RANKL/RANK/OPG信號通路調控磨損顆粒誘導的小鼠炎性骨溶解

張晨，李燕，郭鳳英，劉子歌，宋國瑞，陳德勝

（寧夏醫科大學 1.總醫院脊柱骨科，銀川 750004；2.基礎醫學院生物化學教研室，銀川 750004）

人工關節置換術是現階段治療終末期骨性關節炎的重要方法，它不僅能有效緩解關節疼痛，還能重建關節功能。由于我國老齡化人口正以比總人口增長更快的速度增加，人工關節置換術也呈遞增趨勢［1］。無菌性松動導致的假體下沉、松動和失效是人工關節置換術后的主要并發癥，也是人工關節翻修的最主要原因［2］。如何預防和治療假體周圍骨溶解導致假體無菌性松動，是目前骨科關注的熱點和難點。人工關節各部件相互摩擦產生的磨損顆粒進入機體內，通過刺激假體周圍界膜組織的巨噬細胞釋放多種炎性細胞因子和細胞，引起假體周圍無菌性炎癥反應，刺激破骨細胞增殖活化，導致假體周圍的骨溶解［3］。骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、核因子κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）構成RANKL/RANK/OPG信號通路，對調控破骨細胞的骨溶解起重要作用［4］。RANKL/RANK/OPG信號通路的調控，可能對預防和延緩人工關節置換術后無菌性松動有非常重要的意義。目前研究［5］發現，采用外源性OPG作用于骨質疏松動物模型，能減少骨質流失，表明OPG具有調控實驗性骨質疏松骨質流失的作用。本研究采用外源性OPG作用于磨損顆粒誘導小鼠氣囊植骨模型，探討RANKL/RANK/OPG信號通路對人工假體周圍無菌性骨溶解的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

BALB/c小鼠由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，動物實驗許可證號：SCXK（京）2016-0008；磨損顆粒（美國Alfa Aesar公司）；OPG、RANKL、RANK（美國Sigma公司）；白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）試劑盒（美國Sigma公司）。

1.2 實驗分組及造模

8～10周齡雌性BALB/c小鼠45只，體質量25～30 g，在SPF級環境中飼養，動物相關處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求，適應性喂養1周后進行實驗。對小鼠進行編號，采用隨機數字表法將小鼠隨機分為對照組、模型組和OPG組，每組15只。另選45只SPF級BALB/c同屬同齡雌性小鼠，做為磨損顆粒誘導骨溶解動物模型植骨的供體，每只小鼠可提供2片用于植骨的顱骨骨片，大小約0.5 cm×0.25 cm×0.1 cm。小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）進行麻醉，腹腔麻醉成功后背部消毒備皮，注射2 mL無菌空氣形成氣囊；之后連續每天向小鼠背部氣囊中注射0.5 mL無菌空氣，至第7天氣囊形成；另外隨機選同屬同齡小鼠處死，取顱骨骨片；切開氣囊，植入顱骨骨片，縫合切口。

對照組：植骨后向小鼠氣囊內注射0.1 mL PBS，此后腹腔注射0.1 mL生理鹽水，1次/d，持續14 d。模型組：植骨后向小鼠氣囊內注射 0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液，此后腹腔注射0.1 mL生理鹽水，1次/d，持續14 d。OPG組：植骨后向小鼠氣囊內注射0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液，之后腹腔注射OPG（3 mg/kg），1次/d，持續14 d。將3組小鼠同時間處死，取出小鼠顱骨及其囊壁組織進行相關檢測。

1.3 HE染色觀察炎性改變

切片先后置入不同濃度二甲苯、無水乙醇以及75%乙醇浸泡，之后蒸餾水洗滌；加蘇木素染色，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，用0.6%氨水返藍，流水沖洗；置入伊紅染液染色；置入不同濃度乙醇以及二甲苯脫水透明；中性樹膠封片。

1.4 TRAP染色觀察骨溶解

TRAP對觀察、確定破骨細胞具有特異性。將小鼠顱骨及其囊壁組織經脫鈣、切片、脫蠟后，經過不同濃度乙醇階梯脫水，沖洗后放入丙酮溶液中固定，之后將玻片放入暗盒內，滴加新鮮配制的TRAP染液，染液須完全覆蓋切片，37 ℃水浴鍋避光孵育1 h后沖洗、蘇木素復染，再次沖洗后晾干、封片。

1.5 ELISA法檢測氣囊植骨組織中IL-6和TNF-α的水平

每組隨機取3只小鼠處死后，取氣囊植骨組織先剪碎，再通過RIPA裂解液裂解，12 000 r/min離心15 min后收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6和TNF-α。

1.6 免疫組織化學染色檢測氣囊植骨組織中RANKL、RANK、OPG的表達

切片在68 ℃中烤片2 h后，置入不同濃度二甲苯、無水乙醇浸泡，經自來水、蒸餾水沖洗、3% H2O2孵育后，用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液煮沸予抗原修復，滴加羊血清于玻片封閉。分別滴加一抗（RANKL、RANK、OPG）孵育、二抗，37 ℃孵育、沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉抗生物素蛋白稀釋液，37 ℃孵育，滴加DAB靜置數分鐘，置于顯微鏡下觀察顯色，適時終止。后經蘇木素液復染，1%鹽酸乙醇分化，碳酸鋰返藍，不同濃度的乙醇、二甲苯浸泡，中性樹脂封片。

顯微鏡下觀察免疫組化染色結果并進行圖像采集，每張免疫組化切片隨機選取5個表達的高倍鏡（×400）視野，確保每張圖像的位置以及背景亮度一致。將采集的圖像用Image-Pro軟件進行分析，確定統一的測定標準，計算分析后得到平均光密度值。

1.7 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，計量資料用表示，多組間樣本均數的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色

HE染色結果顯示，對照組中未見鈦顆粒浸潤，氣囊植骨復合體周圍組織見少量的中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等，炎癥反應不明顯，植骨塊骨面平滑并光整；模型組氣囊植骨復合體的囊壁增厚，周圍鈦顆粒浸潤，可有中性粒細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞等浸潤，炎癥反應明顯，植骨塊表面存在侵蝕，骨面不光整，部分有缺損表現；OPG組亦有鈦顆粒浸潤，氣囊植骨復合體周圍氣囊組織厚度與模型組相比較薄，周圍有少量炎癥細胞，植骨骨塊表面侵蝕反應減輕，比較平整。見圖1。

圖1 HE染色結果 ×20Fig.1 HE staining ×20

2.2 TRAP染色

對照組見少量的TRAP染色陽性細胞，染色較淺，陽性染色面積小；模型組TRAP染色陽性細胞數較多，陽性染色面較大，而且染色深；OPG組TRAP染色陽性細胞數與模型組相比較少。見圖2、表1。

2.3 ELISA檢測小鼠氣囊組織中IL-6、TNF-α水平

與對照組比較，模型組和OPG組小鼠氣囊植骨中IL-6、TNF-α水平均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，OPG組小鼠顱骨骨膜中IL-6、TNF-α水平降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1。

2.4 免疫組織化學染色檢測小鼠氣囊組織中RANKL、RANK、OPG表達

與對照組比較，模型組和OPG組小鼠氣囊植骨組織中RANKL、RANK表達增加，而OPG表達減少，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。與模型組比較，OPG組小鼠氣囊植骨組織RANKL、RANK表達減少，而OPG表達增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表1、圖3。

3 討論

圖2 TRAP染色結果 ×20Fig.2 TRAP staining×20

表1 3組TRAP染色陽性細胞數、IL-6和TNF-α水平及RANKL、RANK、OPG平均光度值比較Tab.1 Number of TRAP staining positive cells，IL-6 and TNF-α levels，as well as the expression of RANKL，RANK，and OPG in the three groups

圖3 3組RANKL、RANK、OPG免疫組化結果×20Fig.3 Immunohistochemistry results for RANKL，RANK，and OPG in the three groups ×20

骨性關節炎是一種包含關節軟骨損害、軟骨愈合不充分、關節結構進行性惡化等特點的退行性疾病，關節超負荷和生物力學改變等多種因素引起的關節軟骨潰瘍、皸裂、纖維化，常會導致關節出現腫脹、疼痛、活動受限等表現，發展至終末期還會造成患者關節畸形、功能受限，給患者帶來極大的痛苦［6］。由于目前缺乏早期診斷方法，臨床診治時多處于疾病的中晚期，治療方法多以手術為主，而在多種手術方法中，人工關節置換術是發展時間最長、技術最為成熟的治療方法［7］。但是人工關節假體植入體內后，假體表面與關節磨損會產生磨損顆粒，刺激骨-假體的界膜組織中的巨噬細胞釋放大量溶骨性炎性細胞因子，激活破骨細胞活化，誘導骨溶解而導致無菌性松動，這是制約人工關節置換術發展的重要并發癥［8］。隨著分子生物學的發展，以信號通路為靶點的研究逐漸成為解決假體無菌性松動的突破口，在以骨代謝失衡為主的溶骨性改變過程中，RANKL/RANK/OPG信號通路被證實起重要的調控作用。

RANK是從小鼠類巨噬細胞的破骨細胞前體細胞中復制出的破骨細胞分化因子受體，屬于Ⅰ型三聚化的跨膜蛋白，在破骨細胞的前體細胞、成熟破骨細胞、軟骨細胞等中起重要作用［9］。RANKL屬于TNF-α超家族成員Ⅱ型跨膜蛋白，其mRNA在骨骼和淋巴組織中均可以檢測到，在骨小梁、骨髓、骨髓基質細胞和成骨細胞中高表達［10］。RANK的胞內區域包含多個受體相關因子結合區域，可與腫瘤壞死相關因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）家族中的TRAF-1、TRAF-3、TRAF-6及白細胞介素（interleukin，IL）家族中的IL-1、IL-6、IL-15等結合，這是激活JNK、Wnt等骨性關節炎相關信號通路活性的關鍵步驟［11］。OPG同屬于TNF-α超家族成員，是一種分泌型糖蛋白，主要以單體形式由成骨細胞和骨髓基質細胞分泌產生［12］。OPG是RANKL競爭性抑制因子，可與破骨細胞前體細胞和成熟破骨細胞表面的RANK競爭性結合，以阻斷RANKL與 RANK結合，從而拮抗RANKL的促破骨細胞分化功能，誘導破骨細胞凋亡，抑制骨吸收［13］。

本研究選用鈦顆粒刺激小鼠氣囊植骨構建磨損顆粒誘導骨溶解動物模型，病理形態學和TRAP染色結果顯示，模型組破骨細胞生成增加，骨吸收反應增強，與對照組相比差異顯著。OGP組在將外源性OPG作用于磨損顆粒誘導小鼠氣囊植骨模型后，磨損顆粒誘導的骨溶解明顯減輕，說明OPG可能有效抑制顆粒誘導的破骨細胞生成作用。免疫組化結果顯示，OPG在對照組有一定的表達，鈦顆粒刺激誘導骨溶解的模型組OPG表達量明顯減少，說明OPG和RANKL競爭性與RANK結合的作用減弱，使得RANKL與更多的RANK結合，增加磨損顆粒周圍組織中破骨細胞前體活化和分化，向破骨細胞轉化，出現骨溶解。加入外源性OPG的OPG組中OPG表達顯著增加，而RANKL表達減少，說明在OPG與RANK結合作用增強的同時，RANKL與RANK結合作用減弱，也促使破骨細胞的轉化生成減少，相應的骨溶解作用減弱，對預防無菌性骨溶解有重要的促進作用。

磨損顆粒刺激巨噬細胞釋放大量的炎癥介質和細胞因子（如TNF-α、IL-6等），這些炎癥介質與細胞因子在信號通路的調控下被激活，作用于破骨細胞前體，使其分化和增殖，轉化為成熟的破骨細胞，誘導骨溶解［14］。本研究中，模型組中IL-6、TNF-α表達水平升高，說明炎癥反應增強，而加入外源性OPG的OPG組中IL-6、TNF-α表達水平降低，說明OPG和RANKL競爭性與RANK結合作用增強后，RANKL與RANK結合作用減弱。RANKL是調節骨吸收、骨溶解的關鍵因子，與前體破骨細胞膜上的RANK受體結合減弱會降低破骨細胞活性，破骨細胞骨溶解作用減弱。加入外源性OPG除了抑制破骨細胞的溶骨作用，也相應降低了IL-6、TNF-α等炎癥介質和細胞因子的活性，減輕了炎癥反應。

骨代謝平衡是一個很復雜的過程，RANK/RANKL/OPG是體內維持骨代謝平衡的重要信號通路，王瑞燈等［15］通過研究OPG對腫瘤骨轉移的作用機制，發現IL-11、TNF-α等會通過成骨細胞和基質細胞上調RANKL，抑制OPG參與溶骨性病變，同時骨微環境中釋放大量趨化因子如胰島素樣生長因子、基質細胞衍生因子-1等，使骨細胞和軟骨細胞分化異常，處于病理狀態。PHILIPPOU等［16］的機械應力對骨骼生長影響的研究中，讓研究對象進行適當離心運動，6 h后發現血液中OPG水平升高，而RANKL水平降低，得出中等強度的運動能夠預防骨質疏松癥，而這種生理變化主要是通過RANK/RANKL/OPG信號通路實現的。OPG/RANKL比值的升高有助于骨細胞的成骨化，可以有效預防骨質疏松癥的發生。最新的研究［17］還表明，骨細胞自身分泌的β干擾素是破骨細胞生成的負調節因子，能夠抑制破骨細胞的形成，側面證實了OPG對預防骨溶解的發生起至關重要的作用。

綜上所述，加入外源性OPG作用于磨損顆粒誘導的骨溶解后，可能使RANKL/RANK/OPG信號通路對破骨細胞骨溶解作用下調，本研究結果為假體周圍骨溶解的防治提供一種可能的理論依據，為延緩和阻止假體周圍無菌性松動尋找可靠的靶點。