HSV-1糖蛋白B和糖蛋白D的T細胞表位重組核酸疫苗的構建及其免疫原性

（中國醫科大學附屬第一醫院眼科，沈陽 110001）

單純皰疹病毒性角膜炎是由Ⅰ型單純皰疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）感染引起的角膜疾病。HSV-1感染角膜后，病毒入侵角膜細胞，在角膜細胞內復制、增殖，引起細胞病變，導致細胞水腫、破裂。單純皰疹病毒性角膜炎急性發作期的典型臨床表現為皰疹、樹枝狀或者地圖狀角膜潰瘍、角膜刺激癥狀。初次感染病毒后，機體免疫力強時可清除病毒，但如果機體免疫力無法清除病毒，病毒經感覺神經末梢侵入三叉神經節，進入三叉神經節后病毒不再復制增殖，在三叉神經節中潛伏即進入潛伏期，HSV-1的特點為終身潛伏［1］。機體免疫功能降低時，潛伏感染的 HSV-1重新活化，引起單純皰疹病毒性角膜炎復發，單純皰疹病毒性角膜炎反復發作會使角膜的透明度改變，造成視力嚴重損害，甚至致盲。因此，單純皰疹病毒性角膜炎發病是病毒和免疫雙重作用的結果。單純皰疹病毒性角膜炎降低患者的視覺質量，嚴重影響患者的生活，而且給家庭和社會造成巨大的負擔。目前，單純皰疹病毒性角膜炎尚無特效防治方法。因此，研制一種可以防止感染HSV-1的疫苗具有遠大前景。

新型核酸疫苗誘導機體產生免疫應答的過程和病毒自然感染過程相似，但缺乏完整病毒結構，降低了傳統減毒或者滅活疫苗病毒感染的風險，同時更穩定，易于改造和構建［2］。本研究通過聯合應用生物信息學預測軟件，預測出HSV-1糖蛋白B（glycoprotein B，gB）和糖蛋D（glycoprotein D，gD）的潛在T細胞表位，結合數據庫中已知表位，成功構建了HSV-1的T細胞多表位核酸疫苗，為今后的HSV-1核酸疫苗進一步研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

293T細胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司；真核表達質粒pVAX、HA-Tag購自上海吉凱基因科技有限公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；PBS購自中國雙螺旋公司；胰酶購自中國碧云天公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；TureColor雙色預染蛋白Marker購自中國上海生工生物有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；C57BL/6小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司；殼聚糖購自美侖生物技術有限公司；γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）ELISA試劑盒購自聯科生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HSV-1 T細胞表位重組串聯抗原疫苗的設計：登錄美國國家生物技術信息中心網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得HSV-1（17株）gB和gD的氨基酸序列。登錄免疫表位數據庫（Immune Epitope Database，IEDB，http：//www.iedb.org）查閱已發表的表位，結合相關文獻，篩選出gB和gD的無癥狀表位。T細胞表位的預測采用生物信息學軟件Syfpeithi（http：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）和IEDB［3］。將各表位按照在基因組上的序列進行串聯，為了保證各表位的獨立性，更好地發揮免疫效應，避免連接區產生新的表位，表位間加入甘氨酸絲氨酸（glycine serine，GS）做為間隔序列。同時，在序列起始部加入免疫球蛋白IgE引導序列MDWTWILFLVAAATRVHS，增加DNA疫苗的表達。末端加入HA-Tag標簽進行標記，兩端加入NheⅠ/XhoⅠ酶切位點［4］。利用DNAMAN，將設計的多表位氨基酸序列復原成核苷酸序列，同時優化密碼子，設計合成多表位基因盒，將其命名為Tg。

1.2.2 重組真核表達質粒pVAX-Tg的構建：設計合成的多表位基因盒Tg由上海吉凱基因科技有限公司合成并定向克隆入質粒pVAX，重組的質粒命名為pVAX-Tg。

1.2.3 293T細胞的培養和轉染：293T細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中。選擇生長良好的細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁、細胞生長至密度約為70%時，采用Lipofectamine 2000進行轉染，轉染方法參見轉染試劑說明書。同時設置 pVAX空載體轉染對照組，繼續培養細胞48 h。

1.2.4 Western blotting檢測體外轉錄和翻譯：質粒轉染293T細胞48 h后，提取細胞總蛋白進行Western blotting檢測，用15%聚丙烯酰胺凝膠恒壓80 V電泳2.5 h。先進行考馬斯亮藍染色，觀察到清晰的條帶，進行脫色。脫色結束后，將凝膠進行掃描或照相，轉印至PVDF膜后封閉。孵育一抗，脫脂奶粉稀釋一抗HA-Tag 抗體，稀釋比例為1∶1 000，制成一抗工作液，倒入雜交袋中，放入PVDF膜，壓膜機封口進行一抗孵育。一抗孵育結束后，取出PVDF膜浸入TBST液中，輕搖搖床5 min，重復上述步驟4次。繼續孵育二抗，稀釋二抗羊抗小鼠IgG-HRP，稀釋比例為1∶5 000，制成二抗工作液，倒入雜交袋中，放入PVDF膜，壓膜機封口，進行二抗孵育。二抗孵育結束后，從雜交袋中取出PVDF膜浸入TBST液中，搖動搖床5 min，重復此操作6次。底物化學發光ECL法顯影，置于暗室中進行膠片曝光。

1.2.5 制備殼聚糖疫苗并免疫動物：殼聚糖溶解在的NaAc-HAc溶液中配制成殼聚糖溶液，將DNA質粒溶解在Na2SO4溶液中，將2種溶液預熱到55 ℃，等體積混合渦旋30 s，制成殼聚糖疫苗。選取健康雌鼠C57BL/6小鼠12只，分為實驗組和對照組，每組6只。2組小鼠在適宜生活環境下喂養1周后再建立模型。免疫情況：實驗組小鼠肌肉多點注射pVAX-Tg，每只鼠100 μg/40 μL；對照組小鼠肌肉多點注射pVAX，每只鼠100 μg/40 μL。每隔2周免疫1次，共免疫3次，末次免疫1周后取血并分離血清。

1.2.6 ELISA試劑盒檢測小鼠血清IFN-γ濃度：洗板并拍干后加樣，復孔加入標準品，空白孔復孔加入標準品稀釋液，樣本孔加入血清樣本，每孔加入檢測抗體。封板膜封板震蕩，室溫孵育2 h。棄去液體洗滌，每孔加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。封板膜封板，振蕩，室溫孵育45 min洗板，每孔加顯色底物TMB，避光室溫孵育20 min。每孔加終止溶液，終止反應。測定并校準吸光度值，計算出相應的濃度。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HSV-1 gB和gD抗原的T細胞表位

根據文獻［5-7］，篩選出3條HSV-1 gB的無癥狀表位，2條HSV-1 gD的無癥狀表位。見表1。

利用生物信息學軟件Syfpeithi和IEDB，預測出HSV-1 gB和gD抗原的T細胞表位，分別命名為T1～T8。見表2。

表1 HSV-1 gB和gD的無癥狀表位Tab.1 Asymptomatic epitopes of HSV-1 gB and gD

表2 篩選的HSV-1 gB和gD的預測表位Tab.2 Predicted epitopes within HSV-1 gB and gD

將各表位按照其在基因組上的順序進行串聯，表位間加間隔序列GS和內源性蛋白水解酶位點RGRKRRS，并加入免疫球蛋白IgE引導序列和HATag標簽。根據設計的多表位氨基酸序列復原成核苷酸序列，并命名為Tg，序列如下：ATGGATTGGACTT GGATTTTATTTTTGGTTGCTGCCGCAACCCGTGTCC ATTCTTACCCTTATGATGTCCCAGACTATGCTTTCG TAGTGTGGGCGCTTCTCGGTCTAGGCTCCACAGTT GCTGCCGGACACGCAACGCTGGGGTCAAATTTATT GACTACCCCTAAATTTACAGGTTCGTATCTTGCGA ACGGCGGATTCCTCATCGGGAGTAGCTCTATAGA ATTTGCTCGCCTAGGTTCCCGAATGCTGGGCGACG TCATGGCCGTAGGATCAGCATTAGCGGTGGGGTT GCTTGTTCTCCGGGGTAGAAAGAGGCGTTCGGCTG TCATTCTATTCGTAGTGATCGTTGGCAGTATACTGT TTGTCGTAATTGTGGGATTAGGGAGCGCCTTGGTT GATGCATCTCTTAAAATGGGTTCCTCACTCCCCAT CACGGTCTACTATGCGGGCTCGAGTCTACCAATAA CTGTATACTATGCTGGAAGCACCGTGGCCGTTTAC TCTCTGAAGATTTAA。將設計合成的多表位基因盒Tg交付給上海吉凱基因科技有限公司合成并定向克隆入質粒pVAX，重組的質粒命名為pVAX-Tg。

2.2 重組質粒pVAX-Tg的真核細胞表達

SDS-PAGE凝膠電泳結果證實目的蛋白成功分離，SDS-PAGE凝膠電泳后進行Western blotting鑒定。結果顯示，實驗組pVAX-Tg出現了帶HA-Tag標簽的陽性識別條帶，大小約18×103。而對照組pVAX未見帶HA-Tag標簽陽性識別條帶，無目的蛋白的表達。見圖1。

圖1 pVAX-Tg的體外表達Fig.1 In vitro translation to detect pVAX-Tg expression

2.3 接種重組質粒pVAX-Tg后小鼠產生細胞免疫反應

IFN-γ是由T細胞產生的具有廣泛抗病毒和免疫調節作用的細胞因子，本研究采用ELISA法檢測小鼠血清IFN-γ濃度，監測細胞免疫的變化［8］。實驗組小鼠接受重組質粒pVAX-Tg免疫，對照組小鼠接受空載體質粒pVAX免疫，實驗組和對照組小鼠血清IFN-γ濃度分別為（270.815±61.347）pg/mL和（96.428±20.452）pg/mL，實驗組明顯高于對照組（P＜0.001）。

3 討論

HSV-1為廣泛存在于自然界的雙鏈DNA病毒，由核衣殼和包膜組成。核衣殼參與病毒的復制，包膜促進HSV-1吸附宿主細胞。HSV-1包膜表面存在12種糖蛋白，分別為gB、gC、gD、gE、gG、gI、gH、gL、gJ、gM、gN和gK，糖蛋白在介導病毒入侵細胞和發揮免疫原性中起到重要作用。在這12種糖蛋白中，gB、gD的免疫原性最強，在介導病毒入侵和病毒潛伏中發揮重要作用，誘發機體產生強烈的體液免疫和細胞免疫，而且gB、gD的蛋白質序列高度保守，不易突變［9］，因此本研究選取gB和gD的表位做為候選表位。雖然單一接種gB或gD核酸疫苗可以起到一定的免疫作用，但是免疫作用弱，保護作用不足以清除病毒感染，目前研究熱點主要是gB、gD多表位核酸疫苗。

近年來，生物信息學廣泛用于醫學領域，在醫學各個領域做出突出貢獻。本研究通過生物信息學預測軟件預測HSV-1的gB、gD潛在T細胞抗原表位，聯合運用多種軟件增加準確性，結合已發表文獻中報道的明確具有保護作用的抗原表位，將預測表位和已知表位串聯起來，設計合成HSV-1多表位核酸疫苗。為了增加DNA疫苗的免疫原性，在起始段加入IgE引導序列，該免疫佐劑安全有效，對眼表無副作用，同時易于操作。序列間加入GS間隔序列和內源性蛋白水解酶位點RGRKRRS，使各表位獨立發揮免疫作用，避免形成新的表位［4］。利用DNAMAN對序列進行優化選擇，將氨基酸序列復原成核苷酸序列，將核苷酸序列克隆入質粒pVAX，成功構建重組多表位核酸疫苗pVAX-Tg。該疫苗可在真核細胞中成功表達目的蛋白，與空載體相比，C57BL/6小鼠接種疫苗后血清IFN-γ顯著升高，差異有統計學意義。IFN-γ具有很強的免疫調節作用，對清除病毒有重要意義，可作為觀察疫苗是否有效的可靠指標［8］。

綜上所述，本研究成功構建重組多表位核酸疫苗pVAX-Tg，并證實該疫苗能產生明顯的免疫反應，為單純皰疹病毒性角膜炎的防治提供了新的方向，具有一定意義。今后還需進一步探討更多針對疫苗的研究策略。