濾紙搭橋法在食品檢驗中對沙門菌血清型鑒定的應用探究

吳欣欣，程 媛，余土養，潘梅珍

婺源縣疾病預防控制中心 (上饒 333200)

沙門菌屬是引起食物中毒的重要病原菌，該菌的株型繁多，迄今世界上已鑒定出2 500多個不同的沙門菌血清型，分屬于近50個血清組[1]。我國已檢出的血清型數至少320個，食物中毒檢出率最高的依次是腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌、都柏林沙門菌四個血清型[2]。因此正確鑒定沙門菌的血清型對確定人和動物沙門菌病的感染源及降低沙門菌病發病率有重要的意義。為提高沙門菌血清分型的準確性，在GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》的基礎上[3]，對用簡易平板法無法準確確定血清分型的沙門菌用濾紙搭橋法[4,5]做進一步的鞭毛抗原誘導及血清型鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料

血平板，批號20190927，有效期20191226，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；半固體培養基，批號20180423，有效期3年，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；沙門氏菌屬診斷血清，批號20190101，有效期20210106， 寧波天潤生物藥業有限公司；生理鹽水，本中心實驗室自配；沙門菌菌株， 菌株均分離于2015～2019年婺源縣疾病預防控制中心食品污染物和有害因素風險監測的食品(生畜肉、即食食品、預制水產品、外賣等)，所有菌株均已做生化鑒定，同時已用診斷血清作玻片凝集試驗，確定了O群和一個H位相，并且另一H位相暫時無法確定。

1.2 主要儀器與設備

無菌手術刀；無菌小鑷子；0.5 cm×1.5 cm無菌濾紙(用普通濾紙剪成所要求尺寸后包裝好經高壓滅菌后使用)；LRH-150型生化培養箱，36 ℃±1 ℃，上海一恒科技股份有限公司；BSC-1500Ⅱ型生物安全柜，過濾效率>99.999%，山東鑫貝西生物技術股份有限公司；微生物實驗室常規滅菌及培養設備。

1.3 方法

1.3.1簡易平板法[3]

將0.35%～0.40%半固態瓊脂平板烘干表面水分，挑取待檢菌株相應的抗血清一環，滴在半固態平板表面，放置片刻，待血清吸收到瓊脂內，在血清部位的中央點種待檢菌株，36 ℃±1 ℃培養24～48 h，取成蔓延生長的菌苔邊緣菌落進行血清型鑒定。通常要進行數次誘導培養，確定另一相H位相，如經多次誘導仍未出現另一位相，而且誘導方法可靠，則應考慮此菌株可能是單相菌[2]。

1.3.2濾紙條搭橋法[4,5]

用無菌手術刀沿血平板中間線切除一條0.5～1.0 cm寬的培養基，將血平板上的培養基分成沒有接觸點的A、B 2個獨立區域，用無菌小鑷子夾取2根濾紙條架于 2個獨立區域之間，形成A、B區域間兩條相距2 cm的“橋”。

在濾紙條中間滴加待檢菌株相應的因子血清10～15 μL，同時用接種環取少量菌苔輕輕涂抹在A區濾紙條邊緣的血培養上，36 ℃±1 ℃倒置培養24～48 h，利用濾紙條的吸附作用，菌落沿濕潤濾紙條向另一端蔓延生長，途中已知H抗原被濾紙條上的抗血清吸附，取B區新生長的菌苔邊緣菌落進行血清型鑒定。

2 結果與討論

2.1 簡易平板法及菌株培養

圖1為加因子血清Hd后的半固體培養基平板，待血清吸收到瓊脂內，在血清部位的中央點種已知O抗原4,5,12和H抗原d的待分型沙門菌，于37 ℃誘導培養48 h。圖2為培養48 h后的半固體培養基平板，菌落呈片狀生長，取邊緣菌落玻片凝集試驗，未發現可凝集的H血清，可判斷此沙門菌的抗原結構為4,5,12:d:-。

圖1 加因子血清后的半固體培養基平板

圖2 誘導培養48 h后的半固體培養基平板

2.2 濾紙條搭橋及菌株培養

圖3為已分區、加濾紙條搭橋后的血平板，A區濾紙條邊緣分別接種待檢沙門菌，于37 ℃誘導培養48 h。1號濾紙條A區接種已知O抗原4,5,12和H抗原d的待分型沙門菌，濾紙條中間滴加Hd；2號濾紙條A區接種已知O抗原4,5,12和H抗原1,2的待分型沙門菌，濾紙條中間滴加H1,2；3號濾紙條A區接種已知O抗原4,5,12和H抗原i的待分型沙門菌，濾紙條中間滴加Hi；4號濾紙條A區接種已知O抗原4,5,12和H抗原i的待分型沙門菌，濾紙條中間滴加Hi。

圖3 已分區、加濾紙條搭橋的血平板

圖4為誘導培養48 h后的血平板，可以看出1、2號濾紙條B區有菌落生長，取濾紙條邊緣菌落做玻片凝集試驗，1號濾紙條B區菌落H抗原1,2凝集，抗原結構為4,5,12:d:1,2；2號濾紙條B區菌落H抗原e,h凝集，抗原結構為4,5,12:e,h:1,2；3、4號濾紙條B區無菌落生長，可判斷3、4號A區接種的待分型沙門菌抗原結構均為4,5,12:i:-。

圖4 誘導培養48 h后的血平板

2.3 血清型鑒定結果

表1 食品中檢出沙門菌的血清型鑒定結果

依據世界衛生組織國際沙門菌中心在2007年公布的第九版White-Kauffmann-Le Minor 抗原表(簡稱K-W表)，對食品中檢出沙門菌進行血清型確定，血清型鑒定結果如表1所示。其中，鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、里森沙門菌、都柏林沙門菌用簡易平板法和濾紙條搭橋法檢出相同的抗原結構，查K-W表可確定里森沙門菌，腸炎沙門菌，都柏林沙門菌。同時K-W表上顯示鼠傷寒沙門菌存在i單相變種，故也可以確定鼠傷寒沙門菌。另外，斯坦利沙門菌、圣保羅沙門菌、維爾肖沙門菌和病牛沙門菌的菌株在瓊脂斜面上經三次傳代后用簡易平板法仍不能誘導出未知H抗原，同時在K-W表上未找到與其抗原結構匹配的單相菌，不能準確分型，但是經濾紙條搭橋法能快速得到H抗原結構，準確確定另一H位相。由以上結果可以看出，濾紙條搭橋法與簡易平板法相比較，傳代次數更少，所耗時間更為短暫，且血清分型結果更為準確。

3 結論

研究表明，世界上已鑒定出的沙門菌血清型數有2 500多個，能夠感染人類的致病菌株主要集中于4個血清組(即血清組A、B、C和D)，其中傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌、丙型副傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌、嬰兒沙門菌、腸炎沙門菌、豬霍亂沙門菌和雞沙門菌等8種血清型是最常見的感染人體和禽畜類動物的菌型[1,5]。我國已檢出的血清型數至少320個，其中引起食物中毒檢出率最高的依次是腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌、都柏林沙門菌四個血清型，其次為明斯特沙門菌、里森沙門菌和斯坦利沙門菌[2,6]。故正確鑒定沙門菌的血清型對確定人和動物沙門菌病的感染源及降低沙門菌病發病率有重要的意義。

隨著分子分型技術的發展，采用多重PCR、脈沖場凝膠電泳、液相懸浮芯片技術等越來越多的方法可以快速準確的對沙門菌進行血清分型[7-11]。但是在實際檢驗工作中，大部分縣級基層實驗室尚不能達到分子分型技術要求，運用血清分型仍是鑒定沙門菌最廣泛、最基礎的分型方法。由于大多數沙門菌具有兩個或者更多的位相，通常位相之間能發生可逆性變異，一般不能直接確定所有位相，要用位相變異試驗方法通過已知位相確定其另一位相。目前，應用國家標準GB 4789.4—2016中的血清學鑒定方法，多數能做到血清分型，但是仍有部分沙門菌常遇到凝集效價不高、結果不易判斷、傳代多次依然不能準確分型。本實驗是在國家標準GB 4789.4—2016血清學鑒定方法的基礎上，對結果仍不明確的菌株采用濾紙條搭橋法進行進一步鞭毛誘導及鑒定，雖然試驗菌株只有31株，依據不夠充足，但已知結果表明濾紙條搭橋法對沙門菌的鞭毛抗原誘導效果更佳，耗時更短，準確性更高，在沙門菌血清分型實際檢驗工作中可以把濾紙條搭橋法作為國家標準GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》方法的補充。