新型佐劑-細菌樣顆粒對百日咳抗原體液免疫的效果研究

孔祥忍，毛雙雙，劉欣宇，馬勝男，孟令杰，陳家琦，李雅林

（山東第一醫科大學，山東 泰安 271000）

百日咳是由百日咳鮑特桿菌（bordetella pertussis）感染引起的急性呼吸系統傳染病，病程長且危害嚴重[1]。現行疫苗使用的鋁佐劑及肌肉接種方法是影響疫苗效果的要素，開發更有效新型百日咳疫苗勢在必行。佐劑因具有增強疫苗免疫應答的作用而廣泛用作疫苗的重要成分。細菌樣顆粒（bacterium-likeparticles，BLP）是近年來新被發現的新型佐劑，其成分是滅活的乳酸乳球菌，該細菌是一種常見的非致病細菌，被廣泛應用在益生菌飲料和奶產品的生產，同其他常見的黏膜免疫佐劑相比，BLP 在安全性方面具有良好的優勢[2-4]。近年來有報道BLP 用作佐劑可增強流感疫苗、肺炎鏈球菌疫苗的效果，但BLP 能否用作百日咳疫苗佐劑尚不十分清楚。此外，接種途徑也是影響疫苗效果的重要因素之一，百日咳是呼吸系統傳染病，通過鼻黏膜途徑進行疫苗接種是非常理想的選擇，既能協調系統免疫反應和局部黏膜免疫，又能兼顧體液和細胞免疫。現行疫苗主要為肌肉接種，這也可能是導致現行百日咳疫苗免疫效果不理想的原因之一。為此，本研究擬制備BLP 作為百日咳疫苗的佐劑，探討其用于百日咳疫苗后對小鼠的體液免疫作用及保護效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 健康8 周齡雌性NIH 小鼠50 只，鼠齡8 周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有動物均在山東第一醫科大學實驗動物中心SPF 級環境飼養。乳酸乳球菌購自上海丹曦化工科技有限公司，百日咳攻擊菌和百日咳類毒素購自蘭州生物制品研究所有限責任公司，氫氧化鋁佐劑購自美國賽默飛世爾公司。百日咳毒素（pertussistoxin，PT）IgG ELISA 試劑盒和百日咳PT sIgA ELISA 試劑盒購自德國IBL 公司。本研究經山東第一醫科大學動物倫理委員會審核通過。主要儀器：生物安全柜（力康生物醫療科技控股有限公司，HFSafe1200LC）、分光光度計、旋轉蒸發儀（上海巴玖實業有限公司，RE-6000A）、酶標儀（賽默飛世爾，Multiskan FC）、顯微鏡（日本奧林巴斯，CX43）、冷凍切片機（德國萊卡，Leica CM1850）。

1.2 方法

1.2.1 制備細菌樣顆粒（BLP）佐劑 將乳酸菌菌種接種于含葡萄糖的M17 液體培養基中培養，經三氯乙酸處理并加熱以裂解菌體，經離心、沉淀及洗滌可獲得BLP。經染色及油鏡觀察BLP 形態。經旋轉蒸發儀蒸發法測定BLP 干重。經分光光度計檢測法檢測BLP 濃度。通過各項參數的優化、制備形態大小合適、安全的細菌樣顆粒用作佐劑。

1.2.2 制備百日咳類毒素疫苗 以0.3 mg BLP 為佐劑，以百日咳類毒素為抗原，將百日咳類毒素抗原以一定比例和用量混合，乳化混勻后保存于2 ℃～8 ℃中或直接用于免疫接種；以氫氧化鋁為佐劑的疫苗，參照人用劑量進行換算，將類毒素抗原和鋁佐劑吸附后再合并在一起，在2 ℃～8 ℃中保存或直接進行免疫。

1.2.3 實驗分組及免疫方案 選取8 周齡雌性NIH小鼠，將50 只小鼠隨機分為空白對照組、百日咳抗原+BLP 佐劑黏膜免疫組（BLP 佐劑黏膜組）、百日咳抗原+鋁佐劑黏膜免疫組（鋁佐劑黏膜組）、百日咳抗原+BLP 佐劑腹腔免疫組（BLP 佐劑腹腔組）和百日咳抗原+鋁佐劑腹腔免疫組（鋁佐劑腹腔組）。各組中BLP 劑量均為0.25 mg；黏膜組鋁佐劑用量為0.1 mg，腹腔組劑量為0.5 mg；鼻黏膜組百日咳抗原劑量為5 μg，腹腔組百日咳抗原劑量為25 μg。黏膜免疫組進行常規滴鼻免疫，每只小鼠每個鼻孔滴加25 μl 疫苗，腹腔注射組進行腹腔注射0.5 ml 疫苗，空白組滴鼻并腹腔注射等量0.01 mol/L PBS（pH 為7.2～7.4），于第0 天和28 天免疫2 次。

1.2.4 疫苗安全性檢測 接種后連續3 d 觀察小鼠有無明顯異常，如體質量減輕，重點觀察鼻孔及口腔處是否有炎癥、潰瘍及脫毛現象，并抽檢接種部位有無潰瘍。

1.2.5 抗百日咳特異性抗體檢測 在初次免疫后的第7、21 及35 天取血，分別采小鼠尾部靜脈血100 μl左右，37 ℃靜置1 h，然后4 ℃靜置4 h，吸取上層血清備用。ELISA 檢測抗百日咳毒素特異性IgG。免疫后第35 天，采集小鼠鼻洗液樣本。將小鼠處死后固定于實驗臺上，剖開頸部皮膚，剪開小鼠氣管，使用注射器將400 μl 灌洗液由氣管注入，由鼻腔流出，收集灌洗液。對制備的鼻灌洗液行ELISA 檢測抗百日咳毒素特異性sIgA。ELISA 操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 百日咳疫苗保護力檢測 在初次免疫后42 d，于生物安全柜中進行菌液鼻腔攻擊實驗，攻擊后第2 及14 天，取肺行HE 染色，進行肺損傷程度的病理評分。評分規則如下：損傷非常溫和（+/-），溫和（+），損傷中等（++），損傷嚴重（+++）。

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析，計量資料采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 疫苗安全性檢測 接種后連續3 天，各組小鼠均未出現明顯異常，無體重減輕，鼻孔及口腔處均無明顯炎癥、潰瘍及脫毛現象，抽檢的接種部位未見潰瘍，疫苗具有良好的安全性。

2.2 各組小鼠血清抗百日咳毒素IgG 水平檢測 各組小鼠接受百日咳疫苗免疫接種后，血清抗百日咳毒素IgG 抗體水平逐漸升高，對照組無抗體產生。接種7、21、35 天，BLP 黏膜組、鋁佐劑黏膜組、BLP佐劑腹腔組和鋁佐劑腹腔組抗百日咳毒素IgG 均高于空白對照組，且BLP 佐劑腹腔組和鋁佐劑腹腔組均高于BLP 黏膜組和鋁佐劑黏膜組，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中鋁佐劑腹腔組抗體水平最高，見表1。

2.3 各組小鼠鼻洗液sIgA 水平比較 與空白對照組比較，各組sIgA 水平均升高，BLP 佐劑黏膜組sIgA水平最高，高于鋁佐劑黏膜組、BLP 佐劑腹腔組及鋁佐劑腹腔組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.4 百日咳桿菌鼻腔攻擊后各組組織病理學損傷評估 攻擊后14 天，取小鼠肺組織，經固定、HE 染色后進行顯微鏡觀察，空白對照組小鼠肺組織表現為顯著的病理組織損傷，而接受疫苗免疫各組小鼠肺內只出現輕微的炎性細胞浸潤；與其他各組比較，BLP 佐劑黏膜組小鼠肺組織損傷較小，見表3。

表1 各組小鼠血清抗百日咳IgG 抗體水平比較（±s）

表1 各組小鼠血清抗百日咳IgG 抗體水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與鋁佐劑黏膜組比較，bP＜0.05；與鋁佐劑腹腔比較，cP＜0.05

表2 各組小鼠血清抗日咳sIgA 抗體水平比較（±s）

表2 各組小鼠血清抗日咳sIgA 抗體水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與鋁佐劑黏膜組比較，bP＜0.05；與鋁佐劑腹腔比較，cP＜0.05

表3 各組小鼠肺組織病理損傷評分結果

3 討論

百日咳是由百日咳鮑特桿菌感染引起的急性呼吸系統傳染病，接種疫苗是防治百日咳的最有效方法。目前所有市售的無細胞百日咳疫苗因其良好的安全性成為目前的主流疫苗，雖然在全球覆蓋率達到85%以上，但該疫苗的保護力并不理想，近年來百日咳發病率不斷攀升，因此開發更有效新型百日咳疫苗勢在必行。

佐劑因具有增強疫苗免疫應答的作用而廣泛用作疫苗的重要成分。研究顯示，佐劑不同，疫苗的免疫效果差別很大。鋁佐劑是應用最早、范圍最廣的佐劑，被用于制備白喉破傷風聯合疫苗[5]。雖然鋁佐劑仍然是目前應用最廣泛的佐劑，但人們也逐漸開始發現它的局限性，如黏膜免疫效果不理想。BLP 是近年來新被發現的新型佐劑，其成分是滅活的乳酸乳球菌，乳酸乳球菌經熱酸處理后球菌的細胞膜、細胞內的核酸、胞質等內容物被破壞，而構成細菌外殼的肽聚糖復合物被保留下來，而且也保留了細菌原有的形狀和大小（直徑大約1 μm），即成為BLP。BLP 不僅可作為疫苗佐劑使用，也可作為抗原成分的載體。BLP 模擬了微生物感染的天然途徑進行抗原提呈，有細菌一樣的大小與外形因此很容易被機體所吞噬，特別是在黏膜組織中。同其他常見的黏膜免疫佐劑相比，BLP 在安全性方面具有良好的優勢[6，7]。近年研究報道BLP 用作佐劑可增強流感疫苗、肺炎鏈球菌疫苗的效果，但BLP 能否用作百日咳疫苗佐劑尚不清楚[8-10]。

除了佐劑對疫苗免疫效果的影響之外，接種途徑亦對疫苗的免疫效果有較大影響。百日咳是呼吸系統傳染病，通過鼻黏膜途徑進行疫苗接種是非常理想的選擇，這樣既能協調系統免疫反應又能激發局部黏膜免疫。然而，目前應用的百日咳疫苗均采用肌肉注射，此類疫苗能夠促使機體產生足夠的體液免疫應答，但并不能充分誘導以sIgA 分泌為標志的局部黏膜免疫，現有疫苗在這方便的缺陷很可能是導致百日咳死灰復燃的另一重要原因。通過鼻腔進行百日咳疫苗免疫接種是激活和強化局部黏膜免疫防御的有效方法，與肌肉注射和皮下注射相比，鼻腔免疫與百日咳的自然感染更加相似，預計能夠有效的誘導系統免疫應答和局部免疫應答。

本研究比較了百日咳疫苗通過鼻黏膜和腹腔兩種途徑免疫的差異，在兩種途徑中分別比較了BLP 和氫氧化鋁佐劑作用的效果。結果顯示，盡管以BLP 為黏膜佐劑的百日咳疫苗在誘導系統性IgG 水平方面略低于傳統鋁佐劑疫苗，但其經鼻黏膜免疫效果優于傳統鋁佐劑疫苗，可獲得較好的免疫效果，能夠提高小鼠鼻黏膜sIgA 抗體水平，提高小鼠抵御活菌攻擊的能力，降低小鼠肺組織病理損傷。本研究也存在一定的不足，由于實驗條件限制，未研究疫苗對細胞免疫的誘導作用，在以后的工作中，將深入研究以BLP 為佐劑的百日咳抗原疫苗對細胞免疫的誘導作用。

總之，新型佐劑-細菌樣顆粒通過黏膜免疫保護作用最佳，其主要通過誘導產生高滴度的sIgA 發揮作用。