糠氨酸標準溶液的儲存穩定性以及鹽酸濃度對牛奶中糠氨酸檢測結果的影響

陳美霞 陳沖沖 文 芳 張養東 鄭 楠 王加啟*

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業農村部奶及奶制品質量安全控制重點實驗室，北京100193；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業農村部奶產品質量安全風險評估實驗室(北京)，北京100193；3.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業農村部奶及奶制品質量監督檢驗測試中心(北京)，北京 100193；4.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，動物營養學國家重點實驗室，北京100193)

糠氨酸，即ε-N-2-呋喃甲基-L-賴氨酸，又名呋喃素，是美拉德反應的系列產物之一?？钒彼岬暮靠梢灾苯臃从撑Ｄ淘诩庸み^程中所經歷的熱處理強度，一般而言，牛奶所經歷的熱處理強度越強(加熱時間越長或加熱溫度越高)，糠氨酸含量越高；此外，儲存過程中糠氨酸含量也規律性增加[1]。因此，國內外常用糠氨酸含量的變化來評價牛奶加工方式或儲存方式對奶制品質量的影響[2-3]。我國已經將糠氨酸和乳果糖含量聯合用于巴氏殺菌乳和超高溫(UHT)滅菌乳中復原乳的鑒定[4]。一系列研究發現，糠氨酸可以抑制HepG2和Hek293細胞體外生長活力[5-6]，小鼠體內試驗證明糠氨酸具有肝臟毒性和腎臟毒性[7]，并可以影響睪丸指數、血清激素表達水平和精子質量，并對睪丸組織造成病理損害[8]。因此，準確地、定量地檢測乳制品中糠氨酸含量對于科學研究和乳制品質量監管具有重要意義。

目前，糠氨酸含量的檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[9-10]、超高效液相色譜(UPLC)法[11]、超高效液相色譜-質譜串聯(UPLC-MS/MS)法[12]、毛細管電泳-質譜串聯(CE-MS/MS)法[13]、穩定同位素稀釋-質譜聯用法[14]和表面熒光光譜法[15]等。表面熒光光譜法因其靈敏度較低，一般用于半定量分析，因此應用范圍有限。CE-MS/MS法雖然分離度較高，但前處理復雜，不適用于大批量樣品檢測。UPLC-MS/MS法因儀器昂貴、維護成本高，需要專門人員進行操作，也限制了其在實際中的應用。目前，對于液態奶中糠氨酸含量的檢測，國際上主要參照ISO18329中的HPLC法[10]，國內主要參照農業行業標準NY/T 939—2016中的HPLC法或UPLC法[4]。盡管國內外對糠氨酸含量的檢測做了大量的研究，但對該物質標準品穩定性的研究未見報道。了解標準品物質的穩定性，有助于使定量分析過程準確可靠，對樣品檢測具有十分重要的意義。陳永艷等[16]對抗生素類標準品穩定性進行了分析，結果顯示不同溶劑和溫度條件對抗生素穩定性的影響程度不同。周鑫等[17]研究了以甲醇為溶劑介質的氯氰菊酯和氟胺氰菊酯標準溶液的穩定性，結果發現長時間跨度和復雜的溫度條件會增加氯氰菊酯和氟胺氰菊酯標準溶液不穩定的風險。因此，研究糠氨酸標準溶液穩定性對于乳及乳制品中糠氨酸定量檢測的準確性以及乳制品質量控制具有重要意義。此外，在參照NY/T 939—2016中規定的HPLC法或UPLC法[4]對牛奶中糠氨酸含量進行檢測時發現，使用不同批次或不同品牌鹽酸水解相同牛奶時結果有時存在差異。Guerra-Hernandez等[18]在檢測嬰兒米粉中糠氨酸含量時發現，在一定范圍內增加水解米粉時所用鹽酸濃度會提高糠氨酸含量的檢測值。而在參照NY/T 939—2016中規定的HPLC法或UPLC法[4]對牛奶中糠氨酸含量進行檢測時，我們發現使用不同批次或不同品牌鹽酸水解相同牛奶時結果有時存在差異，因此，推測不同濃度鹽酸水解牛奶影響牛奶中糠氨酸的檢測結果。因此，本試驗研究了不同方式配制的糠氨酸標準溶液在不同儲存環境中的穩定性，以期為糠氨酸標準溶液保存和檢測結果的可靠性提供一定的依據；同時，本試驗還研究了使用不同濃度鹽酸水解牛奶對糠氨酸檢測結果的影響，以期為更準確地定量檢測乳及乳制品中糠氨酸含量提供科學數據支持。

1 材料與方法

1.1 糠氨酸標準溶液的配制

糠氨酸標準貯備溶液(500 mg/L)配制：將糠氨酸標準品按標準品證書提供的肽純度系數換算后，用3 mol/L鹽酸配制成標準貯備溶液，-20 ℃下可貯存24個月。

糠氨酸標準中間溶液：移取2 mL糠氨酸標準貯備溶液于10 mL容量瓶中，用3 mol/L鹽酸定容，此標準中間溶液濃度為100 mg/L。

糠氨酸標準工作溶液：移取100 μL糠氨酸標準貯備溶液于25 mL容量瓶中，用3 mol/L鹽酸液定容，此標準工作溶液濃度為2.0 mg/L。依上述方法分別配制0.05、0.10、0.50、1.00、2.00和5.00 mg/L的糠氨酸標準工作溶液。

1.2 糠氨酸標準溶液儲存穩定性研究

為了研究糠氨酸標準溶液在不同溫度和不同鹽酸濃度條件下的穩定性，本試驗分別用3個濃度的鹽酸(3.0、1.0和0.1 mol/L)配制不同濃度的糠氨酸標準溶液(1和5 mg/L)，并保存于不同溫度[-20、4 ℃和室溫(25 ℃)]條件下，分別于第1、3、5、8、10、12、14、15、17和21天對保存的糠氨酸標準溶液進行糠氨酸含量檢測。每個處理設3個平行。

1.3 不同濃度鹽酸水解牛奶對糠氨酸檢測結果的影響

試驗設置11種不同濃度的鹽酸水解牛奶，每個濃度設4個平行，分析鹽酸濃度對牛奶中糠氨酸檢測結果的影響。鹽酸濃度用氫氧化鈉標準滴定溶液進行標定，試樣溶液以溴甲酚綠為指示液，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至溶液由黃色變為藍色為終點[19]。選擇連續的3 d重復同樣試驗，研究結果的可重復性。取1 mL牛奶和11 mL不同濃度的鹽酸(12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2和1 mol/L)于可以密閉的水解管中，密封水解管后放于110 ℃的恒溫干燥箱中，加熱水解24 h(加熱約1 h后輕輕搖動水解管)；加熱結束后，取出水解管，冷卻后用濾紙過濾，濾液備用。

1.4 水解液中蛋白質含量的測定

移取2 mL水解液，參考GB 5009.5—2016[20]中規定的方法用凱氏定氮儀(Foss，丹麥)對水解液中蛋白質含量進行檢測。

1.5 糠氨酸含量的測定

穩定性試驗中的糠氨酸標準溶液可以直接上機檢測。測定水解液中的糠氨酸含量時，檢測前需先取1 mL水解液與5 mL 6 g/L乙酸銨溶液混合，過0.22 μm濾膜(Waters公司)后再上機測定。

水解液中糠氨酸含量參考NY/T 939—2016[4]中規定的方法利用Waters ACQUITY UPLC H-CLASS UPLC儀(配有紫外檢測器及Empower數據處理系統)進行定量檢測，方法如下：使用0.1%三氟乙酸水溶液(含6 g/L乙酸銨，流動相A)、甲醇(流動相B)和水(流動相C)為流動相，色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，粒徑1.8 μm)，采用流動相A等度洗脫模式，洗脫速度為0.4 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為0.5 μL。定量檢測前需先用流動相B和C沖洗色譜柱，再用流動相A和C流動相平衡色譜柱，最后用3 mol/L鹽酸檢測溶劑純度、儀器和色譜柱的狀態。上述所用試劑均為色譜純，乙酸銨購于CNW公司，三氟乙酸購于百靈威科技有限公司，甲醇和乙腈購于Thermo Fisher公司。

1.6 數據統計分析

試驗數據用平均值±標準誤表示，采用SAS 9.1.3統計軟件中的單因子方差分析(one-way ANOVA)過程進行單因子方差分析，并采用LSD法進行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 糠氨酸標準溶液的儲存穩定性

2.1.1 鹽酸濃度對糠氨酸標準溶液儲存穩定性的影響

本試驗采用3種不用濃度的鹽酸配制糠氨酸標準溶液，由圖1和圖2可以看出，在相同儲存條件下，用低濃度鹽酸(0.1 mol/L)配制的糠氨酸溶液穩定性較差，隨著儲存時間的延長，糠氨酸發生明顯的降解。根據糠氨酸的峰面積計算降解率，0.1 mol/L鹽酸配制的1 mg/L糠氨酸標準溶液在25 ℃儲存8 d時降解率達到23.55%，儲存21 d時降解率達到84.27%，4 ℃儲存12 d時降解率達到21.75%，儲存21 d時降解率達到42.01%，-20 ℃儲存8 d時降解率達22.75%，儲存21 d時降解率達59.12%，不能夠滿足試驗要求；0.1 mol/L鹽酸配制的5 mg/L糠氨酸標準溶液25 ℃儲存14 d時降解率達到10.15%，儲存21 d時降解率達到14.18%，4 ℃儲存17 d時降解率達到10.89%，儲存21 d時降解率達到12.19%，-20 ℃儲存8 d時降解率達13.10%，儲存21 d時降解率達49.39%，不能夠滿足試驗要求；中濃度鹽酸(1.0 mol/L)配制的2種濃度的糠氨酸標準溶液(1和5 mg/L)穩定性總體比較好，但5 mg/L糠氨酸標準溶液在-20 ℃儲存條件下峰面積波動比較大(18.10%～32.24%)。高濃度鹽酸(3.0 mol/L)配制的糠氨酸標準溶液穩定性最好，在-20、4和25 ℃儲存21 d后仍保持穩定，滿足試驗要求?？紤]到糠氨酸標準溶液在3.0 mol/L鹽酸中穩定性最好，因此，建議用3.0 mol/L鹽酸溶解糠氨酸并進行儲存。

2.1.2 儲存溫度對糠氨酸標準溶液儲存穩定性的影響

由圖1和圖2可以看出，當糠氨酸溶解于高濃度鹽酸(3 mol/L)時，糠氨酸標準溶液穩定性比較好，但溫度并不影響糠氨酸標準溶液的穩定性。但是考慮到大批量檢測過程中，UPLC樣品室的溫度一般設定為4 ℃，同時為了盡可能減少凍融對糠氨酸的影響，因此，配制好的糠氨酸標準溶液不建議保存于室溫和-20 ℃，建議于4 ℃保存，于21 d內使用。

2.2 鹽酸濃度對牛奶中糠氨酸檢測結果的影響

由圖3和表1可以看出，一定范圍內，隨著水解牛奶所用鹽酸濃度的升高，糠氨酸的游離程度升高，檢測到的糠氨酸含量增加。統計分析后發現，當使用的鹽酸濃度達到10 mol/L時，檢測到的糠氨酸峰面積趨于平穩，不再發生顯著變化(P>0.05)。

為了進一步探究上述結果的可重復性，選擇連續的3 d重復同樣試驗。由圖4和表2可以看出，當水解牛奶所用的鹽酸濃度達到10 mol/L時，牛奶中的糠氨酸可以完全水解游離出來，檢測到的糠氨酸含量不再發生顯著變化(P>0.05)。

3 討 論

糠氨酸是牛奶在加熱過程中發生“美拉德反應”后的特征性產物之一，其含量可以反映牛奶的質量和營養價值[21]。近些年的一系列研究發現，糠氨酸具有細胞毒性，并對小鼠肝臟、腎臟和睪丸的正常功能產生負面影響[5,7,22]。因此，準確測定牛奶中糠氨酸含量對于牛奶加工過程質量控制和科學研究具有重要意義。

目前基于糠氨酸檢測的研究比較多[9,12,21,23-27]，但是尚未有研究分析糠氨酸標準溶液的穩定性。本研究考察了糠氨酸標準溶液在不同儲存條件下的穩定性。試驗發現，糠氨酸受所處溶液環境影響比較大，在相同的儲存條件下，糠氨酸溶解在低濃度鹽酸(0.1 mol/L)中穩定性較差，在中濃度鹽酸(1.0 mol/L)中穩定性較好，在高濃度鹽酸(3.0 mol/L)溶液中穩定性最好，這可能是因為糠氨酸本身為酸性分子，較高的酸性環境有利于其結構的穩定。與單純的糠氨酸溶液不同，牛奶中糠氨酸則會在儲存過程中會發生規律性變化，一般而言，儲存時間越長，儲存時溫度越高，糠氨酸含量會越高，室溫條件下，每10 d每100 g牛奶蛋白質中糠氨酸含量約增長7 mg，這主要是因為室溫條件下牛奶中仍然可以發生緩慢的“美拉德反應”產生新的糠氨酸[1]。而在相同的鹽酸濃度(3.0 mol/L)條件下，糠氨酸對溫度不敏感，在-20、4 ℃和室溫(25 ℃)條件下儲存21 d沒有明顯降解，滿足試驗需求。但是考慮到在實際樣品檢測過程中，UPLC樣品室溫度一般設定為4 ℃，因此建議保存于4 ℃。

此外，本試驗還研究了使用不同濃度鹽酸水解牛奶對糠氨酸檢測結果的影響，結果發現隨著水解牛奶所用鹽酸濃度的升高，檢測到的糠氨酸含量增加，一方面可能是因為低濃度的鹽酸不能完全水解牛奶使糠氨酸完全游離出來，隨著水解牛奶所用鹽酸濃度的升高，糠氨酸游離程度升高；另一方面也可能是因為低濃度的鹽酸并不能完全阻止新的“美拉德反應”產生新的糠氨酸。前人研究發現，當牛奶中鹽酸濃度達到6 mol/L時，可以完全阻斷“美拉德反應”的進行[28-29]。本試驗發現，當水解液中鹽酸濃度達到9.17 mol/L時，再提高鹽酸濃度檢測到的糠氨酸含量不再發生顯著變化，可能是因為這時牛奶中已經不再發生新的“美拉德反應”，同時糠氨酸已經在鹽酸的作用下完全游離出來。因此，建議水解1 mL牛奶所用的鹽酸濃度至少為10 mol/L，考慮到牛奶稀釋倍數，即牛奶水解液中鹽酸濃度應至少達到9.17 mol/L。

圖2 不同濃度鹽酸配制的5 mg/L糠氨酸標準溶液在不同溫度下的儲存穩定性

圖3 不同濃度鹽酸水解牛奶對糠氨酸檢測結果的影響

本試驗通過對糠氨酸標準溶液儲存穩定性進行研究，確定了糠氨酸標準溶液的儲存條件，可為實驗室中糠氨酸標準溶液的配制和保存提供參考依據；同時，本試驗通過對牛奶水解所用鹽酸濃度進行研究，確定了牛奶水解液中的鹽酸濃度，可為更加準確地定量檢測牛奶中糠氨酸含量提供數據支持。

4 結 論

① 糠氨酸標準溶液的儲存穩定性受到鹽酸濃度的影響，3.0 mol/L鹽酸配制的糠氨酸標準溶液穩定性最佳。

② 糠氨酸標準溶液的儲存穩定性受儲存溫度的影響較小，建議將配制好的糠氨酸標準溶液保存于4 ℃，于21 d內使用。

③ 鹽酸濃度影響牛奶的水解效果，水解牛奶所用的鹽酸濃度應使水解液中鹽酸濃度至少達到9.17 mol/L。

表1 不同濃度鹽酸水解牛奶對糠氨酸檢測結果的影響

A、B和C表示在不同的3 d進行的3次獨立試驗。每次試驗n=4。

續表2水解牛奶所用鹽酸濃度HCl concentration used for milk hydrolysis procedure/(mol/L)水解液中鹽酸濃度HCl concentration in hydrolysate/(mol/L)糠氨酸含量Furosine content/(mg/100 g prot) (n=4)12343.6733.55±0.11g40.62±0.40g31.92±0.35g54.5842.16±0.53f48.95±3.60f42.25±0.57f65.5050.52±0.54e49.55±0.94e49.07±0.16e76.4261.78±0.63d62.05±1.05d62.58±1.08d87.3376.68±0.26c76.05±0.46c75.43±0.52c98.2589.56±0.65b89.18±1.88b88.06±0.21b109.17101.98±0.34a101.50±2.64a102.23±0.32a1110.08102.13±0.57a102.62±1.33a103.88±1.97a1211.00109.96±2.70a103.49±1.80a104.70±0.40a