miR-124a和miR-449a對(duì)非小細(xì)胞肺癌的診斷價(jià)值

彭焦武，孫承謀

（1.枝江市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 枝江 443200；2.宜昌市夷陵醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 宜昌 443100）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的70%～85%，雖然近年來在肺癌的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但肺癌預(yù)后仍然較差，5年總生存率（overall survival，OS）＜15%[1]。缺乏早期篩查和診斷NSCLC的有效生物標(biāo)志物是大多數(shù)NSCLC患者被診斷時(shí)已處于晚期的原因，這直接導(dǎo)致了此類癌癥患者的高死亡率[2]。因此，臨床迫切需要尋找用于早期診斷NSCLC的新的生物標(biāo)志物。有研究結(jié)果顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）在各種類型的癌癥中異常表達(dá)，并作為癌基因或抑癌基因來調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)過程，如腫瘤發(fā)生、分化、增殖、凋亡、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。特定miRNA的失調(diào)也可用于預(yù)測各類腫瘤患者的預(yù)后[4]。同時(shí)，由于miRNA足夠穩(wěn)定，可在血清中被檢測到，因此可作為早期診斷腫瘤和判斷預(yù)后的潛在非侵入性生物標(biāo)志物。有研究結(jié)果顯示，血清miRNA可以作為直腸癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等的診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物，在這些異常表達(dá)的miRNA中，有4種miRNA[微小RNA-124a（microRNA-124a，miR-124a）、微小RNA-449a（microRNA-449a，miR-449a）、微小RNA-146（microRNA-146，miR-146）、微小RNA-106a（microRNA-106a，miR-106a）]與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程有關(guān)[5]。miR-124a在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，其過表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。此外，miR-449a是與腫瘤進(jìn)展有關(guān)的致癌基因或抑癌基因[7]。目前，關(guān)于NSCLC患者血清miR-124a和miR-449a表達(dá)的研究較少。因此，本研究擬通過檢測NSCLC血清miR-124a和miR-449a水平，探討miR-124a、miR-449a與NSCLC的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年1月—2016年12月枝江市人民醫(yī)院行手術(shù)切除腫瘤的原發(fā)性NSCLC患者90例（NSCLC組），其中男62例、女28例，年齡（67.89±8.16）歲。所有患者均隨訪36個(gè)月，根據(jù)術(shù)后復(fù)發(fā)情況分為復(fù)發(fā)組56例（男39例，女17例）和未復(fù)發(fā)組34例（男23例，女11例）。選擇同期枝江市人民醫(yī)院確診的肺部良性結(jié)節(jié)患者60例（良性結(jié)節(jié)組），其中男37例、女23例，年齡（66.92±12.54）歲。選擇同期枝江市人民醫(yī)院健康體檢者80名（正常對(duì)照組），其中男52名、女28名，年齡（66.18±10.28）歲。本研究經(jīng)枝江市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)明確診斷，符合《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）》[8]；（2）有完整的臨床病歷或體檢資料，無其他遺傳病；（3）入組前未進(jìn)行過治療或藥物干預(yù)；（4）治療期間無死亡，均出院隨訪。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）患心血管疾病者，合并嚴(yán)重肝、腎功能不全者，存在第二原發(fā)腫瘤者；（2）近3個(gè)月內(nèi)服用過抗菌藥物者；（3）合并其他結(jié)締組織疾病、內(nèi)分泌和代謝性疾病者；（4）有精神病史或精神病家族史者。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集及樣本采集 收集所有對(duì)象的基本資料，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）。采集所有對(duì)象空腹靜脈血6 mL，分成2管，一管加入1 mL TRIzol試劑（北京索來寶科技有限公司，批號(hào)：15596-026）后-80 ℃保存?zhèn)溆茫涣硪还芤?00×g離心10 min，分離血清。

1.3.2 血紅蛋白（hemoglobin，Hb）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）檢測 采用BC5390全自動(dòng)血液分析儀（深圳邁瑞公司）及配套試劑檢測Hb。采用cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑測定血清NSE水平。

1.3.3 miR-124a和miR-449a檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測血清miR-124a和miR-449a水平。取出加入TRIzol試劑的血液樣本，室溫下放置10 min，待完全溶解后加入600 μL氯仿，混勻直至溶液乳化為乳白色，靜置5 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，將頂部的無色上清液小心吸取到離心管中，加入等體積異丙醇，12 000×g離心10 min，然后加入75%乙醇1 mL洗滌沉淀物，獲得總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳測試RNA的完整性。選擇合格的RNA樣本進(jìn)行互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）合成。根據(jù)Taq Man microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國ABI公司）說明書，在37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min條件下合成cDNA。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量PCR試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。檢測儀器為ABI 7500 PCR儀（美國ABI公司）。miR-124a引物序列：上游引物 5'-GGTAAGGCACGCGGT-3'，下游引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；miR-449a引物序列：上游引物5'-TGCGCTAGCTTATCAGACTGAT-3'，下游引物5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'；內(nèi)參U6引物序列：上游引物5'-CTGGTTAGTACTTGGACGG-GAGAC-3'，下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-124a和miR-449a的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估m(xù)iR-124a、miR-449a與NSE的相關(guān)性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估NSE、miR-124a和miR-449a診斷NSCLC的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組、良性結(jié)節(jié)組和正常對(duì)照組一般資料及miR-124a、miR-449a水平的比較

NSCLC組血清NSE水平高于正常對(duì)照組和良性結(jié)節(jié)組（P＜0.05），血清miR-124a和miR-449a水平低于正常對(duì)照組和良性結(jié)節(jié)組（P＜0.05）。正常對(duì)照組與良性結(jié)節(jié)組之間血清NSE、miR-124a和miR-449a水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組之間年齡、性別、BMI、吸煙史和Hb差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 NSCLC組、良性結(jié)節(jié)組和正常對(duì)照組一般資料及血清miR-124a、miR-449a水平的比較

2.2 NSCLC患者未復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組一般資料及miR-124a、miR-449a水平的比較

與未復(fù)發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組血清NSE水平升高（P＜0.05），血清miR-124a和miR-449a水平降低（P＜0.05）。2個(gè)組之間年齡、性別、BMI、吸煙史、腫瘤直徑、病理類型和TNM分期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 NSCLC患者miR-124a、miR-449a及NSE的相關(guān)性

miR-124a與miR-449a呈正相關(guān)（r=0.441，P＜0.05），miR-124a、miR-449a與NSE均呈負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.377、-0.528，P＜0.05）。

表2 未復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組一般資料及miR-124a、miR-449a水平的比較

2.4 NSE、miR-124a和miR-449a單項(xiàng)及聯(lián)合檢測診斷NSCLC的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，NSE、miR-124a和miR-449a單項(xiàng)診斷NSCLC的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.660、0.703、0.759。在3項(xiàng)指標(biāo)組合檢測中，NSE+miR-124a+miR-449a聯(lián)合檢測診斷NSCLC的AUC（0.895）和敏感性（96.25%）均最高，miR-124a+miR-449a聯(lián)合檢測診斷NSCLC的特異性最高（90.31%）。見表3、圖1。

表3 NSE、miR-124a和miR-449a單項(xiàng)及聯(lián)合檢測診斷NSCLC的ROC曲線參數(shù)

圖1 NSE、miR-124a及miR-449a單項(xiàng)及聯(lián)合檢測診斷NSCLC的ROC曲線

3 討論

目前，臨床一般依據(jù)病理檢查結(jié)果對(duì)NSCLC進(jìn)行診斷和預(yù)后評(píng)估[9]。但病理檢查屬于侵入式檢查方法，通常需要通過肺穿刺、活檢或支氣管鏡獲得組織或細(xì)胞，操作不便，且有創(chuàng)傷，故不易被患者接受[10]。因此，臨床需要一種用于NSCLC早期診斷和預(yù)后評(píng)估的無創(chuàng)、易于使用且準(zhǔn)確度較高的生物標(biāo)志物。miRNA通常被定義為調(diào)控分子，miRNA的異常表達(dá)與各種類型的腫瘤有關(guān)[11]。目前已發(fā)現(xiàn)miRNA在包括血清、尿液和唾液在內(nèi)的體液中穩(wěn)定表達(dá)，因此miRNA有望成為可用于腫瘤診斷、預(yù)后判斷或治療監(jiān)測的指標(biāo)[12]。然而，大多數(shù)研究關(guān)注于組織樣本中miRNA水平的變化，只有少數(shù)研究探討了血清miRNA作為生物標(biāo)志物的實(shí)用性[13]。因此，本研究探討了miRNA在NSCLC診斷中的潛在價(jià)值。

miR-124a和miR-449a在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中都有重要的作用。有研究結(jié)果顯示，miR-124a對(duì)T細(xì)胞的增殖、分化和生長具有重要的調(diào)控作用[14]。miR-449a可引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并抑制信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），從而降低受體細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平，這間接抑制了人支氣管上皮樣細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[15]。乳腺癌、B細(xì)胞淋巴瘤、肺癌和結(jié)腸癌等多種實(shí)體惡性腫瘤中miR-124a和miR-449a表達(dá)降低[16]。此外，miR-124a和miR-449a表達(dá)升高可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[17]。本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和良性結(jié)節(jié)組血清miR-124a和miR-449a水平變化不顯著，但NSCLC組血清miR-124a和miR-449a水平顯著下降，且復(fù)發(fā)的NSCLC患者血清miR-124a、miR-449a水平低于未復(fù)發(fā)的NSCLC患者。

有些血清標(biāo)志物，如NSE、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等已被廣泛用于NSCLC的診斷、預(yù)后評(píng)估、療效監(jiān)測[18-19]。本研究比較了miR-124a、miR-449a與NSE診斷NSCLC的效能。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-124a、miR-449a和NSE診斷NSCLC的AUC分別為0.703、0.759和0.660，敏感性分別為81.46%、72.16%、82.61%，特異性分別為55.37%、73.26%、44.72%。miR-124a和miR-449a的診斷效能優(yōu)于NSE，這提示血清miR-124a和miR-449a或可作為診斷NSCLC的生物標(biāo)志物。由于miR-124a、miR-449a診斷NSCLC的特異性較低。因此，本研究比較了miR-124a、miR-449a和NSE不同組合診斷NSCLC的效能，結(jié)果顯示NSE+miR-124a+miR-449a聯(lián)合檢測診斷NSCLC的AUC（0.895）和敏感性（96.25%）均最高，miR-124a+miR-449a聯(lián)合檢測的特異性最高（90.31%）。

綜上所述，NSCLC患者血清miR-124a和miR-449a水平降低，NSCLC復(fù)發(fā)患者更低，因此miR-124a和miR-449a或可作為輔助診斷NSCLC的血清學(xué)標(biāo)志物。但本研究為橫斷面研究，得出的結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。