生長停滯特異性蛋白6在人牙周膜細胞遷移及成骨分化中的作用

張勝男，安 娜，歐陽翔英△，劉穎君，王雪奎

(北京大學口腔醫學院·口腔醫院，1.牙周科，2.綜合二科 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室 口腔數字醫學北京市重點實驗室，北京 100081)

牙周炎是由菌斑微生物引起的牙齒周圍支持組織的慢性感染性疾病，最終導致牙周膜纖維破壞、臨床附著喪失及牙槽骨吸收。牙周組織再生是具有分化潛能的細胞分化，進一步形成新的牙槽骨、牙骨質及牙周膜。牙周膜細胞可以產生和分泌細胞外基質成分，如膠原蛋白，形成牙周韌帶及纖維，以固定牙骨質與牙槽骨的連接，并使牙周韌帶在損傷后得以再生[1]。除了產生膠原外，牙周膜細胞還可產生礦化組織，表達高水平的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和成骨相關蛋白，形成礦化結節[2]。在不同藥物或物理刺激的研究中，牙周膜細胞因其潛在的多向分化能力而被廣泛應用，以促進牙周再生[3-6]。

生長停滯基因于1988年被發現，因在饑餓的小鼠成纖維細胞中高度表達而得名[7]，生長停滯特異性蛋白6(growth arrest-specific protein 6，Gas6)是其中的第6個成員，是一種相對分子質量為75×103的分泌蛋白，屬于維生素K依賴蛋白家族[8]。本課題組前期關注了Gas6及其受體在心血管疾病中的作用，發現Gas6可以抑制牙齦卟啉單胞菌脂多糖引起的人臍靜脈內皮細胞炎癥因子的表達[9]。也有其他研究發現Gas6的主要受體——AXL受體酪氨酸激酶(AXL)與血管內皮中的周細胞(pericytes)成骨分化有關，且AXL在周細胞成骨分化過程中的表達受到調控[10]。Gas6在骨細胞中也有廣泛表達[11]。此外，Gas6還可促進微血管內皮細胞、神經細胞、上皮細胞等多種細胞遷移及增殖[12-13]。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人牙周膜細胞(human periodontal ligament cell，hPDLCs)購自上海賽百慷公司(產品編號：HUM-iCell-m001)，完全α-MEM培養基購自美國Sciencell公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，成骨誘導液(組分：維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉)購自美國Sigma公司，培養皿購自美國Corning公司，細胞增殖檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自日本Dojindo公司，脂質體轉染試劑購自美國Invitrogen公司，ALP染色試劑盒購自中國碧云天公司，rhGas6購自Sino Biological 公司，RNA提取劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司，Universal SYBR Green master mix試劑購自美國Roche公司。siRNA由上海吉瑪基因設計，PCR引物由六合華大基因合成。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 hPDLCs自購得后加入完全α-MEM培養基[含10%(體積分數)胎牛血清、105IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素]，培養于10 cm培養皿，恒溫培養箱[37 ℃，5%(體積分數)CO2]培養至3～7代用于后續研究。

1.2.2細胞增殖實驗 將hPDLCs懸液100 μL接種于96孔培養皿中，2×103個/孔，孵箱孵育24 h后加入不同濃度的rhGas6，分別于0、24、48、72 h后加入10 μL CCK-8試劑，繼續孵育1 h后取培養基至另一96孔板中，酶標儀450 nm處測光密度。

1.2.3細胞劃痕實驗 將hPDLCs接種于96孔板中培養，細胞長滿后加入不同濃度的rhGas6，于實時無標記細胞分析儀下做劃痕，分別于24、48、72 h后拍照記錄。收集各重復組的圖像，應用ImageJ 9.0 軟件對愈合面積百分比進行計算。

1.2.4Transwell細胞遷移實驗 將hPDLCs接種于24孔直徑3 μm Transwell小室中(2×104個細胞/孔)， 上室為無血清培養基100 μL，下室為含800 μg/L rhGas6完全培養基500 μL，24 h后棄培養基，4%(質量分數)多聚甲醛固定液室溫固定30 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，0.1%(質量分數)結晶紫溶液37 ℃染色5 min，PBS沖洗3次，顯微鏡下觀察小室薄膜下方細胞并拍照計數。

1.2.5成骨誘導 將hPDLCs接種于6孔板(2×104細胞/ cm2)中，匯合至70%后更換成骨誘導培養基(α-MEM，50 mg/L維生素C，50 mg/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)并加入不同濃度的rhGas6，誘導5 d。

1.2.6轉染實驗 按照Lipo3000轉染試劑說明書，使用siRNA敲低hPDLCsGas6表達水平，方法如下：按每孔5 μL Lipo3000轉染試劑加入含125 μL Opti-MEM培養液的EP管A中，震動混合2～3 s。將5 μg的siRNA加入含125 μL Opti-MEM培養液的EP管B中，輕輕混合。陰性對照組使用隨意片段的siRNA。將EP管B中的液體加入EP管A，輕輕混勻，室溫靜置15 min，形成轉染復合體，加入培養孔，培養基補足至2 mL，過夜后棄去培養基，PBS沖洗3次，更換為成骨誘導培養液繼續培養。

1.2.7ALP染色 12孔板中轉染細胞在成骨誘導培養基下培養至7 d、14 d，棄培養液，使用PBS沖洗3次；使用4%多聚甲醛固定液室溫固定30 min；按試劑盒說明書配制工作液，混勻后避光保存；棄固定液，Milli-Q水沖洗，每孔加入500 μL工作液，室溫避光10～30 min。每隔5 min觀察顯色結果，達到最佳顯色結果時，及時洗凈顯色液，Milli-Q水沖洗終止顯色，待孔板風干后掃描，Image J 9.0量化分析色素點。

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1.2.8實時熒光定量PCR檢測Runx2、ALPmRNA的表達 在轉染及外源性rhGas6刺激后，分別用Trizol 試劑提取總RNA，檢測濃度后用Takara逆轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA，采用10 μL 實時熒光定量 PCR(real-time PCR)反應體系，500 ng cDNA模板。循環條件為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。每個樣本3個復孔，實驗重復3次，應用2-ΔΔCt法檢測Runx2/ALPmRNA的表達。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量 PCR 引物序列

1.3 統計學分析

使用SPSS 24.0統計軟件分析。實驗重復3次，并在圖例中具體說明。實驗數據以均數±標準差展示，兩組之間差異性檢驗使用非配對t檢驗，分組大于2組的差異性檢驗使用單因素方差分析，多組間比較采用Bonferroni法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖實驗結果

以完全培養基條件下的hPDLCs為對照組，加入濃度分別為200、400、600、800 μg/L rhGas6為實驗組，在加入刺激后0、24、48、72 h測光密度值(圖1A)。結果顯示，在加入不同濃度rhGas6后的24、48、72 h，各濃度組與對照組之間光密度值差異均無統計學意義(P>0.05)，不同濃度組間光密度差異也無統計學意義(P>0.05)，說明rhGas6對hPDLCs增殖無顯著影響。

2.2 細胞劃痕實驗結果

以完全培養基條件下的hPDLCs為對照組，加入濃度分別為200、400、600、800 μg/L rhGas6為實驗組，重復3次計算愈合面積(圖1B)。24 h后， 800 μg/L濃度組的愈合面積百分比(31.06%±13.70%)大于對照組(21.79%±9.51%)及其他濃度組，但差異無統計學意義(P>0.05)，在48、72 h各組間差異亦無統計學意義(P>0.05)。

2.3 細胞遷移實驗結果

800 μg/L rhGas6組在鏡下觀察到穿過小室膜到達下室的hPDLCs細胞數顯著多于對照組(2.53±0.15vs. 1.03±0.26，P<0.01，圖2)，說明800 μg/L濃度的外源性rhGas6能促進牙周膜細胞的遷移。

2.4 外源性rhGas6對hPDLCs Runx2以及ALP mRNA表達的影響

以正常誘導組為對照組，不同濃度rhGas6組為實驗組，成骨誘導5 d后提取總RNA，逆轉錄后real-time PCR 檢測ALP及Runx2的mRNA表達水平(圖3)。加入rhGas6后，Runx2和ALP的mRNA表達增加，并且都顯示出濃度依賴性，即隨著rhGas6的濃度增加，Runx2和ALP的mRNA表達水平逐漸增加。在800 μg/L組Runx2的mRNA表達量顯著高于對照組(1.60±0.30vs. 0.91±0.10，P<0.01)，在600、800 μg/L組ALP的mRNA表達量(1.95±0.52和2.81±0.61)均顯著高于對照組(0.86±0.12，P<0.05，P<0.001)。

圖1 加入不同濃度rhGas6后hPDLCs細胞增殖實驗(A)和細胞劃痕實驗(B)

A, control(0 μg/L rhGas6); B, 800 μg/L rhGas6; C, number of cells.

圖3 加入rhGas6后Runx2(A)、ALP(B)mRNA表達水平

2.5 Gas6基因敲低效率驗證

利用siRNA 敲低hPDLCs 的Gas6基因，以下調Gas6基因細胞組作為敲低組，轉染對照siRNA序列組為敲低對照組，提取總RNA，逆轉錄后real-time PCR 檢測Gas6基因表達水平(圖4)。結果顯示，Gas6敲低組Gas6基因表達水平顯著低于敲低對照組(0.38±0.08vs. 0.94±0.08，P<0.01)， 敲低效率為59%。

2.6 敲低Gas6基因對hPDLCs Runx2以及ALP mRNA表達情況的影響

利用siRNA 敲低hPDLCs的Gas6基因，以下調Gas6基因細胞組作為敲低組，轉染對照siRNA序列組為敲低對照組，不加任何刺激為對照組，成骨誘導5 d后提取總RNA，逆轉錄后real-time PCR檢測ALP及Runx2的mRNA表達水平(圖5)。Gas6敲低組ALP基因表達(0.39±0.07)顯著低于對照組(0.92±0.14，P<0.01)及敲低對照組(0.78±0.12，P<0.05)，但Runx2基因表達無顯著變化(P>0.05)。從反向說明Gas6基因對ALPmRNA表達具有正向調節作用。

si-CTR, si-RNA-control; si-Gas6, si-RNA-Gas6.

NC, normal control(osteogenic induction); si-CTR, si-RNA-control; si-Gas6, si-RNA-Gas6.

2.7 敲低Gas6基因對hPDLCs礦化結節形成的影響

利用siRNA敲低hPDLCs的Gas6基因，經成骨誘導后進行ALP染色以觀察礦化結節的形成，并應用ImageJ 9.0軟件進行色素量化分析(圖6)。結果可見，成骨誘導7 d后，Gas6敲低組礦化結節染色顯著低于誘導對照組(0.25±0.04vs. 1.00±0.11，P<0.001)，說明Gas6敲低組成骨礦化能力減弱；誘導14 d后，Gas6敲低組染色程度低于對照組，但差異無統計學意義(0.86±0.04vs. 1.00±0.16，P>0.05)。

3 討論

本研究發現rhGas6作為一種外源性刺激，對hPDLCs增殖無影響，能使hPDLCs的遷移能力增強，ALP、Runx2基因表達量增多，敲低Gas6基因后，ALP基因表達顯著降低，礦化結節形成能力顯著降低，從反向說明Gas6基因具有促進hPDLCsALP基因表達和礦化的作用。

Gas6是一種相對分子質量為75×103的分泌型蛋白，屬于維生素K依賴蛋白家族，通過自分泌或旁分泌發揮作用。Tyro3、AXL、Mer三者合稱為TAM受體，TAM受體是具有胞內酪氨酸激酶結構域的酪氨酸受體激酶，為單通道跨膜蛋白。Gas6結合TAM受體后激活下游信號，通過這些信號發揮生物學效應[14]。

本研究發現Gas6對hPDLCs具有促早期成骨作用。ALP、Runx2是成骨相關重要指標，Runx2是誘導不成熟骨細胞向成熟骨細胞轉化過程中的關鍵轉錄因子[15]。成骨誘導下敲低Gas6基因或加入rhGas6，牙周膜細胞ALP、Runx2基因表達和礦化結節的產生有顯著變化，能夠證明Gas6在牙周膜細胞中存在促早期成骨作用。Gas6/TAM促進其他細胞成骨的研究目前尚未見報道。然而，在心血管研究領域，Gas6/AXL具有抑制血管內皮周細胞、血管平滑肌細胞鈣化的作用。有學者報道，上調Gas6/AXL后，血管平滑肌細胞凋亡減少，血管鈣化減少[16]，利用miRNA-34a下調AXL后，血管平滑肌細胞鈣化增加[17]，礦化的血管內皮周細胞中AXL表達水平較低[10]。上述研究均提示Gas6/AXL在血管鈣化中具有抑制鈣化的作用，與本研究中Gas6促進牙周膜細胞成骨分化的作用相反，可能是由于Gas6在不同組織中的作用有所不同。

NC, normal control(osteogenic induction); si-CTR, si-RNA-control; si-Gas6, si-RNA-Gas6; ALP, alkaline phosphatase. A, 7 d；B, 14 d.

本研究中rhGas6對hPDLCs增殖無影響，但可以增強hPDLCs的遷移能力,這與其他研究中Gas6促進細胞增殖和遷移不完全一致。有研究表明，過表達Gas6后，膀胱癌細胞的增殖、遷移能力增強[13];加入rhGas6后，可以促進人視網膜微血管內皮細胞增殖、遷移[12]。Gas6蛋白激活AXL后，通過多種機制保護細胞免于凋亡，AXL磷酸化部位與胞內磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3kinase，PI3K)結合，下游蛋白激酶B(protein kinase B， Akt)抑制促凋亡蛋白Bad的活性[18]，磷酸化核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)增加抗凋亡蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表達[19]。位于AXL下游的P38蛋白(p38 MAPK)和熱休克蛋白25是肌動蛋白重構的調節因子，在神經細胞遷移中發揮重要作用[20]，PI3K/Akt、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)也是Gas6促進腫瘤細胞、微血管內皮細胞遷移的可能通路[12-13]。后續實驗將通過AXL基因敲低、Akt通路抑制劑來驗證AXL在hPDLCs遷移中的影響。

近年來不乏不同藥物、脈沖超聲等對hPDLCs成骨分化的影響及機制的研究[3, 21-22]，但實驗均建立在hPDLCs健康狀態的基礎上，炎癥條件下對hPDLCs成骨分化影響的相關研究較少。本研究關注的Gas6/AXL系統，除與細胞增殖、遷移相關外，在多種組織中均與組織細胞炎癥損傷密切相關，我們前期關注了Gas6及其受體在心血管疾病中的作用，發現Gas6可以抑制牙齦卟啉單胞菌脂多糖引起的人臍靜脈內皮細胞炎癥因子的表達[9]。觀察牙周炎癥條件下，Gas6能否促進hPDLCs遷移及成骨分化具有重要意義。

綜上所述，本研究通過敲低Gas6基因和加入外源性rhGas6，觀察到在成骨誘導培養基下，hPDLCs成骨相關蛋白的基因表達和礦化結節的產生有顯著變化，提示Gas6在hPDLCs成骨分化中發揮作用。同時外源性rhGas6作為一種刺激，對hPDLCs增殖并無影響。對于該蛋白的進一步研究有可能為牙周組織再生提供新的治療思路。