糯米酸細菌多樣性解析及其表型和基因功能預測

向凡舒 張 婷 董 蘊 侯強川 豁銀強 郭 壯

(湖北文理學院食品科學技術學院，襄陽 441053)

作為我國發酵谷物制品的特色組成部分，糯米酸是以糯米面、切碎的新鮮紅辣椒和食鹽為主要原料，混合均勻后在常溫下經過密封發酵制作而成，發酵時間大致為15～20 d。糯米酸通過煎炸的方式烹飪后酸辣香酥，爽口開胃，在我國華中地區有著較為廣泛的食用人群。谷物經微生物發酵后，其自身的消化性與生物活性均會有所提高，因而對發酵谷物制品微生物多樣性進行解析具有一定必要性[1]，但目前關于糯米酸微生物類群的研究較少。

鲊廣椒的制作工藝與糯米酸較為相似，區別在于鲊廣椒常以大米面或玉米面為主要原料制作而成，且水分含量低于糯米酸[2]。王玉榮等[2,3]對鲊廣椒中的微生物多樣性進行了解析，結果發現乳酸桿菌屬和念珠菌屬為主要的細菌和真菌類群。鄧風[4]、雷炎[5]和葛東穎[6]采用純培養的方法分別對咸豐、恩施和荊州地區鲊廣椒中乳酸菌進行了解析，均發現植物乳桿菌為其中的優勢乳酸菌。通量高、檢測速度快和價格相對較低的優點，使第二代高通量測序技術在米酒[7]、面團[8]和鲊廣椒[9]等淀粉質發酵食品微生物多樣性解析中有了廣泛應用，實現了對微生物類群的全面和準確解析[10]。

本研究在采用高通測序技術對糯米酸中細菌多樣性進行解析的基礎上，進一步對其細菌的表型和基因功能進行了預測，以期為以糯米酸為代表的特色發酵谷物制品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒、引物338F/806R、DNA聚合酶、10×PCR Buffer和dNTPs Mix、Axygen清潔試劑盒、Illumina高通量測序配套試劑。

1.2 主要儀器設備

Veriti FAST梯度PCR儀，UVPCDS8000凝膠成像分析系統，Illumina MiSeq高通量測序平臺，R920機架式服務器。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

本研究的9 份糯米酸樣品均于2019年10月下旬采集自湖南省湘西土家族苗族自治州永順縣(E109°10′～110°22.5′，N27°44.5′～29°38′)芙蓉鎮和永茂鎮，編號依次為YS1～YS9，所有樣品均在當地制作并銷售，采集到的樣品被分別裝入采樣袋中密封保存并在常溫下帶回實驗室進行后續研究。

1.3.2 宏基因組DNA提取、PCR擴增和高通量測序

每份樣品各取2 g，使用試劑盒進行DNA提取，使用加入核苷酸標簽(Barcord)的引物338F/806R對細菌16S rRNA V3-V4區進行PCR擴增，擴增體系和程序參照蔡懷依[11]的方法。將擴增產物進行測序。

1.3.3 生物信息學分析

反饋回的效序列上傳至QIIME(V1.7.0)平臺進行生物信息學分析，經97%相似度劃分和構建分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)[12]后，對其進行嵌合體檢查[13]，選擇OTU代表性序列在Ribosomal Database Project(RDP)數據庫中進行比對注釋其分類學地位[14]。在同一測序深度下計算超1指數和發現物種數等α多樣性指標，并基于UniFrac距離進行加權主坐標(principal coordinate analysis，PCoA)分析和聚類分析計算各樣品間的β多樣性[15]。

將所有樣品中平均相對質量分數大于1.0%的門、屬和OTU，定義為優勢門、屬和OTU[16]。

1.3.4 表型與基因功能預測

在BugBase(https://bugbase.cs.umn.edu/)網站上傳OTU矩陣與9 份樣品的分類信息，以獲得細菌表型預測結果[17]。使用PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)軟件預測糯米酸中細菌的基因功能[18]，并參照蛋白質直系同源簇數據庫(clusters of orthologous groups of proteins，COG)進行功能注釋[19]。

1.3.5 多元統計

使用Past3軟件進行數據處理，使用Kruskal-Wallis檢驗對各聚類間α多樣性指標、表型和基因功能類別指標進行差異性分析；使用R軟件、Origin2017和Excel2016進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 細菌群落結構研究

通過高通量測序，9 個樣品共得到了221 437 條高質量序列，平均每個樣品包含24 570 條序列，經97%相似度劃分和去除嵌合體后共得到6 256 個OTU，平均每個樣品含有695 個OTU。本研究首先使用基于OTU水平加權UniFrac距離的主坐標分析和聚類分析對各樣品細菌群落結構相似性進行了評價，結果如圖1所示。

圖1 基于加權UniFrac距離的主坐標分析和聚類分析

圖2 不同聚類樣品細菌香農指數 和發現物種數比較分析

由圖1a可知，第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為60.03%和15.29%，9 個樣品在空間排布上呈現出聚類趨勢，YS1、YS7和YS8主要分布在右上角，YS2、YS4和YS9主要分布在左上角，YS3、YS5和YS6主要分布在X軸下方。由圖1b可知，9 個樣品亦呈現出明顯的聚類趨勢，其中聚類Ⅰ由YS1、YS7和YS8構成，聚類Ⅱ由YS2、YS4和YS9構成；聚類Ⅲ由YS3、YS5和YS6構成。由此可見，主坐標分析和聚類分析結果相同，這說明不同樣品間細菌群落結構在存在差異的同時，亦具有一定的相似性。

在對各樣品序列進行抽平的基礎上，通過香農指數和發現物種數等α多樣性指標對各聚類樣品間細菌的多樣性和豐度進行了評價，結果如圖2所示。

由圖2a可知，香農指數的分布范圍在3.59～6.00之間，經Kruskal-Wallis檢驗發現，不同聚類間的樣品其香農指數差異不顯著(P>0.05)。由圖2b可知，發現物種數的分布范圍在385～703之間，隸屬于聚類Ⅱ的樣品發現物種數顯著低于其他聚類(P<0.05)，而聚類Ⅰ和聚類Ⅲ差異不顯著(P>0.05)。由此可見，隸屬于不同聚類的樣品其細菌豐度存在一定差異。

2.2 基于門和屬水平的細菌含量分析

本研究基于高通量測序結果分別從門和屬水平上對糯米酸的細菌構成進行了分析，優勢門和屬的相對質量分數如圖3所示。

圖3 糯米酸中優勢細菌門和屬的相對含量

由圖3可知，硬壁菌門和變形菌門為糯米酸中的優勢細菌門，其平均相對質量分數分別為97.45%和2.20%；隸屬于Firmicutes的Lactobacillus(乳酸桿菌屬)和Pediococcus(片球菌屬)為糯米酸中的優勢細菌屬，其平均相對質量分數分別為89.36%和6.37%。Lactobacillus和Pediococcus均為乳酸菌，而兩者的累計相對質量分數高達95.73%，由此可見，糯米酸中的細菌主要為乳酸菌，且以Lactobacillus為主。研究人員在解析其他發酵谷物制品細菌多樣性時得到了相似的結論，王玉榮[2]發現Lactobacillus和Weissella(魏斯氏菌屬)等乳酸菌為湖北省當陽地區鲊廣椒中的優勢菌屬，且Lactobacillus對產品風味品質的形成具有積極的作用；莫玉花[20]發現湖南包谷酸辣子中蘊含了豐富的乳酸菌，分離了70 株乳酸菌同時優化了L.plantarum(植物乳桿菌)發酵包谷酸辣子的工藝條件。采用多相分類鑒定方法，本研究團隊發現發酵谷物制品中的乳酸菌類群亦較為獨特，將從湖北省當陽地區和恩施土家族苗族自治州鲊廣椒中分離的2 株乳酸桿菌分別命名為“鲊廣椒乳桿菌”[21]和“恩施乳桿菌”[22]。由此可見，Lactobacillus在以谷物為發酵基質的環境中有著較好的生存優勢，這可能是與谷物在發酵過程中酸性逐漸增加及氨基酸含量明顯上升有關[23]，有研究表明Lactobacillus中的部分種自身含有的氨基酸脫羧酶能提高菌株的耐酸性，如L.brevis(短乳桿菌)中的谷氨酸脫羧酶能夠將非必需氨基酸谷氨酸轉化為功能性氨基酸γ-氨基丁酸[24]以維持細胞內pH穩態，從而提高菌株自身的耐酸性[25]。因而，在后續研究中開展以糯米酸和鲊廣椒為代表的發酵谷物制品中乳酸菌菌種資源的收集，不僅對乳酸菌遺傳多樣性研究具有積極意義，亦可對發酵谷物相關產品的研發和生產提供菌株支持。經Kruskal-Wallis檢驗發現，不同聚類間樣品優勢門和屬的相對質量分數差異不顯著(P>0.05)。

2.3 基于OTU水平的細菌含量分析

若某一個OTU在聚類Ⅰ的3 個樣品中均存在，但在聚類Ⅱ和Ⅲ中均不存在，則將其視為聚類Ⅰ的獨特OTU[16]，以此類推。各聚類中獨特OTU的數量和平均相對質量分數如表1所示。

表1 各聚類中獨特OTU的平均相對含量

由表1可知，聚類I中包含了28 個獨特OTU，其中各有24 個和2 個被鑒定為Lactobacillus和Pediococcus；聚類Ⅱ中包含了19 個獨特OTU，其中有16 個OTU被鑒定為Lactobacillus；聚類Ⅲ中包含了3 個獨特OTU，均被鑒定為Lactobacillus。由此可見，隸屬于不同聚類的糯米酸均具有以乳酸菌為主的獨特細菌類群，但其含量較少，所有獨特細菌類群的累計平均相對質量分數僅為3.22%。

若所有樣品都含有某一OTU，則將該OTU定義為核心OTU[16]，本研究共從6 256 個OTU中發現了5 個核心OTU，結果如圖4所示。

圖4 核心OTU的平均相對質量分數

由圖4可知，5 個核心OTU分別為OTU3739、OTU1903、OTU3772、OTU3572和OTU519，均鑒定為Lactobacillus，累計平均相對質量分數為10.27%。由此可見，不同聚類的糯米酸中共有一定量的乳酸菌類群，而該類群可能對糯米酸品質的形成具有重要作用。

2.4 細菌表型和基因功能預測

在對不同聚類糯米酸獨特和核心細菌類群進行解析的基礎上，本研究進一步預測了其表型和基因功能，表型結果分析如圖5所示。

由圖5a可知，糯米酸中細菌類群主要為革蘭氏陽性菌，其相對質量分數在98.36%～99.92%之間，且不同聚類間革蘭氏陽性菌相對質量分數的差異均不顯著(P>0.05)。由圖5b、和圖5c可知，隸屬于聚類Ⅰ、聚類Ⅱ和聚類Ⅲ的樣品，厭氧菌的相對質量分數分別為96.05%、21.27%和55.61%，兼性厭氧菌的相對質量分數分別為3.23%、77.73%和44.23%，經Kruskal-Wallis檢驗發現，聚類I樣品厭氧菌的含量顯著高于其他2 個聚類(P<0.05)，而兼性厭氧菌呈現出相反趨勢(P<0.05)；乳酸菌為具有產乳酸特性，無芽孢的革蘭氏陽性細菌，且絕大部分為兼性厭氧或嚴格厭氧菌[26]，這一現象與糯米酸中含有較高乳酸菌含量的結論相符合。由圖5d和圖5e可知，不同聚類樣品間好氧菌和具有氧化脅迫耐受性能力細菌的相對質量分數均較低，且差異不顯著(P>0.05)。糯米酸的發酵是在密封的壇子中完成，壇中空氣耗盡后接近厭氧環境，這可能是導致糯米酸中好氧菌含量極少且細菌氧化脅迫耐受性差的主要原因。由圖5f、圖5g和圖5h可知，具有移動原件、生物膜形成能力和致病潛力的菌群相對質量分數均較低，這也說明了糯米酸有著較好的食用安全品質。

本研究對糯米酸中細菌的基因功能亦進行了預測，所有細菌隸屬于4 018 個COG，分別注釋到了21 個功能大類，結果如圖6所示。

由圖6可知，糯米酸中細菌除了在翻譯、核糖體結構與生物發生和轉錄等自身生長繁殖功能上有著

注：NS表示差異不顯著；*表示差異顯著(P<0.05)。圖5 細菌表型預測結果

圖6 糯米酸中細菌基因功能類別分析

較高的表達外，在氨基酸轉運與代謝和碳水化合物運輸與代謝功能上亦有著較高的表達，這可能與部分乳酸菌具有水解淀粉的能力[27]和可產生游離氨基酸[28]有關。由圖6亦可知，糯米酸中細菌的細胞運動功能表達較低，這一結果與表型預測中其移動原件含量較低相一致。經Kruskal-Wallis檢驗發現，不同聚類在基因功能表達程度上的差異不顯著(P>0.05)。由此可見，糯米酸品質的形成與其蘊含的細菌類群表型和功能性之間可能有著密切的關聯。

3 結論

Lactobacillus和Pediococcus是糯米酸中主要的細菌類群，二者累計相對質量分數在總細菌類群中的占比超過了95%，且其主要以厭氧菌和兼性厭氧菌為主，在移動原件含量、生物膜形成能力和致病潛力等表型上的相對質量分數較低，但在氨基酸轉運與代謝和碳水化合物運輸與代謝等基因功能上具有高表達。由此可見，糯米酸中蘊含了豐富的乳酸菌資源。