沙眼衣原體DNA質控物的制備及評價

胥明勇，朱華強，吳泳樺，莊利東

（綿陽市中心醫院檢驗科，四川 綿陽 621000）

目前，實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）因其特異好、靈敏度高、快速方便、能有效避免擴增產物污染等優點，已成為分子生物學研究的重要工具[1]。然而，為了確保PCR測定結果準確，必須有嚴格的室內質控措施[2]。臨床實驗室進行分子診斷項目室內質控時，應首先考慮質控物穩定性，但目前尚未見基質與檢測樣本一致的沙眼衣原體（Chlamydiatrachomatis，CT）DNA質控物的相關報道。本PCR實驗室利用臨床陰、陽性樣本制備質控物，并對其穩定性進行評價。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集綿陽市中心醫院無血性、無常見其他感染性疾病患者CT DNA為強陽性的宮頸分泌物樣本1例，檢測循環閾值（cycle threshold，Ct值）為25.53；另收集無血性、無常見其他感染性疾病患者CT DNA陰性宮頸分泌物樣本2例，混勻后檢測結果為陰性，且內標結果為陽性。

1.2 儀器與試劑

采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）進行檢測，CT DNA檢測試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 質控物制備 將強陽性宮頸分泌物進行56 ℃、30 min滅活后，用陰性樣本將強陽性樣本15倍稀釋后制備成陽性質控物，檢測Ct值為30.40；再用陰性樣本將陽性質控物15倍稀釋后制備成弱陽性質控物，檢測Ct值為35.30。將制備好的質控物分裝于0.6 mL離心管中，標記后分別于-20 ℃和-70 ℃保存。

1.3.2 穩定性評價 （1）采用2種方法對質控物融解穩定性進行評價。從-20℃冰箱中隨機抽取48支樣本，隨機分為A組和B組，每組各24支樣本，A組37 ℃水浴復融15 min，B組室溫（22 ℃）放置15 min復融，混勻后每支樣本測定1次。另外，再隨機抽取2支該質控物樣本，37 ℃水浴復融混勻，每支測定2次，再置于-20 ℃冰箱中冷凍保存1 d后再進行測定。如此重復3次，評價融解方式和融解次數對質控物穩定性的影響，并計算融解次數的相對偏差范圍。（2）-20 ℃冷凍保存穩定性評價。從-20 ℃冰箱中隨機抽取2支樣本，每月測定1次，每支樣本37 ℃水浴復融混勻檢測2次，連續測定3個月。采用一元線性回歸方法分析所測數據。（3）-70 ℃冷凍保存穩定性評價。從-70 ℃冰箱中隨機抽取2支樣本，每2個月測定1次，每支樣本37 ℃水浴復融混勻檢測2次，連續測定12個月。采用一元線性回歸方法分析所測數據。

1.4 統計學方法

應用SPSS 19.0軟件進行數據分析。融解方式對質控物穩定性影響的計量資料比較采取配對t檢驗，計數資料比較采用連續校正χ2檢驗。冷凍保存穩定性評價采取一元線性回歸方法進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 陽性質控物穩定性評價

2.1.1 融解次數和融解方式對質控物穩定性的影響 復融3次測定Ct值與初次測定Ct值的相對偏差為1.10%～5.03%，其偏差在《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》（CNAS-CL02-A009）文件規定的范圍內[3]，說明融解次數對測定結果并無明顯影響。對A組和B組進行配對樣本t檢驗，t值為-0.732，P值為0.483，說明融解方式對測定結果并無明顯影響。

2.1.2 -20 ℃冷凍保存穩定性評價結果 一元線性回歸分析結果顯示，在3個月內，質控物隨保存時間的延長沒有顯著趨向變化。見表1。

表1 -20℃冷凍保存穩定性評價結果

2.1.3 -70 ℃保存條件下穩定性評價結果 一元線性回歸分析結果顯示，在12個月內，質控物隨保存時間的延長沒有顯著趨向變化。見表2。

表2 -70℃保存條件下穩定性評價結果

2.2 弱陽性質控物穩定性評價

2.2.1 融解次數和融解方式對質控物穩定性的影響 復融3次測定Ct值與初次測定Ct值的相對偏差為-5.39%～-4.04%，其偏差在《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》（CNAS-CL02-A009）文件規定的范圍內[3]，說明融解次數對測定結果并無明顯影響。對A組和B組進行χ2檢驗，χ2值為4.923，P值為0.027，說明融解方式對測定結果有明顯影響。A組和B組均有假陰性結果，其中A組有1例，B組有8例。

2.2.2 -20 ℃冷凍保存穩定性評價結果 一元線性回歸分析結果顯示，在3個月內，質控物隨保存時間的延長沒有顯著趨向變化。見表3。

2.2.3 -70 ℃保存條件下穩定性評價結果 一元線性回歸分析結果顯示，在12個月內，質控物隨保存時間的延長沒有顯著趨向變化。見表4。

表3 -20℃冷凍保存穩定性評價結果

表4 -70℃保存條件下穩定性評價結果

3 討論

CT是一種性傳播疾病的病原體，在細胞內寄生，易感染柱狀上皮細胞，會引起男、女性生殖道及泌尿道感染，從而導致盆腔炎、輸卵管損傷，甚至不孕不育[4]。在CT的諸多檢測方法中，實時熒光PCR已經成為醫學實驗室主要的檢測方法，為了得到準確的檢測結果，室內質控尤為重要。要做好室內質控，首先要有穩定、可靠的質控物，可應用于醫學PCR實驗室的質控物應具備以下幾個條件[5]：（1）基質與檢測樣本一致；（2）所含待測物濃度接近實驗的控制水平；（3）靶值或者預期結果已定；（4）無已知的生物傳染危險；（5）單批可大量獲得；（6）有很好的穩定性。本研究制備的質控物基本具備以上條件：質控物基質同樣本一致，能夠防止質控物基質中的抑制物對檢測結果產生影響；制備的陽性質控物能敏感地反映核酸提取有效性；為了確保無常見感染性疾病病原體，將質控物經56 ℃、30 min滅活；一次性可獲得使用1年以上的質控物量，可起到長期監測實驗室檢測質量的作用。

目前，醫學實驗室常見的CT DNA質控物一般為尿液、細胞培養物和含有單一目的片段的質粒，均存在不同缺點[6]。因臨床常見樣本為生殖道分泌物，若質控物為尿液樣本，其基質與檢測樣本不一致，可能對常規質控產生影響。細胞株作為質控物有許多優點，如能夠模擬臨床樣本進行全程監控、穩定性好、無生物傳染性等[7]，但其制備的周期長、成本較高。若質控物以質粒作為樣本，不需要裂解提取所需要的模板，無法模擬臨床樣本提取過程，所以起不到全程質控的作用。本實驗室制備的CT DNA質控物均能避免這些缺點。

Ct值是實時熒光PCR擴增過程中熒光信號達到指數擴增時的循環數，其大小與病原體載量呈負相關[8]。蔣義等[9]在血液病毒核酸篩查室內質控方法的研究中發現，質控物濃度與Ct值呈高度相關，因此Ct值能夠作為實時熒光PCR定量參數，也可以作為統計學計量資料。根據CNAS-CL02-A009文件規定[3]：定性檢測項目每次試驗應設置陰性、弱陽性和/或陽性質控物，因此將質控物制備成陽性和弱陽性進行評價，符合實驗室室內質控的要求。

本研究制備的質控物評價結果表明，陽性和弱陽性質控物復融3次對測定結果并無明顯影響；陽性和弱陽性質控物在-20 ℃冷凍保存3個月和-70 ℃冷凍保存12個月，隨保存時間的延長沒有顯著趨向變化，說明質控物在該溫度下保存穩定。在室溫（22 ℃）、37 ℃水浴條件下復融，各隨機抽取48支陽性和弱陽性質控物樣本，隨機分為A組和B組，每組各24支樣本，進行復融方式評價，結果顯示，陽性質控物檢測結果全部為陽性，統計學分析結果顯示，復融方式對檢測結果無影響。弱陽性質控物在37 ℃水浴條件下復融混勻檢測，有1例假陰性樣本，而在室溫（22 ℃）條件下復融混勻檢測，卻有8例假陰性樣本，提示弱陽性分泌物樣本復融應采取37 ℃水浴融解方式，其穩定性最好。弱陽性質控物在2種條件下復融后均出現了假陰性結果，即使在其他條件下的穩定性評價結果是通過，也不能應用于醫學實驗室。產生假陰性結果的原因可能與細胞本身易聚集黏附的性質有關[10]，還可能與質控物本身濃度高低有關[11]，具體分析后，推測原因可能為：（1）37 ℃水浴可能會消除細胞間以及細胞與管壁之間聚集黏附問題，基本上不會造成漏取感染細胞，而室溫（22 ℃）融解卻不能完全消除細胞聚集黏附問題，可能會漏取感染細胞；（2）陽性質控物比弱陽性質控物濃度高，即使漏取少許感染細胞也不影響定性結果，而弱陽性質控物本身濃度低，漏取少許感染細胞有可能會導致假陰性結果。標準物質在保證核酸檢測準確性方面起非常重要的作用[12]，當陽性質控物檢測結果為假陰性時，通過檢測該標準物質能夠盡快查找失控原因。

本研究制備的質控物基質與檢測樣本相同，能夠防止基質效應的影響，而且制備質控物樣本易收集，能夠單批大量獲得，從而極大地降低成本。陽性質控物因穩定性達到標準，可以應用于臨床實驗室，能起到監測實驗室檢測質量的作用。

本研究不足之處在于在評價融解次數和冷凍保存對穩定性的影響方面，質控物評價樣本量不足，不能完全保證評價準確性，后續研究將擴大樣本量，以得到更科學、更客觀的結果。