水產養殖中好氧反硝化細菌的篩選及評價研究進展

馬青山 李 艷

(聊城大學農學院，聊城252000)

我國是全球最大的水產養殖國家，養殖水產品總量逐年增長。據統計，2019年我國養殖水產品總產量達6 450萬t，超過世界養殖水產品總量的70%，為優質蛋白質的供給以及國家的糧食安全做出了巨大貢獻。目前，高密度、集約化已成為我國水產養殖的主要模式[1]，然而，養殖密度的不斷提高極易打破池塘原有的生態平衡，過多的殘餌、糞便無法被池塘中的微生物分解利用，導致氨氮、亞硝酸鹽等有害物質積累，影響養殖動物健康[2]。此外，不經處理的養殖廢水排放到外環境中產生面源污染，危害養殖業的可持續發展。生物脫氮不僅安全環保，而且具有可續持性，近年來新發現的好氧反硝化細菌因其能夠在有氧的條件下進行反硝化作用，脫氮徹底，而且具有適應性強、生長速度快及容易控制等潛在優點[3-5]，逐漸成為脫氮益生菌中研究和應用的熱點。

在益生菌研究和應用中，菌種篩選是一個十分重要的環節。然而，由于在菌種篩選過程中候選菌株眾多而且篩選條件各異，水產養殖常用的益生菌菌種篩選的方法、標準非常繁雜，導致菌種篩選效率低下；其次，實驗室篩選得到的菌種在養殖試驗驗證過程中，其功能往往不能較好的重現，這主要是由于實驗室篩選益生菌的條件或許同其應用的環境有所區別，從而使益生菌應用后在靶位點難以生長、定植及發揮功能[6]；此外，某些對哺乳動物有益的微生物應用于水生動物可能會產生不利影響。因此，在益生菌菌種篩選過程中制定適合水產養殖的方法、標準就顯得非常重要。目前，已有很多關于水產養殖中好氧反硝化菌種篩選和應用的研究[3,7-10]，但尚未見到對該菌種篩選及評價方法進行系統綜述的報道。因此，本文對水產養殖中好氧反硝化細菌的篩選、評價方法進行歸納、總結，以期對好氧反硝化細菌篩選和評價標準提供參考，并對未來的研究方向進行了展望。

1 菌種篩選流程

隨著研究的深入，已有大量好氧反硝化細菌的研究報道，主要菌種包括：假單胞菌(Pseudomonassp.)[8]、芽孢桿菌(Bacillussp.)[11]、副球菌(Paracoccussp.)[3]、海桿菌(Marinobactersp.)[12]、鹽單胞菌(Halomonassp.)[13]和紅球菌(Rhodococcussp.)[14]等，然而，尚缺乏對該菌種篩選和評價的系統報道。通過歸納、總結國內外相關文獻，好氧反硝化菌種篩選流程和標準如圖1所示。具體而言，好氧反硝化細菌的篩選包括了樣品采集、富集培養、安全性評估、菌種鑒定、耐受性評估、功能性評估及應用試驗評估等主要組成步驟。通過層層篩選，獲得的菌種需要符合安全性、適應性、功能性和便利性等特點[15]。

BTB：溴百里酚藍 bromothymol blue；Y：通過 pass；N：未通過 fail。

2 樣品處理

理想的益生菌，應該能夠在宿主的腸道或環境中定殖、建立和繁殖，然而，某些應用于水產動物的益生菌常出現相對無效的情況，這或許是由于非魚類來源的益生菌無法在其腸道中生存或保持最佳的活菌數[16-17]。基于此，好氧反硝化菌種分離常采集的樣本最好選取池塘的水樣、沉積物、微生物絮團及水產動物腸道等樣本，從這些樣本中篩得的菌種具有更好的適應性，即原位/宿主益生菌策略(autochthonous probiotics/host-associated probiotic)。以往研究也發現，在水、泥、沉積物及生物絮團樣品中更易篩得好氧反硝化細菌，如濱海芽孢桿菌(Bacilluslitoralis)[18]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[19]、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)[20]及Paracoccussaliphilus[21]等菌種，且具有較好的適應性。此外，采集的樣本還可以用高濃度的硝酸鹽、亞硝酸鹽及銨鹽作為唯一氮源進行富集培養[22]，培養過程中需要進行間歇曝氣以達到好氧反硝化微生物數量增加，同時確保目的菌種的好氧反硝化性能不退化或可得到進一步加強[23-24]，通過富集培養可大幅度提高后續菌種的篩選效率。

3 菌種初篩

好氧反硝化菌株初步篩選可應用溴百里酚藍(bromothymol blue，BTB)固體培養基[25]，接種的細菌由于反硝化作用使pH升高，從而產生藍色暈圈，選取藍色菌落即可實現菌種的初篩。應用該方法，Chen等[5]從循環水養殖系統的生物濾池中分離到好氧條件下能脫氮的菌株Z1和Z8，Song等[11]分離篩選得到高效脫氮的好氧反硝化菌株凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)XY-6，Shao等[26]也篩選得到脫氮性能較好的好氧反硝化菌種Pseudomonassp. B5。根據篩選流程，初篩獲得的菌種還需要進行安全性評估、菌種鑒定及耐受性評價。

3.1 安全性評估

眾所周知，水產養殖中應用的微生物菌種必須是安全的，對魚蝦不能有致病性。然而，Fu等[27]從92種動物用益生菌產品中分離出123個益生菌菌株，其中45個菌株對抗生素耐藥，33.7%的益生菌產品被肺炎克雷伯菌等危及生命的病原體污染，而且還發現了炭疽毒素陽性的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)菌株，這對水產動物及人類的健康構成巨大威脅。可見，篩選用于水產養殖的益生菌菌種，進行安全性評估為最重要一環。好氧反硝化候選菌種不能含有任何質粒編碼的耐藥基因或基因簇[28]，不產生溶血圈，不含有致病基因，不生成毒性代謝產物，且需要結合體內的急性、慢性毒性試驗進行驗證[29]。

3.2 菌種鑒定

好氧反硝化菌種鑒定方法同常規微生物菌種鑒定方法類似，包括常規形態學觀察、生理生化分析、16S rRNA測序和全基因測序等。經過菌種鑒定，可獲知菌株的種、屬等信息，這對進一步研究菌種的性能及實際應用提供了重要參考。具體而言，以飼料添加劑形式飼喂的菌種需符合各個國家規定的菌種目錄，如美國食品與藥物管理局(FDA)和美國飼料控制官員協會(AAFCO)公布的可直接飼喂微生物菌種名單(46種)、歐盟準許飼喂的菌種目錄(72種)、我國《飼料添加劑品種目錄》允許添加的微生物菌種目錄(35種)；而改良水體環境的菌種目前尚未有明確規定，但需要符合之前所提到的安全性要求。

3.3 耐受性評估

益生菌能夠發揮效果的關鍵因素之一為耐受所應用的環境，并且能夠在效應位點定植生長，維持較高的活菌水平，而后才能發揮功效(圖2)。不同于陸生動物，益生菌作用水產動物的效應位點除了動物腸道外，還有水環境。因此，篩選的候選好氧反硝化菌株需要耐受所應用的外環境，包括溫度、鹽度和pH等，飼喂的益生菌還需經過胃酸、膽鹽等的耐受性評價[30]。一般而言，能夠較好滿足這一要求的就是選用池塘或水產動物腸道的土著菌群，Boutin等[31]在研究美洲紅點鮭(Salvelinusfontinalis)時發現，同外源益生菌相比，本土的益生菌不會干擾魚皮膚黏液菌群，是調節魚類微生物群落更好的選擇；Ahmmed等[32]也發現，源于對蝦腸道的乳酸桿菌能夠更好地適應動物腸道，而且可抑制病原弧菌的生長繁殖；Muthukrishnan等[33]研究發現，本土菌株越南芽胞桿菌(Bacillusvietnamensis)VCM5、BacillusvietnamensisVCM8和支氣管戈登菌(Gordoniabronchialis)VCM12可顯著降低對蝦養殖廢水中亞硝酸鹽含量，顯示出較好的適應性。此外，某些需要在飼料制作過程中添加的反硝化菌制劑，還需考慮工廠化水產飼料生產的高溫、高壓耐受性，在這種情況下，應用芽孢孢子可能更為適宜。

4 菌種的復篩

好氧反硝化細菌的復篩包括：應用選擇性培養基(selective culture medium)計算菌種脫氮效率、判斷脫氮類型以及借助分子生物學和組學手段研究脫氮機制等步驟[34-37]。

4.1 脫氮效率研究

在好氧反硝化細菌脫氮效率的研究中選擇性培養基的配方同養殖水體的化學組成存在差異，如表1所示，選擇性培養基常用氮源為NH4Cl、NaNO3及NaNO2等，常用的碳源為琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖和甘油等。然而，在水產養殖水體中常為有機碳源缺乏，而且氮源變為營養豐富的有機氮源[18]。篩選培養基的富碳特性在實際的養殖環境中很少存在，池塘養殖環境多為低碳高氮，不同于工業污水可以額外提供大量廉價有機碳源，養殖中大量有機碳源的應用可能會造成水產動物缺氧風險及病原微生物滋生等問題出現。基于此，Ma等[38]直接配制0.05 g/L的NaNO2溶液，并在其中僅補充1 g/L粉碎的魚飼料及糞便以模擬池塘中積累的有機物質，以此反硝化細菌池塘模擬培養基(pond-simulating denitrification screening medium,PSDSM)進行菌種篩選，獲得了脫氮效率理想的好氧反硝化菌株BacillussubtilisM 7-1，同時，大田應用試驗證實，該菌株對養殖池塘中的無機氮也具有較高的降解率[39]。Cui等[40]在有機氮(蛋白胨、尿素)存在的情況下，研究反硝化細菌海洋著色菌(Marichromatiumgracile)YL28脫氮性能，發現存在有機氮源且添加海藻寡糖后，YL28對無機氮的去除能力顯著增強。可見，在反硝化細菌的篩選過程中，培養基中氮源、碳源的選擇及適宜的碳氮比關系著篩得菌株的脫氮性能，研究發現，大多數好氧反硝化細菌的最佳碳氮比在8～10[41-42]，然而，養殖池塘中一般碳氮比在6～8，因此在篩選培養基配制需考慮這一差異，或在應用中補充緩釋碳源以確保菌種的脫氮功能[43]。

圖2 益生菌在魚類腸道和水體中定植后的作用

溫度是反硝化過程的重要參數之一，已有研究顯示，好氧反硝化細菌脫氮的適宜溫度范圍為25～37 ℃[37,44-45]。因此，在菌種篩選的過程中培養溫度可設定為28～30 ℃(表1)，但考慮冷水魚養殖及春秋季節水體脫氮的需要，嗜冷(10～15 ℃)好氧反硝化細菌的篩選也尤為重要。He等[46]研究發現，好氧反硝化菌臺灣假單胞菌(Pseudomonastaiwanensis)在15 ℃下對硝酸鹽的去除率為100%，具備低溫脫氮能力。然而，隨著溫度的降低，菌種的反硝化效率也會隨之降低；Saleh-Lakha等[47]研究表明，在10 ℃條件下，好氧反硝化菌孟氏假單胞菌(Pseudomonasmandelii)同硝化和反硝化作用相關的基因表達發生滯后和延遲。由此可見，培養溫度的設定需要綜合考慮菌種最適條件及所應用的環境這2方面因素。

鹽度也影響著好氧反硝化細菌的脫氮效率。研究表明，海水養殖的鹽濃度(20‰～35‰)已可抑制常見細菌的酶系統并可發生溶菌作用[48]。在反硝化方面，Deng等[49]研究表明，在高鹽濃度下，反硝化過程的功能基因nirK和nosZ的表達豐度大大降低，抑制了細菌的反硝化活性。而同時，耐鹽好氧反硝化細菌也已有研究報道，Al-Rubaye等[50]已從鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)、海源菌屬(Idiomarina)、大洋芽胞桿菌屬(Oceanobacillus)和枝芽孢菌屬(Virgibacillus)等種屬中分篩到反硝化嗜鹽菌；Li等[51]從青島膠州灣海水沉積物中分離出1株反硝化海洋嗜鹽菌弧菌；而Mével等[52]分離篩選的Bacillussp.能夠在16 g/L的NaCl中進行好氧反硝化作用，這些研究對篩選海水養殖中應用的耐鹽好氧反硝化細菌提供依據。

通過調整搖床轉速以提供好氧反硝化細菌生長所需的溶氧，一般而言搖床轉速設置為150～200 r/min(表1)。然而，不同菌種適宜的溶氧濃度不同，即便相同種類的好氧反硝化細菌在不同溶氧情況下脫氮能力也存在差異[4]，比如某些好氧反硝化細菌對高溶氧具有較高的耐受。Robertson等[53]研究發現，在溶解氧濃度為80%～90%的培養基中，泛硫代酵母也具有反硝化酶活性；無色桿菌屬(Achromobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)能夠在溶氧濃度為3～10 mg/L條件下進行好氧反硝化脫氮[54]，而芽孢桿菌則可在溶氧濃度為3.93～7.65 mg/L條件下發生反硝化作用[55]。但考慮到微生物同養殖動物可能存在的爭氧問題，篩選兼具有好氧和厭氧反硝化能力的微生物或更具有實用性[56]。

4.2 脫氮類型研究

在脫氮類型方面，能夠同時進行異養硝化-好氧反硝化的菌株具備更高的脫氮效率，如ParacoccussaliphilusSPUM、BacilluslitoralisN31、Marinobactersp.、BacilluscereusPB45及鹽田鹽單胞菌(Halomonascampisalis)等(表1)。然而，不同菌種脫氮效率、脫氮類型有較大差異，這或許同反硝化細菌所含酶系的種類和數量不同有關。廖紹安等[57]應用間歇曝氣法分篩獲得嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，測序發現該菌株未發現亞硝酸還原酶基因nirK序列，只鑒定了nirS基因序列；從廢水處理的活性污泥中分離篩選的鹽單胞菌屬細菌(Halomonassp.)則鑒定出多種脫氮相關的酶類，可同步發生硝化和反硝化反應，脫氮效率較為理想[58]；Wan等[59]對脫氮類型為好氧反硝化的假單胞菌yy7進行分析，確定該菌株含有nirK、norB和nosZ等多個同反硝化相關的基因，這些功能基因同菌種的反硝化性能密切相關。

4.3 脫氮機制研究

篩選的好氧反硝化菌株可通過PCR及全基因組測序獲取脫氮相關的酶系基因，從而進一步分析其脫氮機制。如表2所示，反硝化反應在硝酸還原酶(nitrate reductase)、亞硝酸還原酶(nitrite reductase)、一氧化氮還原酶(nitric oxide reductase)及一氧化二氮還原酶(nitrous oxide reductase)的催化作用下進行。

表1 好氧反硝化細菌篩選培養基及篩選條件

續表1樣品(來源)Samples (source)選擇性培養基(每升含)Selective medium (per liter contained)篩選條件Screening conditions菌株Strains脫氮類型Denitrification mode參考文獻Reference水樣(草魚池) Water (grass carp pond)檸檬酸鈉5.66 g,Na2HPO4 7.9 g,NaNO3 0.841 5 g (DM)/NaNO2 0.683 g (NDM)/NH4Cl 0.529 6 g(NM),KH2PO4 1.5 g,MgSO4·7H2O 0.01 g,TE溶液2 mL30 ℃、200 r/min施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) F11反硝化[20]30 ℃、200 r/min枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) SC02反硝化[19]30 ℃、180 r/min地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BSK-4好氧反硝化[60]水樣(海洋養殖系統中的生物曝氣過濾系統) Water (biological aerated filter in a marine aquaculture system)DM: KNO3 1 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,CaCl2 0.01 g,EDTA (0.5 mol/L) 0.5 mL,KH2PO4 0.5 g,Na2HPO4 0.5 g,FeSO4 0.01 g,NaCl 20 g,TE溶液5 mLNM: (NH4)2SO4 0.66 g,琥珀酸鈉1.35 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,EDTA (0.5 mol/L) 0.5 mL,KH2PO4 0.5 g,Na2HPO4 0.5 g,TE溶液5 mLNDM: NaNO2 0.276 g,琥珀酸鈉3.16 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,EDTA (0.5 mol/L) 0.5 mL,KH2PO4 0.5 g,Na2HPO4 0.5 g,FeSO4 0.01 g,NaCl 20 g,TE溶液5 mL30 ℃、150 r/min海桿菌(Marinobactersp.)異養硝化-好氧反硝化[34]海水(西太平洋) Sea water (Western Pacific ocean)琥珀酸鈉4.72 g,KH2PO4 1 g,MgSO4·7H2O 1 g,CaCl2·2H2O 0.2 g,FeSO4·7H2O 0.05 g,NaNO2 0.002 5 g30 ℃、180 r/min蒙氏假單胞菌(Pseudomonas monteilii) CY06好氧反硝化[8]水及泥樣(蝦池) Water and soil (shrimp pond)琥珀酸鈉4.72 g,NaNO2 0.05 g,KH2PO4 1.5 g,Na2HPO4 0.42 g,MgSO4·7H2O 1 g30 ℃、150 r/min蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus) PB88好氧反硝化[60](NH4)2SO4 0.5 g,KH2PO4 0.7 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl2·2H2O 0.5 g,TE溶液1 mL30 ℃、200 r/min蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus) PB45異養硝化-好氧反硝化[61]琥珀酸鈉4.72 g,NaNO2 0.05 g,KH2PO4 1.5 g,Na2HPO4 0.42 g,MgSO4·7H2O 1 g30 ℃、200 r/min芽孢桿菌(Bacillus sp.)YX-6好氧反硝化[11]檸檬酸鈉8.5 g,KH2PO4 1 g,MgSO4·7H2O 1 g,CaCl2·6H2O 0.2 g, FeCl3·6H2O 0.05 g32 ℃、120 r/min海桿菌(Marinobactersp.)好氧反硝化[62]

表2 反硝化反應中的催化酶及基因

5 應用研究

6 小 結

綜上所述，好氧反硝化細菌在養殖池塘的生物脫氮方面具有突出的優勢與應用潛力，但不同菌種或相同菌種在不同條件下脫氮效率差別較大，可從樣品采集、培養基配制、培養方式及評價方法等方面優選適合好氧反硝化細菌的方法、標準，進而實現好氧反硝化細菌菌種的快速、高效篩選。未來還需重點研究的內容包括以下幾個方面：1)結合養殖水環境特點配制篩選培養基(碳源、氮源和碳氮比等)、設置篩選條件(溶氧、pH、溫度和鹽度等)，篩選適合養殖水環境的好氧反硝化細菌；2)借助宏基因組測序技術，對養殖水體中反硝化脫氮菌群進行全面分析，從而挖掘更高效、耐受性更強的生物脫氮菌株；3)應用多組學技術(如基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學)從不同層次闡明好氧反硝化機理，比如蛋白質組學可用于研究反硝化酶活性中心的鐵、銅等元素功能，通過代謝組學還可分析不同碳源在反硝化過程中關鍵代謝產物的變化；4)利用群體感應(quorum sensing，QS)的理論及技術，開展反硝化細菌之間或同其他益生菌的共培養、共發酵(co-culture)研究。不同微生物共存的菌系能夠達到某種協同效應，可進一步提高脫氮效率，而且復合菌系還具有更強的適應性，建議對其深入研究并應用于水產養殖，從而實現更持久、更高效的養殖水體生物脫氮。