細胞活性呈現降低趨勢，而銀翹散能夠翻轉這種免疫狀態，增強NK 細胞的免疫功能。為此，本實驗進一步將流感病毒感染的NK 細胞作為研究模型，通過君、臣、佐、使的拆方研究，明確銀翹散發揮抗病毒及免疫增強作用的主要藥物，為銀翹散在臨床中的精簡應用提供實驗依據，為中藥抗流感病毒方劑的現代化研究提供研究思路。

1 材料

1.1 藥品與試劑

金銀花（批號 1410001W）、連翹（批號1409002W）、薄荷（批號1408001S）、牛蒡子（批號1411002W）、淡豆豉（批號1410001W）、荊芥穗（批號1408001S）、桔梗（批號1410002S）、蘆葦根（批號1407001W）、淡竹葉（批號14109001S）和生甘草（批號1411003S），均為配方顆粒，購自華潤三九醫藥股份有限公司。本實驗中使用的藥物劑量均參照方劑中的臨床劑量，將生藥劑量折算為顆粒劑的用量，并將臨床劑量按照體表面積等效劑量轉換法，換算為小鼠劑量，并按照臨床配伍比例配伍使用。故本研究中各藥物的小鼠劑量為金銀花0.44 g/kg、連翹0.22 g/kg、薄荷0.22 g/kg、牛蒡子0.132 g/kg、淡豆豉0.11 g/kg、荊芥穗0.088 g/kg、桔梗0.264 g/kg、蘆葦根0.11 g/kg、淡竹葉0.088 g/kg、生甘草0.367 g/kg。各拆方組中藥味的劑量與其在全方中的劑量相同。銀翹散和各拆方分別按照方劑配伍比例將各藥物配方顆?；旌虾?，均以高純水溶解，用于小鼠ig 給藥。將銀翹散和臣藥中使用的配方顆粒分別按照方劑配伍比例混合后，溶于高純水，0.22 μm 微孔濾膜濾過后作為細胞實驗用儲備液。利巴韋林顆粒（批號140920），購自四川百利藥業有限責任公司。FITC-Ly-49D、PE-Ly-49H、FITC-CD3e、PE-CD49b 和Alexa Fluor 647-NKp46抗體，均購自BD Pharmingen 公司。紅細胞裂解液和4%多聚甲醛溶液，購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

4 周齡SPF 級ICR 和C57BL/6J 小鼠，雌性，體質量13～15 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號SCXK（京）2014-0004。動物實驗按照新疆醫科大學第一附屬醫院動物倫理委員會相關規定進行，動物實驗倫理批準號為IACUC-20140214009。小鼠飼養于生物安全實驗室（ABSL-2）動物室，室內溫度26 ℃，濕度（60±5）%，且12 h 明暗交替，正常飲食、飲水。小鼠給藥體積為0.2 mL/10 g。

1.3 病毒

小鼠流感病毒A/Puerto Rico/8/1934（PR8，H1N1 型），由中國中醫科學院中藥研究所生物安全實驗室提供，經雞胚傳代使用。將雞胚中獲得的病毒原液用生理鹽水稀釋600 倍，作為工作液，用于小鼠感染實驗。

人流感病毒A/Hong Kong/8/68（HK8，H3N2型）購自美國ATCC（VR-1679?），經犬上皮細胞MDCK 傳代后保存為病毒原液。

1.4 細胞株

人自然殺傷細胞NK-92MI，購自美國ATCC（CRL-2408TM）。細胞以α-MEM（無核糖核苷和脫氧核糖核苷）培養基培養，培養基中添加0.2 mmol/L肌醇、0.1 mmol/L β-巰基乙醇和0.02 mmol/L 葉酸，含12.5%馬血清和12.5%胎牛血清。細胞置于37 ℃二氧化碳孵箱中培養。銀翹散和臣藥對該細胞的劑量分別為銀翹散50 μg/mL，臣藥100 μg/mL。劑量經細胞活性實驗（CCK-8 法）檢測獲得，為藥物在NK-92MI 細胞中的最高無毒劑量。

1.5 儀器

FACS Calibur 流式細胞儀，美國Beckman-Coulter 公司。EG1160 包埋機，德國Leica 公司；H93/RM2126 切片機，德國Leica 公司；ECLIPSE LV100POL/50IPOL 光學顯微鏡，日本尼康公司。

2 方法

2.1 實驗分組、小鼠肺炎模型的制備及給藥

將ICR 和C57BL/6J 小鼠分別隨機分為對照組、模型（PR8 病毒感染）組、銀翹散組（3.09 g/kg）、君藥（金銀花、連翹）組（1.00 g/kg）、臣藥（薄荷、牛蒡子、淡豆豉、荊芥穗）組（0.83 g/kg）、佐藥（桔梗、蘆葦根、淡竹葉）組（0.70 g/kg）和使藥（生甘草）組（0.56 g/kg）、陽性藥物（利巴韋林）組（82.5 mg/kg）。ICR 小鼠每組10 只，C57BL/6J 小鼠每組3 只。將小鼠乙醚淺麻醉后，用PR8 病毒工作液滴鼻感染小鼠，30 μL/只，對照組小鼠滴鼻感染等體積的生理鹽水。PR8 病毒感染后1 h 按照組別分別ig 給藥。

2.2 小鼠肺質量抑制率的檢測

各組ICR 小鼠給藥后第5 天，稱體質量，ip 氯胺酮（100 mg/kg）麻醉后45 min，脫頸椎處死，摘取肺臟并稱質量。計算肺指數（肺質量/體質量）和肺質量抑制率。

肺質量抑制率＝(對照組小鼠肺質量－各藥物組小鼠肺質量)/(對照組小鼠肺質量－模型組小鼠肺質量)

2.3 肺臟病理檢測（HE 染色）

將各組ICR 小鼠肺臟固定于4%多聚甲醛溶液中24 h。組織浸于液體石蠟，然后進行包埋、切片和貼片。切片置于60 ℃環境中烘烤1 h，經脫蠟處理后，依次進行蘇木素染色和伊紅染色。切片于光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 肺臟NK 細胞Ly-49D 和Ly-49H 受體含量的檢測

各組C57BL/6J 小鼠給藥后第5 天，ip 氯胺酮（100 mg/kg）麻醉后45 min，脫頸椎處死，摘取肺臟，制備單細胞懸液，裂解紅細胞后，每只小鼠取1×107個細胞，以FITC-Ly-49D 抗體（1.5 μL/500 μL體系）和PE-Ly-49H 抗體（2.5 μL/500 μL 體系）4 ℃共同孵育30 min，400×g離心10 min。取沉淀，用2 mL PBS 洗一遍，400×g離心10 min。將細胞沉淀用400 μL 2%多聚甲醛固定。采用流式細胞儀檢測NK 細胞表面激活性受體Ly-49D、Ly-49H 的含量。同時設置Ly-49D、Ly-49H 抗體的同型對照組。

2.5 肺臟NK 細胞NKp46 受體的檢測

各組C57BL/6J 小鼠給藥后第5 天，ip 氯胺酮（100 mg/kg）麻醉后45 min，脫頸椎處死，摘取肺臟，制備單細胞懸液，裂解紅細胞后，每只小鼠取1×107個細胞，以FITC-CD3e（1.5 μL/500 μL 體系）、PE-CD49b（2.0 μL/500 μL 體系）和Alexa Fluor 647-NKp46（2.0 μL/500 μL 體系）抗體4 ℃共同孵育30 min，400×g離心10 min。取沉淀，用2 mL PBS洗一遍，400×g離心10 min。將細胞沉淀用400 μL 2%多聚甲醛固定。采用流式細胞儀檢測NK 細胞毒性受體NKp46 的含量。同時設置NKp46 抗體的同型對照組。

2.6 H3N2 流感病毒感染NK-92MI 細胞模型的制備及藥物干預

將NK-92MI 細胞接種于6 孔板。實驗設對照組、模型（H3N2 感染）組、銀翹散組和臣藥組，每組3 個復孔。將H3N2 病毒原液以無血清培養基稀釋82.5 倍，作為病毒工作液。以病毒工作液培養NK-92MI 細胞6 h，1.5 mL/孔；對照組以等體積不含病毒的培養基培養。補加完全培養基1.5 mL/孔，繼續培養16 h。銀翹散組和臣藥組分別加入銀翹散和臣藥儲備液，使質量濃度分別為50、100 μg/mL；對照組加入等體積的高純水。藥物作用10 h。

2.7 NK-92MI 細胞轉錄組分析

收集“2.6”項中的細胞，提取細胞總RNA，分離并純化mRNA，構建cDNA 文庫，然后采用Illumina 測序平臺（Illumina HiSeqTM2500）對文庫進行測序（上海歐易生物醫學科技有限公司）。對差異基因進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

2.8 統計方法

數據以±s表示，采用SPSS 13.0 軟件中單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 對流感病毒感染小鼠肺炎的抑制作用

流感病毒PR8 的感染使得小鼠體質量下降、肺臟質量增加，進而肺臟指數顯著高于正常小鼠（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥物利巴韋林、銀翹散、君藥（金銀花、連翹）、臣藥（薄荷、牛蒡子、淡豆豉、荊芥穗）、佐藥（桔梗、蘆葦根、淡竹葉）和使藥（甘草）均能夠降低由流感病毒引起的肺指數增加；其中利巴韋林、銀翹散和臣藥能夠顯著抑制肺指數的增加（P＜0.05、0.01）；且臣藥組對肺炎的抑制作用略優于銀翹散組。結果見表1。

表1 銀翹散及其拆方對流感病毒感染小鼠肺指數的影響(±s,n=10)Table 1 Effect of YQS and its recipes on lung index of mice infected with PR8 virus (±s,n=10)

表1 銀翹散及其拆方對流感病毒感染小鼠肺指數的影響(±s,n=10)Table 1 Effect of YQS and its recipes on lung index of mice infected with PR8 virus (±s,n=10)

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) 肺指數 肺質量抑制率/%對照 － 0.74±0.05 －模型 － 1.51±0.15## －利巴韋林 0.082 5 1.01±0.16** 65.05銀翹散 3.09 1.33±0.11* 23.86君藥 1.00 1.37±0.17 17.91臣藥 0.83 1.25±0.16* 33.41佐藥 0.70 1.45±0.17 8.24使藥 0.56 1.37±0.15 18.17

通過以上結果發現，利巴韋林和銀翹散臣藥的藥效優于銀翹散全方，故針對對照組、模型組、利巴韋林組和臣藥組小鼠的肺臟進行了病理分析。肺臟病理檢測（HE 染色）顯示，對照組小鼠肺臟可見清晰肺泡；肺泡、支氣管內無任何細胞浸潤，支氣管壁絨毛排列整齊。模型組小鼠（PR8 流感病毒感染）肺泡腔縮小，甚至塌陷，支氣管中可見白細胞聚集，支氣管壁絨毛細胞排列雜亂。經利巴韋林和臣藥治療的小鼠肺臟仍可見大量完好的肺泡，支氣管壁絨毛排列整齊，白細胞浸潤減少；利巴韋林組肺泡內仍可見因紅細胞從血管漏出引起的水腫。見圖1。

3.2 對流感病毒感染小鼠肺臟NK 細胞激活性受體Ly-49D、Ly-49H 含量的影響

與正常C57BL/6J 小鼠相比，PR8 流感病毒感染小鼠后使NK 細胞激活性受體Ly-49D、Ly-49H在肺臟的含量顯著降低（P＜0.01）。經利巴韋林、銀翹散、君藥、臣藥、佐藥和使藥治療后，各組小鼠肺臟2 種受體含量均明顯增加，除佐藥組外，與模型組相比，其余各組差異顯著（P＜0.05、0.01），見表2。結果顯示，各藥物誘導2 種受體表達的作用由強到弱依次為臣藥＞使藥＞銀翹散＞君藥＞佐藥。各組小鼠肺臟NK 細胞激活性受體Ly-49D和Ly-49H 流式圖見圖2。

圖1 臣藥對流感病毒PR8 感染小鼠肺臟病理的影響 (HE 染色，×200)Fig.1 Effect of Ministerial drug on pulmonary pathology in mice infected with influenza virus PR8 (HE staining,× 200)

表2 銀翹散及其拆方對流感病毒感染小鼠肺臟NK 細胞激活性受體Ly-49D、Ly-49H 含量的影響 (±s,n=3)Table 2 Effects of YQS and its recipes on content of Ly-49D and Ly-49H in lungs of mice infected with PR8 virus(±s,n=3)

表2 銀翹散及其拆方對流感病毒感染小鼠肺臟NK 細胞激活性受體Ly-49D、Ly-49H 含量的影響 (±s,n=3)Table 2 Effects of YQS and its recipes on content of Ly-49D and Ly-49H in lungs of mice infected with PR8 virus(±s,n=3)

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) Ly-49D+/% Ly-49H+/% Ly-49D+Ly-49H+/%對照 － 5.07±0.10 4.82±0.89 2.71±0.54模型 － 0.74±0.35## 1.27±0.17## 0.43±0.21##利巴韋林 0.082 5 4.57±0.51** 4.40±0.83** 2.67±0.34**銀翹散 3.09 3.17±0.23** 2.59±0.84 1.55±0.51*君藥 1.00 2.47±0.24** 2.23±0.48* 1.30±0.38*臣藥 0.83 3.39±0.46** 3.07±0.09** 1.71±0.12**佐藥 0.70 2.57±1.20 2.43±1.01 1.36±0.61使藥 0.56 2.97±0.52** 3.05±0.46** 1.70±0.29**

圖2 各組小鼠肺臟NK 細胞激活性受體Ly-49D 和Ly-49H 流式圖Fig.2 Flow diagram of NK cell activating receptors Ly-49D and Ly-49H in mouse lung of each group

3.3 對流感病毒感染小鼠肺臟NK 細胞毒性受體NKp46 含量的影響

實驗中首先分選出CD3e 陰性（CD3e-）細胞，即排除T 淋巴細胞。在CD3e-細胞群中，CD49b陽性（CD49b+）的細胞即為NK 細胞。NKp46 是NK 細胞表面的1 個激活性受體，主要介導細胞毒性反應。正常C57BL/6J 小鼠肺臟表達一定量的NKp46 受體。當PR8 流感病毒感染C57BL/6J 小鼠后，小鼠肺臟NK 細胞表面NKp46 受體的含量出現減少的現象。通過小鼠肺臟NK 細胞激活性受體L49D/H 的檢測對各藥物活性進行初篩，發現臣藥的藥效最好，因此選擇臣藥和銀翹散進一步進行小鼠肺臟NK 細胞毒性受體NKp46 含量的檢測。經銀翹散和臣藥治療的PR8 病毒感染小鼠，NKp46 受體含量均高于模型組，且臣藥組效果優于銀翹散組。抗病毒陽性藥物利巴韋林不能改善因病毒感染引起的肺臟NK 細胞NKp46 受體含量減少的現象（圖3）。

圖3 銀翹散及其拆方對流感病毒PR8 感染小鼠肺臟NK 細胞細胞毒性受體NKp46 含量的影響 (±s,n=3)Fig.3 Effect of YQS and its recipes on expression of cytotoxic receptor NKp46 in pulmonary NK cells of mice infected with influenza virus PR8 (±s,n=3)

3.4 對流感病毒感染自然殺傷細胞轉錄組的影響

3.4.1 主成分分析和聚類分析 主成分分析能有效展示基因表達差異對樣本的影響；基因表達相似的樣本距離近，說明樣本相似。聚類分析通過計算樣本之間的距離，考察樣本之間的相似性。如圖4 所示，對照組、模型組、臣藥組和銀翹散組，同一組別的樣本距離相近，不同組之間在距離上能夠區分開來；不同處理方法引起NK-92MI 細胞mRNA 表達不同。

3.4.2 差異基因GO 富集分析 在得到差異基因后，從分子和細胞水平，根據基因的功能，將功能相似的基因富集為一類。目前GO 分析有3 個亞類，包括生物過程（如信號轉導）、分子功能（如酶活性）和細胞成分（如核糖體）。每個亞類根據功能不同劃分出不同條目。在GO 富集分析中，在差異最顯著的前30 條上調基因條目中，銀翹散組和臣藥組有16個條目相同；相同條目中，臣藥組上調基因不僅涵蓋了銀翹散組中表達上調的基因，而且上調基因種類比銀翹散組更廣泛。具體條目和基因名稱見表3和圖5。在相同上調基因中，DDIT3、JUN、FOS、EGR1、EGR2、ATF、AREG、TNFAIP3、PPP1R15A、ZFP36L110 個基因出現頻次較高，這些基因主要參與細胞生長和凋亡過程。不同上調基因條目見表4。

圖4 H3N2 流感病毒感染NK-92MI 細胞轉錄組數據主成分分析 (A) 及聚類分析 (B)Fig.4 Principal component analysis (A) and cluster analysis (B) of cell transcriptome data of NK-92MI infected with H3N2 influenza virus

表3 GO 富集分析中臣藥和銀翹散組相同上調的基因Table 3 Same up-regulated genes in Ministerial drug and YQS group based by GO enrichment analysis

圖5 銀翹散和臣藥組相同上調基因條目中基因維恩圖Fig.5 Venn diagram of genes in same up-regulated genes items of Ministerial drug and YQS groups

表4 GO 富集分析中銀翹散和臣藥組不同上調基因條目Table 4 Different up-regulated gene entries in Ministerial drug and YQS groups based on GO enrichment analysis

在GO 富集分析的下調基因條目中，臣藥組富集到30 個條目，銀翹散組僅富集到10 個條目，具體基因條目見表5。其中僅nucleus 條目與臣藥組相同，臣藥下調該條目中的51 個基因（FOXD4L1、EID3、SSH3、CCNE1、CENPBD1、SYCP3、PER3、CDKN2C、HSPA1B、PHF13、HEXIM1、FIGNL2、TREX2、ZNF296、ZBED1、UBC、H2AFX、CBX2、NFKBIE、RBM14、TUBB2A、HSPA5、TUBB4B、FEN1、FBXO43、FAM71F2、CABYR、EID2B、TEF、GADD45B、ATF5、BCL9L、CEMIP、MYLK2、ZCCHC5、PHF7、SERTAD3、FOXD2、FOXD4、TUBA1C、IMP3、TIGD1、TIGD3、TIGD4、TBR1、FOXJ1、DYRK3、ZFC3H1、UTP3、RARG、HIST1H2AG），銀翹散僅下調該條目中的5 個基因（FOXD4L1、EID3、SSH3、TRIM22、AKAP17A）。

3.4.3 差異基因KEGG 富集分析 利用KEGG 數據庫對差異基因進行信號通路（pathway）分析，可以找到富集差異基因的pathway 條目，尋找不同樣本的差異基因可能與哪些通路的改變有關。在富集的差異最顯著的前20（Top 20）條信號通路中，銀翹散組和臣藥組有13 條通路重合，見表6。相同信號通路所涉及到的上調基因，臣藥組基本囊括了銀翹散組的上調基因，且臣藥組上調的基因數目比銀翹散組多（圖6）。臣藥和銀翹散組富集到的不同信號通路見表7。

在KEGG 富集到的Top 20 下調信號通路中，銀翹散組僅富集到17 條信號通路；其中，僅necroptosis信號通路同時被銀翹散和臣藥調節，見表8。

表5 GO 富集分析中銀翹散和臣藥組下調基因條目Table 5 Down-regulated gene entry in Ministerial drug and YQS groups based on GO enrichment analysis

表6 KEGG 富集分析中銀翹散和臣藥組相同上調信號通路及基因Table 6 KEGG enrichment analysis of same up-regulated signal pathways and genes in Ministerial drug and YQS groups

圖6 銀翹散和臣藥組相同上調信號通路中基因的維恩圖Fig.6 Venn diagram of genes in same up-regulated signal pathway of Ministerial drug and YQS groups

表7 KEGG 富集分析中銀翹散和臣藥組不同上調信號通路Table 7 Different up-regulated signal pathways in Ministerial drug and YQS groups based on KEGG enrichment analysis

表8 KEGG 富集分析中銀翹散和臣藥組下調信號通路（前20）Table 8 Down-regulated signal pathways (Top 20) in Ministerial drug and YQS groups based on KEGG enrichment analysis

4 討論

本研究顯示，銀翹散及其拆方治療病毒性肺炎藥效強度為臣藥＞銀翹散＞使藥＞君藥＞佐藥，藥效強度并非與君、臣、佐、使的中藥配伍理論完全一致。金銀花和連翹為君藥，疏散風熱、清熱解毒、避穢化濁；臣藥薄荷和牛蒡子疏散風熱、清利頭目、解毒利咽，荊芥穗和淡豆豉發散解表；佐藥淡竹葉、蘆葦根清熱生津，桔梗宣肺止咳；生甘草調和諸藥，又合桔梗利咽止咳，為佐使之用[7]。從銀翹散的方解可以看出，金銀花和連翹的功效相當于現代藥理學中抗病毒、抗菌的作用，而解熱作用略微。薄荷、牛蒡子、荊芥穗和淡豆豉構成的臣藥組，其功效涵蓋了現代藥理學的解熱、抗病毒、抗菌的作用。淡竹葉、蘆葦根和桔梗都有解熱作用，桔梗還具有鎮咳的作用[8]?，F代藥理學研究表明生甘草的作用較為廣泛，包括免疫增強、抗病毒、抗菌、抗炎、鎮咳、祛痰等作用[9-10]。采用現代藥理學方法對中藥復方的配伍進行探究，能夠明確各配伍組分對復方整體藥效的貢獻程度。

NK 細胞在清除流感病毒中發揮著關鍵作用。人類NK 細胞表面存在2 類受體：激活性受體（killer activating receptor，KAR）和抑制性受體（killer inhibiting receptor，KIR），它們分別介導NK 細胞的激活和抑制。與人類NK 細胞相似，小鼠NK 細胞表面也存在這2 類受體。研究證實[11]，小鼠感染流感病毒后，Ly-49 抑制性受體（Ly-49I 和Ly-49Q）缺陷的小鼠比野生型小鼠存活時間更長；而當回補表達Ly-49I 和Ly-49Q 受體后，小鼠又恢復了對流感病毒的敏感性。提示NK 細胞參與流感病毒的疾病過程，Ly-49 受體直接參與了NK 細胞清除流感病毒的免疫應答效應。

Ly-49 基因家族受體主要表達在小鼠NK 細胞，是C 型凝集素超家族成員之一。Ly-49D 是Ly-49 家族中第一個被證實傳遞激活性信號的蛋白分子[12-13]，屬于KAR 類受體，Ly-49D 受體介導的生物學效應是促進NK 細胞活化，進而促使NK 細胞發揮殺傷效應。PR8 流感病毒感染顯著下調Ly-49D 受體介導的促炎細胞因子和趨化因子的產生[14]。

Ly-49H是Ly-49 家族的另一個激活性受體，其激活效應由NK 細胞表面的跨膜接頭蛋白DAP12（DAP12 的胞質域含有免疫受體酪氨酸激活基序）介導。Ly-49H 的抗病毒效應最早發現于小鼠巨細胞病毒（murine cytomegalovirus，MCMV）。表達Ly-49H 受體的轉基因小鼠更不易感染MCMV[15]。當 Ly-49H-DAP12 受體復合物突變的小鼠感染MCMV 時，脾臟病毒滴度增加30～40 倍，肝臟病毒滴度增加2～5 倍，且肝臟NK 細胞產生γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的比例降低了（56.00±0.22）%，說明Ly-49H的正?；罨瘜σ种芃CMV具有重要作用[16]。有研究還發現，Ly-49H 受體表達呈陽性的NK 細胞會在小鼠淋巴組織和非淋巴組織存在數月；在MCMV 感染小鼠的恢復期，當再次感染MCMV 時，Ly-49H 受體表達呈陽性的NK 細胞會被重新激活，并迅速發生脫顆粒、釋放細胞因子[17]。這打破了人們對NK 細胞在傳統意義上的認識：NK細胞不僅參與抗病毒反應的固有免疫應答，而且同樣參與了獲得性免疫應答。關于Ly-49H 受體在流感病毒中的作用，目前還未見相關文獻報道。本研究中，PR8 流感病毒的感染使Ly-49H 受體在肺臟的含量降低，經抗病毒藥物利巴韋林和銀翹散及其拆方（臣藥、使藥、君藥和佐藥）治療后，Ly-49H受體含量均升高；而且，這些藥物對流感病毒PR8感染引起的小鼠肺炎有抑制作用。上述藥物對肺炎的抑制作用和對肺臟中Ly-49D、Ly-49H 含量的促進作用基本一致，其作用強度均為臣藥＞銀翹散/使藥＞君藥＞佐藥。說明上述藥物對病毒性肺炎的抑制作用越強，NK 細胞激活性受體（L-49D和Ly-49H）在肺臟中的含量也越高。

NK 細胞的細胞毒效應是NK 細胞殺傷靶細胞的重要途徑，該效應主要由細胞毒性受體介導。人類主要有3 種細胞毒性受體：NKp30、NKp44 和NKp46。小鼠NK 細胞的細胞毒性反應由NKp46 介導；小鼠的NKp46 又稱作NCR1（natural cytotoxicity receptor 1）。NKp46 識別流感病毒血凝素[18]，使NK細胞能夠識別病毒感染的細胞，進而損傷靶細胞，防止流感病毒感染宿主細胞[19]。有研究者采用綠色熒光蛋白（green fluorescent proteins，GFP）報告基因標記的NKp46 受體示蹤NK 細胞，發現在小鼠感染流感病毒PR8 后的5 d 內，肺臟、血液、脾臟和骨髓均觀察到GFP，且肺臟中GFP 數量最多，感染第5 天的數量高于前4 d；并證明NKp46 對于體內流感病毒的清除發揮了關鍵作用[20]。本研究中，小鼠肺臟中NKp46 受體因感染PR8 流感病毒含量降低，銀翹散和臣藥均能增加NKp46 受體的含量，這可能是銀翹散和臣藥抑制小鼠感染PR8病毒引起肺炎的作用途徑之一。

本研究分別從藥效學（肺質量抑制率）和作用機制（NK 細胞激活性受體和細胞毒性受體）2 方面證實：銀翹散中臣藥（薄荷、牛蒡子、淡豆豉、荊芥穗）的藥效與銀翹散全方相似，且略優于銀翹散。這為銀翹散的精簡提供了現代藥理學依據，臣藥可以作為一個獨立的復方用于流感病毒引起的感冒的治療。為了進一步探究臣藥優于銀翹散的原因，本實驗建立了人流感病毒HK8 感染人NK 細胞株NK-92MI 的細胞模型，分別以銀翹散和臣藥進行干預，分析藥物對NK 細胞轉錄組的影響。

銀翹散顯著上調的基因在臣藥組也同樣顯著上調；且很多基因在臣藥治療后上調，而銀翹散不能顯著上調這些基因（圖5）。如對細胞表面成分的影響，銀翹散上調6 個基因（VCAM1、SLC3A2、HRG、AREG、KCNE2、SLC7A11），而臣藥同時還上調VEGFA、HBEGF、TIGIT3 個基因。T 細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸基抑制基序結構域（ T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain，TIGIT）是一種新型的抑制性受體，在T 細胞和NK 細胞上均有表達。TIGIT 編碼的蛋白有助于輔助性T 細胞和樹突狀細胞之間的相互作用，以調節T 細胞依賴的B細胞的反應。TIGIT 雖被定義為抑制性受體，但研究表明，NK 細胞上TIGIT 受體表達陽性的野生型小鼠對各種刺激的反應增強，而TIGIT 受體缺陷會損害 NK 細胞的“missing-self”識別功能。TIGIT-CD155 信號通路能夠使NK 細胞更好地作為效應細胞參與到免疫應答反應中，而這一通路是不依賴于主要組織相容性復合體 I （ major histocompatibility complex I，MHC I）類分子的新的NK 細胞激活的途徑[21]。

再如有關分子功能的“RNA polymerase II regulatory region sequence-specific DNA binding”條目，銀翹散顯著上調4 個基因（EGR1、ATF3、NR4A2、NR4A3），而臣藥除上調這4 個基因外，同時還上調GLIS1、CREBRF、BCL6、CREM、FOSL2、ARID5B6 個基因。如 cAMP 反應元件調節子（cAMP responsive element modulator，CREM）編碼的蛋白是一種轉錄因子，能夠結合病毒中的環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）響應元件，而且它是細胞因子生成重要的調節因子[22]。FOS 相關抗原2（Fos-related antigen 2，FOSL2）編碼的蛋白是亮氨酸拉鏈蛋白，它可以與JUN 家族的蛋白形成二聚體，從而形成轉錄因子復合物AP-1，主要參與細胞增殖、分化和轉化的調節。研究報道，FOSL2是一個新穎的參與NK 細胞成熟和功能發揮的轉錄因子[23]。富含AT 序列的相互作用結構域蛋白5B（AT-rich interactive domain-containing protein 5B，ARID5B）的編碼產物是DNA 結合蛋白，它是一個富含AT 的結構域。研究顯示，降低NK-92MI 細胞中ARID5B的表達，會引起細胞中線粒體氧化代謝損傷和電子傳遞鏈相關基因表達下調，進一步表現出細胞生存受損和IFN-γ 生成減少；相反，過表達ARID5B后，NK-92MI 細胞氧化代謝和IFN-γ 的生成均增加[24]。對于GO 分析中富集到的下調基因，臣藥富集到30 個條目，銀翹散僅富集到10 個條目（表5）；說明臣藥對NK 細胞的作用位點遠多于銀翹散。

在KEGG 富集分析的TOP20 上調信號通路中，臣藥和銀翹散有13 條信號通路相同，且臣藥上調的基因不僅包含銀翹散上調的基因，還富集到其他基因（圖6）。另外，對于相同信號通路，臣藥和銀翹散也出現不同的調節方式。如雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路，銀翹散對該通路表現為顯著上調（表7），而臣藥對該通路表現為顯著下調（表8）；且富集到的基因也不同，銀翹散上調SESN2、SGK1、SLC3A23 個基因，臣藥下調FZD2、TNF、WNT10B3 個基因。

由此推測臣藥和銀翹散在轉錄水平對NK 細胞中基因的調節作用相似，但臣藥的作用更為廣泛。臣藥的調節作用不僅涵蓋了銀翹散的全部作用，涉及到的作用點還比銀翹散更為廣泛，這或許是臣藥藥效與銀翹散相似的一個重要原因。

綜上所述，本研究首先從藥效學和效應相關機制證明，對于流感病毒感染小鼠引起的肺炎，臣藥的治療作用與銀翹散相似，且略優于銀翹散；并證明該藥效與NK 細胞活性增強相關。進一步采用轉錄組學分析得知，臣藥對NK 細胞中基因的調節作用比銀翹散更為廣泛。本研究為銀翹散的拆方研究提供研究思路，亦為其組分臣藥作為一個獨立的復方、替代銀翹散用于臨床提供實驗依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突