一測多評法測定板藍根中6種化學成分的含量

黃 遠，董福越，李楚源，王德勤

廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州 510515

板藍根為十字花科植物菘藍Isatis in digoticaFortune 的干燥根，主要含有木脂素類、生物堿類、核苷類等活性成分，具有清熱解毒、涼血利咽的功效[1]。現代藥理學研究表明，木脂素（lignan）具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和保肝等多種藥理活性和重要的應用價值[2-9]。核苷（nucleoside）是中成藥抗病毒的活性成分[10-13]，在板藍根藥材中含量較高且易溶于水，對板藍根及其制劑的療效和質量影響較大；板藍根的生物堿類（alkaloids）成分能夠抗炎、抗病毒、解熱[14]。然而，現行《中國藥典》板藍根的含量測定項下僅采用HPLC 測定水提液中的(R,S)-告依春的含量作為質量控制指標，對板藍根尚未建立完善的質量控制方法[15-16]。因此，多成分、多指標的控制方法對評價功效多樣、成分復雜的板藍根的質量研究有重要意義[17-21]。本研究采用一測多評（QAMS）技術，選取價廉易得的生物堿類化合物(R,S)-告依春作為參照物，建立其與木脂素類化合物直鐵線蓮寧B 以及核苷類化合物胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷的相對校正因子，實現通過只測定板藍根的(R,S)-告依春的含量，用校正因子計算出另外5 種木脂素類和核苷類成分的含量，從而簡便快捷、全面準確地對板藍根進行多指標的質量評價，有助于保證該產品的質量可控和療效穩定，同時節約檢測成本和時間。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；UltiMate 3000 系列高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific Technologies 公司）；Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；色譜柱Agilent ZORBAX-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜柱Waters Xbridge-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；色譜柱Phenomenex Kinetex-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；BT 214D 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；CP225D 型電子分析天平（Sartorius AG 公司）

圖2 混合對照品 (A) 與板藍根樣品 (B) 的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed references (A) and sample (B)

1.2 試藥

對照品(R,S)-告依春（批號111753-201706，質量分數為99.9%）、尿苷（批號110887-201803，質量分數為99.5%）、鳥苷（批號111977-201501，質量分數為93.6%）、腺苷（批號110879-201703，質量分數為99.7%）均由中國食品藥品檢定研究院提供，胞苷（批號B20073，質量分數為98%）由源葉生物有限公司提供，直鐵線蓮寧B（批號hysC201811，質量分數為99%）由廣州呼研所制藥有限公司提供。甲醇（色譜純，美國Tedia 公司），甲醇（分析純，廣州化學試劑廠），水為超純水。

板藍根（批號1807003、1805015、1808008、1805011、1805012、1805013、18wdct、18bjz、18nm、18dtly、18mLsb、18gjwzc、1805010、1806004、18nxgy、2017dq、1805014、18dtxh、18mLxt、18esyc、18dsc、18ftkfq、18gfc）由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為水（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～3 min，3% B；3～20 min，3%～8%B；20～25 min，8%～22% B；25～35 min，22%B；35～36 min，22%～25% B；36～48 min，25%B；48～50 min，25%～90% B；50～60 min，90%B；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254、230 nm；進樣體積10 μL。色譜圖見圖1。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取 (R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷對照品適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含(R,S)-告依春質量濃度為 28.96、57.92、115.8、289.60、579.20 μg/mL，直鐵線蓮寧 B 質量濃度為 3.2、6.4、12.7、25.4、63.6 μg/mL、胞苷質量濃度為2.2、4.3、8.6、17.3、43.2 μg/mL，尿苷質量濃度為3.8、7.7、15.4、30.7、76.8 μg/mL，鳥苷質量濃度為3.8、7.8、15.5、31.0、77.6 μg/mL 和腺苷質量濃度為2.8、5.6、11.2、22.4、56.0 μg/mL的混合對照品溶液，并于 4 ℃冰箱中避光保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取板藍根藥材1 g（過60 目篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入5%甲醇溶液25 mL，稱定質量，超聲提取（40～50 ℃，250 W，80 kHz）1 h，放冷，稱定質量，用5%甲醇補足超聲過程減失的質量，濾過，取續濾液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系考察 分別精密吸取6 個系列濃度的混合對照品溶液，各 10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，測定各對照品的峰面積，取平均值。以各溶液質量濃度（X）對峰面積積分值（Y）進行回歸處理，得(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧 B、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷的線性方程和相關系數（R2）。結果表明，各對照品的進樣量與峰面積均呈良好的線性關系（表1）。

表1 6 種成分的線性回歸方程Table 1 Linear regression equations of six components

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下條件，連續進樣6 次。結果顯示在230 nm 下，(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B 的RSD 分別為0.33%、0.58%；在254 nm下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷的RSD分別為0.35%、0.58%、0.45%、0.41%、0.45%。

2.4.3 重復性試驗 取批號為1808008 的板藍根藥材，按照“2.3”項平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”項下條件，進行測定，在254 nm 下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷的RSD 分別為0.81%、1.56%、1.96%、1.65%、3.15%；在230 nm下(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B 的RSD 分別為1.04%，1.79%。

2.4.4 穩定性試驗 取批號為1808008 的板藍根藥材，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，于0、8、12、16、20、24 h，按“2.1”項下條件進樣測定，在254 nm 下(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷的RSD 分別為0.85%、1.88%、1.36%、0.87%、6.84%；在230 nm 下，(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B 的RSD 分別為0.5%、1.72%。腺苷的峰面積在不同時間段波動較大，說明板藍根供試品溶液中(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷在室溫放置24 h 內穩定性良好，但是腺苷不穩定。

2.4.5 加樣回收試驗 取已測定的樣品（批號1808008）9 份，精密稱定，分別精密加入相當于供試品中待測成分含量的50%、100%、150%的混合對照品溶液，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算得到(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷和鳥苷的平均加樣回收率分別為 98.25%、99.57%、100.53%、102.29%、102.59%、99.30%，RSD 分別為 2.25%、2.45%、3.35%、1.62%、2.96%、2.79%。結果見2。

2.5 相對校正因子（fk/m）的建立

精密吸取混合對照品溶液5、10、15、20、30 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，每個濃度分別進樣3 次，取平均值，記錄各對照品的色譜峰面積，根據fk/m計算公式[2-3]。計算待評價成分直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷的相對校正因子（表2）。

fk/m＝fk/fm＝(Wk×Am)/(Wm×Ak)

Wk為(R,S)-告依春內標物的含量，Ak為(R,S)-告依春內標物的峰面積，Wm為被測指標組分m的含量，Am為被測成分m的峰面積

2.6 fk/m 的耐用性評價

2.6.1 不同色譜柱對fk/m的影響 取“2.2”項下的混合對照品溶液，分別精密吸取10 μL，采用Agilent C18色譜柱，分別在Agilent 1260、Agilent 1100、Waters2695-2996 高效液相色譜儀上進樣檢測，求算以(R,S)-告依春作為參照成分時，5 種成分的fk/m，結果說明fk/m在使用不同儀器時的耐用性良好，結果見表3。

考察了Agilent ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Kinetex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）共3 種色譜柱對各成分fk/m的影響。使用以上色譜柱各成分均能達到較好的分離效果，結果胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷、直鐵線蓮寧 B 的 RSD 依次為 2.69%、3.41%、3.15%、3.09%、2.60%。表明色譜柱的更換對各成分fk/m無顯著影響（表3）。

表2 5 種成分的fk/mTable 2 Relative correction factors (fk/m) of five components

表3 不同色譜柱對fk/m 的影響Table 3 fk/m of different columns

2.6.2 不同流動相體積流量對fk/m的影響 考察了不同體積流量（1.0、1.1、1.2 mL/min）對各成分fk/m的影響。結果表明（表4），各成分的RSD 依次為1.30%、0.33%、0.79%、1.00%、2.16%。表明體積流量的波動對各成分fk/m無明顯影響。

2.6.3 不同儀器對fk/m的影響 考察了不同儀器（安捷倫1260、戴安U-3000、沃特世2695）對各成分fk/m的影響，結果（表5）各成分的RSD%依次為2.91%、3.11%、3.32%、4.16%、3.09%。表明儀器的更換對各成分fk/m無顯著影響。

表4 不同體積流量對fk/m 的影響Table 4 fk/m factor of different flow rates

表5 不同儀器對fk/m 的影響Table 5 fk/m of different instruments

2.7 色譜峰定位參數考察

為了在僅采用(R,S)-告依春為對照品時，能夠確認直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷色譜峰的位置，從而通過獲得的相對校正因子同時計算另外5 種成分的含量，達到一測多評的目的，考察了采用不同儀器、不同色譜柱和不同實驗人員時直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷和 (R,S)-告依春色譜峰之間的保留時間差和相對保留時間2 個參數。考察結果發現，另外5 種成分和參照物 (R,S)-告依春之間的保留時間差波動較大，而相對保留時間波動較小，RSD 均小于5%（表6、7）。因此，可利用相對保留時間進行定位。

表6 不同因素對保留時間差值的影響Table 6 Influence of different factors on retention time difference

表7 不同因素對相對保留時間的影響Table 7 Influence of different factors on relative retention time

2.8 QAMS 法與外標法結果比較研究

采用了HPLC法，以(R,S)-告依春作為“一測多評”的參照成分，測定其在板藍根中的含量，并通過測得的直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷的fk/m，分別計算出這5 種成分的含量。同時，使用外標法測定了板藍根中(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷的含量，將外標法測定含量與QAMS 法計算的含量采用相對偏差法進行比較，從而驗證QAMS 法用于測定板藍根中的多種類成分測定的準確性（表8）。

表8 QAMS 法與外標法測定26 批藥材中6 種成分的比較Table 8 Comparison of determination of six components in 26 batches of medicinal materials by QAMS and ESM

3 討論

3.1 測定波長的選擇

本研究測定的化學成分種類較多，包括核苷類、生物堿類和木脂素類，共6 種化合物。采用DAD 全波長掃描對照品溶液，分別對(R,S)-告依春、直鐵線蓮寧B、胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷進行紫外波長掃描。結果顯示，(R,S)-告依春和胞苷、尿苷、鳥苷、腺苷在254 nm 處同時有較大吸收，(R,S)-告依春和直鐵線蓮寧B 在230 nm 處同時有較大的吸收，且干擾少，峰形良好，基線平穩，因此檢測波長最終設定為254 nm 和230 nm。

3.2 內標物和質量控制指標的選擇

現有QAMS 法測定(R,S)-告依春和核苷類成分的研究[1]，但是該方法選擇腺苷作為內標物，測定了(R,S)-告依春、鳥苷、尿苷、胞苷的含量。本研究發現腺苷并不穩定，不適合作為內標物和質量控制指標成分；而其他核苷類成分和(R,S)-告依春較穩定，板藍根中另一關鍵抗病毒性成分直鐵線蓮寧B 亦有良好的穩定性，均可作為質量控制指標成分；且(R,S)-告依春與其他5 種成分都可實現同波長下的較大吸收。因此，本研究選擇(R,S)-告依春為內標物，結果顯示各成分的相對校正因子穩定，重現性良好。

3.3 QAMS 法用于板藍根質量控制的合理性

本研究的相對標準偏差表明，外標法和QAMS 法計算的含量相似性極高，表明2 種含量測定方法計算得到的含量值之間無顯著性差異。此外，在不同高效液相色譜儀、不同色譜柱等條件下均有良好的重復性。板藍根中化學成分眾多，以外標法測定各成分含量需要對照品的數量多，部分對照品價格昂貴且難以獲取，采用QAMS 法測定各成分含量能極大的減少對照品使用數量，節約成本，增加檢測便利性。因此，QAMS 法用于板藍根質量控制具有極高的實用性、便利性和科學性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突