十二烷基硫酸鈉和吐溫20復(fù)配體系對(duì)姜黃素的增溶和保護(hù)作用

孔維愷忻，鄢尤奇，蔡文康，胡 新△

(北京大學(xué)藥學(xué)院1. 藥理學(xué)系，2. 藥劑學(xué)系，3. 化學(xué)生物學(xué)系，北京 100191)

姜黃素是一種多酚類物質(zhì)，存在于眾多姜科姜黃屬植物中，如姜黃、莪術(shù)、郁金等。大量實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、改善免疫功能、治療糖尿病等諸多藥理作用，應(yīng)用前景十分廣闊[1-3]。但研究人員通過(guò)對(duì)姜黃素藥動(dòng)學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素不溶于水，體內(nèi)吸收差，易代謝[4]，所以在進(jìn)一步的研究中需要思考如何合理地提高姜黃素在水中的溶解度，促進(jìn)機(jī)體吸收。萬(wàn)紅等[5]對(duì)不同的姜黃素增溶方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)以聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)為載體制備的固體分散體具有較好的增溶作用，但仍然具有藥物分散狀態(tài)穩(wěn)定度不高等缺點(diǎn)。此外，很多研究人員也使用了表面活性劑的復(fù)配體系對(duì)姜黃素進(jìn)行增溶[6-8]。不同性質(zhì)的表面活性劑之間具有協(xié)同效應(yīng)，常常具有“1+1>2”的效果，表面活性劑之間的復(fù)配有降低使用成本、提高應(yīng)用性能等優(yōu)點(diǎn)。劉調(diào)調(diào)等[8]使用十二烷基三甲基溴化銨(dodecyltrime-thylammonium bromide，DTAB)和吐溫80兩種表面活性劑的復(fù)配體系對(duì)姜黃素進(jìn)行增溶實(shí)驗(yàn)，取得了不錯(cuò)的結(jié)果，但陽(yáng)離子表面活性劑存在毒性高、生物相容性差等缺點(diǎn)。相關(guān)研究表明，吐溫等非離子表面活性劑可以通過(guò)氫鍵與H2O以及H3O+結(jié)合，從而使得非離子表面活性劑帶有部分正電性，所以相同條件下的陰離子表面活性劑與非離子表面活性劑的相互作用明顯強(qiáng)于陽(yáng)離子表面活性劑與非離子表面活性劑的相互作用[9]。而在應(yīng)用于藥物制劑的陰離子表面活性劑中，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)目前應(yīng)用廣泛，常常作為輔料加入到藥劑之中，可被用于藥物增溶和穩(wěn)定過(guò)程中[10-11]，相關(guān)的理論已經(jīng)較為成熟。非離子表面活性劑吐溫20在對(duì)姜黃素的增溶作用中也表現(xiàn)出了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12-13]，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。所以，本研究采用SDS與吐溫20進(jìn)行復(fù)配，對(duì)不同比例的復(fù)配表面活性劑體系的姜黃素增溶和保護(hù)作用進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

所用試劑包括：吐溫20(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠，生產(chǎn)批號(hào)：20180501)、姜黃素(分析純，北京偶合科技，生產(chǎn)批號(hào)：20181003)、SDS(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠，生產(chǎn)批號(hào)：20180220)、氫氧化鈉(分析純，北京化工廠，生產(chǎn)批號(hào)：20180216)、無(wú)水乙醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180401)、反式-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙烯酸(反式阿魏酸，純度99.73%，畢得醫(yī)藥，生產(chǎn)批號(hào)：RNL241)、4-羥基-3-甲氧基苯甲醛(香草醛，純度99.00%，畢得醫(yī)藥，生產(chǎn)批號(hào)：AGZ34)。

所用儀器包括：10 mL注射器(BioDee，生產(chǎn)批號(hào)：20180215)、水系0.45 μm針頭濾器(NAVIGATOR，生產(chǎn)批號(hào)：20180103)、UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)、盧湘儀TDZ5WS臺(tái)式離心機(jī)、上海馳久MYP11-2A恒溫磁力攪拌器、精密pH試紙。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1臨界膠束濃度的計(jì)算 表面活性劑在臨界膠束濃度(critical micelle concentration，CMC)處會(huì)形成膠束，從而對(duì)藥物起到良好的增溶和保護(hù)作用，查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，吐溫20和SDS在20 ℃的臨界膠束濃度分別為0.11 mmol/L和6.94 mmol/L[9,14]。二者不同摩爾比例的復(fù)配表面活性劑的臨界膠束濃度可依據(jù)Clints方程進(jìn)行計(jì)算[15]，如式(1)所示：

(1)

其中，n1為第一種表面活性劑所占的摩爾分?jǐn)?shù)，n2為第二種表面活性劑所占摩爾分?jǐn)?shù)，CMC1為該溫度下第一種表面活性劑的臨界膠束濃度，CMC2為該溫度下第二種表面活性劑的臨界膠束濃度，CMC為表面活性劑復(fù)配體系的臨界膠束濃度。下述實(shí)驗(yàn)操作均在20 ℃下進(jìn)行。

1.2.2姜黃素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 姜黃素的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。由于姜黃素具有較多的共軛結(jié)構(gòu)，所以其具有較強(qiáng)的紫外吸收。以無(wú)水乙醇作為溶劑，首先進(jìn)行姜黃素溶液的全波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)，分別配置一定濃度梯度的姜黃素溶液，在最大吸收波長(zhǎng)下分別測(cè)定光密度，根據(jù)最小二乘法，使用光密度對(duì)姜黃素濃度進(jìn)行一元一次回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線中若R2值大于0.995[16]，則標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。

圖1 吐溫20、十二烷基硫酸鈉和姜黃素的分子結(jié)構(gòu)式

1.2.3對(duì)姜黃素增溶作用的測(cè)定 相關(guān)文獻(xiàn)表明，在可形成膠束的表面活性劑增溶實(shí)驗(yàn)中，表面活性劑的濃度與增溶藥物濃度呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)稱為摩爾增溶比(molar solubilization ratio，MSR)[17]，如式(2)所示：

(2)

其中,C1、C2均為大于臨界膠束濃度的表面活性劑濃度，x1、x2為對(duì)應(yīng)的增溶藥物濃度。先配制遠(yuǎn)高于臨界膠束濃度的表面活性劑復(fù)配水溶液(SDS所占摩爾比例分別為0%、40%、60%、80%)各25 mL，在其中加入過(guò)量的姜黃素粉末，37 ℃振蕩搖勻72 h后10 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，使用二次蒸餾水稀釋，測(cè)定光密度，換算為姜黃素濃度，姜黃素濃度(mmol/L)為因變量，表面活性劑濃度(mmol/L)為自變量進(jìn)行一元一次回歸，求出直線斜率即為MSR數(shù)值。

1.2.4對(duì)姜黃素保護(hù)作用的測(cè)定 相關(guān)研究表明，溫度對(duì)姜黃素的穩(wěn)定性影響不大[18]，且pH<5時(shí)姜黃素不易分解，但當(dāng)溶液的pH值升高，姜黃素的降解速率明顯加快，而且不同pH條件下姜黃素最大吸收峰會(huì)發(fā)生偏移。用NaOH把溶液的pH值控制在13。先進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，找到姜黃素的最大吸收峰，并測(cè)定姜黃素在不添加表面活性劑的情況下紫外吸收強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。之后配制遠(yuǎn)高于臨界膠束濃度的表面活性劑復(fù)配水溶液(SDS所占摩爾比例分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%)各25 mL，以無(wú)水乙醇作溶劑配制飽和姜黃素母液1 mL，將母液離心取上清液，過(guò)0.45 μm濾膜，每組表面活性劑復(fù)配水溶液中各加100 μL姜黃素母液，混合均勻后立即在最大吸收峰處開始測(cè)定光密度，每40 min測(cè)定一次，持續(xù)3 h。由文獻(xiàn)可知，姜黃素的降解過(guò)程嚴(yán)格符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程[8,19]，故以姜黃素濃度(mmol/L)的對(duì)數(shù)值作因變量，時(shí)間(min)為自變量進(jìn)行擬合，求出降解速率常數(shù)k。

1.2.5姜黃素降解產(chǎn)物的干擾 查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，姜黃素在堿性條件下發(fā)生分解時(shí)，直接生成香草醛(vanillin)和反式阿魏酸(trans-ferulic acid)[20]。為排除在姜黃素分解過(guò)程中所生成的降解產(chǎn)物的干擾，本研究測(cè)定了在pH=13條件下的0.05 mol/L的香草醛溶液的紫外吸收曲線和反式阿魏酸紫外吸收曲線，并與姜黃素溶液紫外吸收曲線進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)過(guò)全波長(zhǎng)掃描，pH=7的條件下姜黃素在423 nm處取得最大的紫外吸收，在該波長(zhǎng)下進(jìn)行姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，其中R2=0.996 6，可以將該標(biāo)準(zhǔn)曲線運(yùn)用至后續(xù)實(shí)驗(yàn)姜黃素濃度計(jì)算過(guò)程中。

2.2 對(duì)姜黃素的增溶作用

復(fù)配表面活性劑對(duì)姜黃素的增溶結(jié)果如表1和圖3所示。MSR數(shù)值隨著SDS的比例降低而單調(diào)上升。由于吐溫20比SDS的臨界膠束濃度小，更易形成膠束，所以當(dāng)兩種表面活性劑進(jìn)行復(fù)配時(shí)，隨著吐溫20的比例增加，復(fù)配膠束更易形成，增溶的效果更好，增溶效果的提升并非隨著吐溫20比例增加而均勻變化，可以看出當(dāng)SDS的摩爾分?jǐn)?shù)為50%左右時(shí)，MSR數(shù)值變化較快。可能的原因是在摩爾分?jǐn)?shù)50%前后膠束的主體發(fā)生了改變，一方面由于SDS帶負(fù)電，導(dǎo)致當(dāng)SDS為主體時(shí)解離的帶有負(fù)電的姜黃素陰離子更多地存在于膠束的內(nèi)核而非柵欄層中，另一方面由于SDS和吐溫20分子大小的差異，膠束的體積可能在這一過(guò)程中發(fā)生了顯著的變化[21]。相關(guān)研究表明，在表面活性劑的復(fù)配體系中，陰離子表面活性劑往往比陽(yáng)離子表面活性劑對(duì)膠束的體積產(chǎn)生更大的影響[22]。總的來(lái)說(shuō)，在SDS-吐溫20的復(fù)配體系中，保持SDS的摩爾分?jǐn)?shù)小于40%，將會(huì)得到比較良好的增溶效果。

圖2 姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 復(fù)配表面活性劑對(duì)姜黃素的增溶作用

圖3 復(fù)配表面活性劑對(duì)姜黃素的增溶作用

2.3 對(duì)姜黃素的保護(hù)作用

在pH=13條件下，姜黃素溶液全波長(zhǎng)掃描結(jié)果如圖4所示，可見(jiàn)最大吸收峰在471 nm處，相比pH=7條件下發(fā)生了紅移，這可能與姜黃素離子與SDS陰離子以及OH-的相互作用有關(guān)[23]。

本研究在471 nm處進(jìn)行了復(fù)配表面活性劑對(duì)姜黃素保護(hù)作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，如表2所示，k值越小，姜黃素降解速率越小，說(shuō)明表面活性劑對(duì)姜黃素的保護(hù)作用越強(qiáng)。在不添加表面活性劑時(shí)，k=0.005 3，表明此時(shí)表面活性劑并未對(duì)姜黃素起到有效的保護(hù)作用，與文獻(xiàn)相關(guān)結(jié)果一致[24]，可能的原因是姜黃素在堿性條件下具有還原性[25]，易被氧化，而吐溫20在堿性條件下可能會(huì)發(fā)生水解，與姜黃素發(fā)生取代反應(yīng)，從而減少了姜黃素的含量。吐溫20雖然能夠?qū)S素有良好的增溶作用，但是對(duì)姜黃素并沒(méi)有良好的保護(hù)作用，這也說(shuō)明了使用復(fù)配表面活性劑體系對(duì)姜黃素同時(shí)進(jìn)行增溶和保護(hù)的合理性。隨著SDS比例的增大，復(fù)配表面活性劑對(duì)膠束的保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)SDS所占比例為100%時(shí)，保護(hù)作用反而有所降低，可能的原因是此時(shí)臨界膠束濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他情況，膠束形成數(shù)量更少，姜黃素溶解較少，并且有大量的姜黃素陰離子處于膠束之外，與水溶液中的OH-接觸更加密切,從而發(fā)生分解[26]。相比較而言，在其他情況下，由于SDS帶負(fù)電荷，姜黃素也帶負(fù)電荷，靜電相互作用下姜黃素陰離子更多地處于膠束的內(nèi)核之中，能夠避免與溶液中其他離子相互接觸，從而起到了較好的保護(hù)作用。膠束的存在也能夠使得姜黃素的分布更加均一，性質(zhì)更加穩(wěn)定。從圖5中可以看出，姜黃素的降解產(chǎn)物反式阿魏酸和香草醛在pH=13條件下的紫外吸收的最大吸收波長(zhǎng)明顯小于471 nm。二種化合物的水溶液的濃度均為0.05 mol/L，遠(yuǎn)高于保護(hù)作用測(cè)定過(guò)程中姜黃素的濃度，在這種情況下反式阿魏酸和香草醛在471 nm的光密度分別為0.018和0.016，所以二者的存在并不會(huì)對(duì)該實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較大干擾。

圖4 pH=13條件下姜黃素的紫外光譜

表2 復(fù)配表面活性劑對(duì)姜黃素的保護(hù)作用

圖5 pH=13條件下姜黃素降解產(chǎn)物(0.05 mol/L)的紫外光譜

總的來(lái)說(shuō)，當(dāng)SDS所占摩爾分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，復(fù)配體系能夠產(chǎn)生對(duì)姜黃素較好的保護(hù)作用。如果綜合考慮SDS和吐溫20表面活性劑復(fù)配體系對(duì)于姜黃素的增溶作用和保護(hù)作用，那么使得SDS的摩爾分?jǐn)?shù)為40%將會(huì)有不錯(cuò)的結(jié)果，此時(shí)的增溶效果接近完全使用吐溫20的效果，摩爾增溶比MSR=0.024 3，而降解速率也得到了有效的降低，降解速率常數(shù)k=0.003 7。

綜上，在陰離子表面活性劑SDS和非離子表面活性劑吐溫20復(fù)配體系中，姜黃素的溶解度得到了提升，pH=13條件下降解速率有所下降。隨著SDS所占摩爾分?jǐn)?shù)的降低，復(fù)配體系對(duì)姜黃素的增溶作用效果持續(xù)增強(qiáng)，而對(duì)于保護(hù)作用而言，SDS在保護(hù)作用中是關(guān)鍵因素，SDS具有較高比例時(shí)，保護(hù)作用較強(qiáng)，當(dāng)SDS占摩爾分?jǐn)?shù)80%時(shí)，姜黃素降解速率得到了實(shí)驗(yàn)結(jié)果中最大程度的降低。從總體來(lái)說(shuō)，綜合考慮增溶作用和保護(hù)作用二者時(shí)，當(dāng)SDS摩爾分?jǐn)?shù)為40%，復(fù)配體系對(duì)于姜黃素具有較優(yōu)的增溶和保護(hù)作用。