解淀粉芽孢桿菌實時熒光定量PCR測定方法的建立及其在豆粕發酵中的應用

楊湘黔 崔京春* 曾詩嫻 成 麗 張珂彬 胡曉紅 鮑雅靜

(1.大連民族大學生命科學學院，大連116600;2.大連民族大學環境與資源學院，大連116600)

豆粕是大豆加工的副產物，因富含多種營養物質，是目前使用最廣泛的植物性蛋白質飼料原料，但因豆粕中含有抗營養因子影響了動物對飼糧的消化吸收和利用[1-3]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一種廣泛被用于開發微生物飼料添加劑的革蘭氏陽性芽孢桿菌[4-5]，它能夠產生蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶等多種酶類，并能產生對動物病原菌中的大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、沙門氏菌等具有較強的抑制能力的物質[6-8]。研究表明，利用解淀粉芽孢桿菌發酵豆粕不僅可以降低豆粕中的抗營養因子含量，且可提高動物對豆粕飼料的消化吸收率[9-12]。解淀粉芽孢桿菌在發酵豆粕飼料中的數量是影響豆粕發酵效果的關鍵因素之一，而由于用于發酵的豆粕為未滅菌原料，在進行接種菌的數量檢測時會因自身帶有的微生物的干擾，造成常用的微生物數量檢測平板活菌計數法計數不準或者難以計數，并且由于該方法檢測周期通常長達2～3 d，無法實現對豆粕發酵生產過程的即時監控[13-16]。

近幾年，基于DNA水平上的微生物數量檢測分子生物學方法越來越多，包括常規PCR技術、變性梯度凝膠電泳技術、實時熒光定量PCR技術等[17-22]。其中，實時熒光定量PCR技術具有特異性強、靈敏度高、操作時間短的特點，且由于在檢測過程中均為閉管操作不會造成因污染而出現的假陽性結果[23-24]。DNA解旋酶A亞基(gyrA)基因是細菌DNA促旋酶上的1個亞基，該基因是枯草群中鑒定、分類的重要工具，因此，采用該基因可準確地區分枯草菌群中的近緣種[25]。

本研究擬建立基于解淀粉芽孢桿菌gyrA基因保守區設計引物、探針的實時熒光定量PCR方法，預期該方法可以達到種間特異，檢出敏感度可滿足監控解淀粉芽孢桿菌在不同豆粕發酵時期中的數量的要求，可以解決解淀粉芽孢桿菌發酵豆粕過程品質監控的瓶頸難題，并為解決以未滅菌生產原料發酵生產過程監控提供了有益的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌種

本研究所選菌種為芽孢桿菌4株(解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌)，非芽孢桿菌5株，其中包括乳酸桿菌2株(副干酪乳桿菌、植物乳桿菌)，金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌各1株。

1.1.2 試劑

dNTP、rTaq酶、10×Buffer、瓊脂糖、6×Loading Buffer、2000 bp Marker、pMD18-T載體、TaKaRa Premix EX TaqTM購于寶生物工程(大連)有限公司；4S Green染料、IPTG即用型溶液、X-Gal即用型溶液、氨芐青霉素鈉、DH5α感受態細胞、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；TE緩沖液購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養

乳酸菌接種至MRS肉湯，其他菌株接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基，37 ℃過夜培養。

1.2.2 菌種DNA的提取

純菌液DNA的提?。阂愿倪M的水煮法提取純菌液DNA[26]，具體為：取過夜培養的菌液1 mL于1.5 mL離心管中，離心，棄上清并加入500 μL TE緩沖液，重懸菌體，99～100 ℃水浴15 min后離心，取上清作為DNA模板，-20 ℃保存，備用。

豆粕及發酵豆粕樣品中DNA的提取：稱取豆粕樣品300 mg，采用試劑盒提取其DNA，具體操作步驟詳見生工生物(上海)股份有限公司的Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒說明書。

1.2.3 特異性引物及探針的設計

在NCBI中的GenBank數據庫中下載35株芽孢桿菌屬的gyrA基因及16S rRNA基因全序列，利用DNAMAN軟件對下載的序列進行比對，找出解淀粉芽孢桿菌的保守區，然后使用IDT引物設計軟件進行引物、探針的設計，并對設計出的引物的退火溫度、二聚體、發夾結構及探針的退火溫度進行檢測，從中篩選出1個正向引物、1個反向引物、1個探針(表1)。采用NCBI上的Primer-Blast Tool的引物比對軟件從理論上確認引物、探針特異性，并由寶生物大連有限公司進行合成。該探針5’端由FAM基團(報告基團)修飾，3’端由TAMRA基團(淬滅基團)修飾。

1.2.4 常規PCR驗證引物特異性及篩選

以1.2.2純菌液中提取的10株菌的DNA為模板，以表1設計的引物進行常規PCR反應。以50 μL體系進行PCR擴增，其中包括10×Buffer(Mg2+free)5 μL，dNTP Mixture 4 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，rTaq酶0.5 μL，無菌水補足至50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，35個循環；72 ℃延伸1 min，終延伸72 ℃ 5 min。PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.5 實時熒光定量PCR方法的建立及特異性檢測

實時熒光定量PCR反應體系：總體積為20 μL，其中包括premix EX TaqTM12.5 μL，上、下游引物(0.2 μmol/L)各0.5 μL，探針(0.2 μmol/L)0.8 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水補足至20 μL。

實時熒光定量PCR反應條件：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 34 s。特異性檢測：以1.2.2純菌液中所提取的10株菌的DNA作為模版，采用所建立的實時熒光定量PCR方法進行特異性驗證。

表1 引物、探針序列

1.2.6 標準曲線的建立及靈敏性、重復性驗證

pMD18T-gyrA基因重組質粒的構建：以解淀粉芽孢桿菌KCA基因組為模版及引物gyrA1-F/gyrA1-R進行擴增獲得目的片段(115 bp)，將其與pMD18-T載體連接，連接后的產物進行PCR和測序驗證。驗證正確后轉化至大腸桿菌DH5α細胞中，然后采用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取重組質粒，通過核酸微量測定儀測定其濃度并通過公式換算成拷貝數。公式如下：

式中：X為重組質粒的所測濃度；N為重組質粒的堿基數。

標準曲線的建立：以洗脫緩沖液TE將標準品pMD18T-gyrA進行10倍稀釋后作為模板進行實時熒光定量PCR反應。以拷貝數的對數為橫坐標，Ct值為縱坐標建立標準曲線。擴增效率(E)計算公式為：

E=10-1/slope-1×100。

每個稀釋度重復3次，以無菌水為陰性對照。

靈敏性驗證：重組質粒標準品靈敏度檢測是將標準品pMD18T-gyrA進行10倍梯度稀釋并稀釋成6個梯度，以作為實時熒光定量PCR的模版，不同稀釋度的標準品重復3次檢測；菌液靈敏度檢測是將KCA菌原菌液進行10倍梯度稀釋，分別提取各個稀釋度菌液的基因組DNA，最后進行實時熒光定量PCR反應。

重復性驗證：用5個稀釋度的pMD18T-gyrA標準品的Ct值變異系數(CV)評價該方法的重復性。組內重復性驗證分別以5個稀釋度的標準品作為模板進行實時熒光定量PCR反應，每個稀釋度重復3次，并以KCA菌的DNA和無菌水作為陽性對照和陰性對照。組間重復性驗證以上述5個稀釋度的標準品作為模板分3次進行實時熒光定量PCR反應，以KCA菌的DNA和無菌水作為陽性和陰性對照。

1.2.7 抗干擾驗證

核酸水平抗干擾檢測：分別提取108、103CFU/mL菌液量的解淀粉芽孢桿菌KCA基因組DNA，分別加入108CFU/mL菌液量的副干酪乳桿菌rg-1(Lactobacillusparacaseirg-1)所提取的DNA，以純的解淀粉芽孢桿菌KCA的基因組DNA為對照進行實時熒光定量PCR檢測，重復3次。

豆粕樣品對接種菌吸附干擾的檢測：取6 g滅菌的豆粕樣品分別添加4 mL解淀粉芽孢桿菌KCA的不同稀釋度菌液，靜置10 min后加入20 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，顛倒2～3次后斜面振蕩15 min，靜置5 min后吸取上清，3 000×g離心6 min，棄上清，加入2 mL TE Buffer后提取基因組DNA；同時提取2 mL不同稀釋度純菌液的基因組DNA作為對照，并進行實時熒光定量PCR檢測。每個稀釋度檢測3次。

1.2.8 發酵豆粕中解淀粉芽孢桿菌數量的檢測

解淀粉芽孢桿菌KCA培養至108～109CFU/mL，以4%的接種量接種至水分含量為40%～45%的豆粕中，室溫發酵0、1、2、3、5 d；取樣根據1.2.2所提供的豆粕中DNA提取方法提取細菌DNA，利用所建立的實時熒光定量PCR方法進行檢測。

1.3 數據統計分析

試驗數據采用GraphPad Prism 7.00軟件進行統計分析及作圖。結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 特異性驗證

2.1.1 常規PCR法驗證、特異性引物篩選

以gyrA及16S rRNA基因為靶標設計出的3對引物進行常規PCR擴增，由表2可知，只有引物對gyrA1-F/gyrA1-R擴增解淀粉芽孢桿菌KCA，采用gyrA2-F/gyrA2-R可同時擴增解淀粉芽孢桿菌KCA及地衣芽孢桿菌KCB；采用引物對16S rRNA-F/16S rRNA-R可將芽孢桿菌屬內的菌株擴增出條帶(164 bp)。這表明引物對gyrA1-F/gyrA1-R能特異性擴增解淀粉芽孢桿菌，因此選用gyrA1-F/gyrA1-R作為本研究建立實時熒光定量PCR方法的特異性引物對。

2.1.2 實時熒光定量PCR方法特異性的驗證

利用引物對gyrA1-F/gyrA1-R及探針gyrA1進行實時熒光定量PCR反應，KCA菌在22～24個循環處出現擴增曲線，而其他4株芽孢桿菌、5株非芽孢桿菌及陰性對照則在35個循環后出現擴增曲線(圖1)。這表明本研究所建立的方法對于KCA菌有較強的特異性。

表2 不同引物特異性檢測

～分別為解淀粉芽孢桿菌KCA、4株芽孢桿菌、5株非芽孢桿菌屬及陰性對照。

2.2 pMD18T-gyrA標準品的制備及標準曲線的建立

以KCA菌基因組DNA為模版，以引物對gyrA1-F/gyrA1-R進行常規PCR擴增，獲得115 bp大小的片段(圖2)，結果與預期相符。將擴增產物與pMD18-T載體連接，構建重組質粒pMD18T-gyrA。構建后的質粒經酶切、測序驗證正確后，使用核酸微量測定儀測定其濃度(結果未給出)，并計算出其拷貝數為5.74×1010copies/μL，以此作為所建立的實時熒光定量PCR方法的標準品。

M為DNA Marker (2 000 bp)；泳道1～3為gyrA1-F/gyrA1-R引物對的擴增產物；泳道4為陰性對照。

將標準品pMD18T-gyrA進行10倍梯度稀釋，分別以各個稀釋度的標準品作為模板進行實時熒光定量PCR反應，獲得的擴增曲線規律較好，各稀釋度之間的擴增Ct值相差在2～3個循環之間(圖3)；以不同稀釋度的標準品拷貝數的對數為X軸、Ct值為Y軸建立標準曲線，該曲線的斜率為-3.468，擴增效率為0.94，截距為41.86，相關系數R2=0.999 3(圖4)，表明標準品濃度在5.74×107～5.74×102copies/μL有較好的線性關系。

2.3 實時熒光定量PCR方法的靈敏性及重復性檢測

2.3.1 重組質粒標準品的靈敏度檢測

以102～107copies/μL各個稀釋度標準品pMD18T-gyrA為模板，利用所建立的方法進行檢測。結果表明，該方法最小檢出量為5.74×102copies/μL(表3)。

2.3.2 菌液靈敏度檢測

將KCA菌的原菌液(4.0×108CFU/mL)進行10倍梯度稀釋，從107～102各稀釋度提取核酸作為模板，并進行實時熒光定量PCR反應。由表4可知，該方法的菌液最小檢出限為103CFU/mL。

2.3.3 重復性檢測

以不同稀釋度的重組質粒標準品pMD18T-gyrA測定3次，組內重復Ct值的變異系數介于0.76%～3.27%，標準偏差(SD)介于0.10～0.55，組間重復Ct值的變異系數介于0.34%～1.88%，SD介于0.07～0.62，均在可接受范圍內，證明建立的實時熒光定量PCR方法組內和組間重復較好。

圖3 不同稀釋度標準品的擴增曲線

圖4 實時熒光定量PCR標準曲線

2.4 實時熒光定量PCR方法的抗干擾驗證

2.4.1 核酸水平抗干擾檢測

由表5可知，從108和103CFU/mL菌液濃度

的KCA菌所提取的核酸中分別加入108CFU/mL的副干酪乳桿菌rg-1核酸提取物時(核酸濃度為6.7 ng/μL)，KCA純菌液的Ct值均不受影響，且與無rg-1干擾下的KCA純菌液的Ct值無顯著差異(P>0.05)。

2.4.2 豆粕對檢測方法的干擾

由表6可知，純菌液最低檢測限為103CFU/mL，其中同等濃度下的純菌液與豆粕的混合物的最低檢出限為104～105CFU/mL，3次重復結果均比純菌液檢測限低1～2個梯度，表明以此方法檢測發酵豆粕中目的菌的檢測值比實際含量低10～100倍。

表3 實時熒光定量PCR標準品的靈敏度

2.5 發酵豆粕樣品的實時熒光定量PCR檢測結果

分別提取0、1、2、3、5 d的發酵豆粕樣品基因組DNA作為模板，利用gyrA1-F/gyrA1-R引物對進行常規PCR檢測。如圖5所示，不同發酵天數的豆粕提取的DNA均有擴增條帶，且隨著發酵時間延長，條帶越清晰，表明豆粕樣品中的細菌DNA均提出。

表4 實時熒光定量PCR檢測KCA菌液樣品的靈敏度

表5 核酸水平抗干擾檢測

表6 豆粕對接種菌KCA檢測的干擾

實時熒光定量PCR方法檢測結果表明(表7)，發酵0 d解淀粉芽孢桿菌數量為9.33×105copies/g(理論接種菌量為1.0×106CFU/mL)，發酵5 d時，解淀粉芽孢桿菌的數量為4.16×108copies/g，此時的該菌的數量是發酵初期的1 000倍，說明本研究建立的實時熒光定量PCR方法能定量檢測發酵豆粕中的解淀粉芽孢桿菌。

3 討 論

解淀粉芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，是枯草芽孢桿菌近緣種群的芽孢桿菌，該菌群中主要被用于微生物添加劑生產的近緣菌還有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)[27-28]。細菌的16S rDNA序列素有“細菌化石”之稱，已成為細菌系統發育分析的金標準。有研究表明，采用16S rDNA可以區分芽孢桿菌屬內的菌種，但難以區分枯草近緣種群中的各類芽孢桿菌[29-30]。因此近幾年采用細菌解旋酶gyrA基因進行細菌分類、鑒定頗受關注，Chun等[31]曾用gyrA基因設計枯草芽孢桿菌近緣種群的引物進行序列分析，表明gyrA基因能夠區分枯草近緣種群中的芽孢桿菌。本研究針對解淀粉芽孢桿菌16S rRNA基因及gyrA基因的保守區設計了引物，常規PCR檢測結果表明以gyrA基因設計出的引物進行擴增獲得了良好的種間特異性，可將目的菌與近緣菌區別，而針對16S rRNA基因設計出的引物只能達到屬間特異，這與曹鳳明等[32]描述一致。

利用實時熒光定量PCR方法進行微生物的數量檢測已在發酵領域得到較好的應用。Yong等[33]研究了固體發酵機制中產聚c-谷氨酸的解淀粉芽孢桿菌生長規律，并與活菌計數進行對比，表明建立的實時熒光定量PCR方法與活菌計數無顯著差異；夏雪娟等[34]利用實時熒光定量PCR方法檢測麻竹腌制過程中乳酸球菌的動態變化，結果表明隨著腌制時間的延長，乳酸球菌數量逐漸升高，在14 d達到峰值(4.63×108copies/μL)，相比于0 d(2.41×102copies/μL)增加了6個數量級。這些研究結果均表明，實時熒光定量PCR可以定量檢測發酵過程中優勢菌或接種菌的生長變化。本研究成功設計了可特異性檢測解淀粉芽孢桿菌KCA的引物，并利用此引物擴增的產物構建的重組質粒，建立了標準曲線，建立了定量檢測豆粕發酵過程中解淀粉芽孢桿菌KCA的實時熒光定量PCR的方法。該方法的標準品在5.74×107～5.74×102copies/μL有較好的線性關系，核酸水平最低檢測限在102 copies/μL，純菌液水平在103CFU/mL，說明該方法的靈敏性很好。此外，發酵豆粕的原料為未滅菌狀態，從檢樣中提取細菌基因組DNA時通常為混菌的DNA，進行核酸水平、菌體水平抗干擾檢測結果均表明所建立的方法抗干擾能力強，添加干擾菌核酸并不影響檢測值。

M為DNA Marker (2 000 bp)；泳道1為陰性對照；泳道2、3、4、5、6分別為發酵0、1、2、3、5 d豆粕樣品。

表7 不同發酵時間的豆粕中解淀粉芽孢桿菌的數量檢測

在實際發酵生產中，豆粕為干燥的粉末狀，加菌發酵時會對目標菌造成吸附，從而導致在提取細菌DNA時會有殘留，為了探討豆粕類固體基質對樣品中DNA檢測的影響，本研究還進行了豆粕的抗干擾驗證試驗，結果表明豆粕中目的菌的定量檢測限為104～105CFU/mL，比純菌液的高10～100倍，說明豆粕類固體基質對接種菌的DNA水平數量檢測有干擾，但因發酵豆粕時是以108～109CFU/mL的菌液、4%的接種量進行的，接種之初豆粕樣品中目的菌的含量至少在106CFU/mL，檢測基線比所建立方法高出1～2個數量級以上，不影響該方法在實際檢測中的應用。實際檢測結果表明，不同發酵時期的豆粕中的解淀粉芽孢桿菌數量均發生變化，發酵初期(0 d)，解淀粉芽孢桿菌的數量為9.33×105copies/g，發酵至5 d，解淀粉芽孢桿菌的數量為4.16×108copies/g，是接種初期的1 000倍。同時表明解淀粉芽孢桿菌的數量隨著發酵天數的延長而增加，進而降低豆粕中的抗營養因子含量，提高營養物質消化利用率，這與王梅等[35]描述一致。以上結果證明本研究建立的解淀粉芽孢桿菌的實時熒光定量PCR的方法可良好地應用于豆粕發酵過程中解淀粉芽孢桿菌的定量檢測。

4 結 論

本研究針對發酵豆粕中接種菌建立了特異性實時熒光定量PCR方法，可相對準確檢測接種菌在發酵豆粕中不同時期的數量變化，解決了以豆粕等未滅菌生產原料進行固體發酵過程中監控接種菌生長情況難的瓶頸問題，為發酵豆粕生產企業進行生產過程品質監控提供了新的科學的技術手段。