高溫高壓膨化法降解小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及降解產物解析的研究

胡學春 任凌云 王麗娟 王 駿 張艷俠 金增偉 吳真真 王瑞杰 郭啟雷

(山東省糧油檢測中心1 ，濟南 250101) (山西糧食質量監測中心 2 ，太原 030024) (山東省食品藥品檢驗研究院 3 ,濟南 250101) (安捷倫科技(中國)有限公司 4 ,北京 100102)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是由鐮刀菌產生的單端孢族化合物中的一種，屬于?類單端孢霉烯族毒素，是一種有毒的次級代謝產物[1]，因動物食后嘔吐，又名嘔吐毒素。

小麥在生長期、成熟期和收獲期，都可感染嘔吐毒素。鐮刀菌能在1～39 ℃的溫度范圍內生長，最適溫度為25～30 ℃，最適產毒溫度通常在8～12 ℃之間。土壤幾乎包含了自然界所有菌類，我國高產量的方法之一是密集種植，陽光不能照射土壤殺死其中的真菌，當遇到陰雨連綿，溫度濕度適宜時，土壤中的真菌快速繁殖，小麥通過根系把土壤中的真菌吸收進入果實。在成熟期，小麥果殼張開，尤其是在淮河流域，此時正是梅雨季節，雨水進入籽粒果殼內，果殼降溫收縮閉合，包含住雨水，此時溫度高、濕度大，小麥籽粒特別容易感染真菌。在收獲期，糧食籽粒特別是在胚芽部，此處水分大、富含糖、脂肪和蛋白質，是真菌的良好培養基，適宜真菌的快速生長。

圖1 DON分子結構式

2006年，歐盟規定嘔吐毒素在粗谷物中的最大限最為1 250 μg/kg[2]。2001年食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)第56次會議首次對DON進行了評估，根據毒理學實驗結果，JECFA提出DON的暫定每日最大耐受攝入量( provisional maximum tolerable daily in-take，PMTDI)為1 μg/kgbw。2010年JECFA第72次會議維持了DON的PMTDI值為1 μg/kgbw[3,4]。GB 2761—2017中規定小麥及其制品中DON的最大允許限量為1 000 μg/kg[5]。

目前，國內研究小麥(糧食)中DON降解的主要方法有風選除去赤霉病粒、紫外線照射法；臭氧水浸泡法降解赤霉病小麥中的 DON[6]，DON的降解率可達19.99%，增大濃度、延長浸泡時間，降解率最大可到44.12%；生物發酵法降解糧食及其制品中真菌毒素[7]，酒糟降解后DON的含量≤500 μg/kg，還有蒙脫石物理吸附法、氨發酵法等。

本研究分析了小麥中DON的降解方法及降解產物，感染DON的小麥經高溫高壓膨化處理，不添加任何化學試劑，可使DON降解率達61.9%～81.1%，降解產物經UHPLC-QTOF-MS分析，通過全掃描模式采集數據，利用設備配置的粒子群優化算法(Particle Swarm optimization, PSO)，對不同質核比范圍內分段優化，考慮同位素權重計算精確質量數，利用分子式生成(MFG)功能生成元素組成，通過二級質譜圖檢索比對譜庫(PCDL庫)，與譜庫已知化合物分析確認降解產物的分子式，根據DON的已知結構和化學鍵能推測可能的分解產物，通過儀器內置的結構解析輔助軟件(MSC)，對未知結構進行推斷，得到至少5個分解產物，確定降解產物可能的分子結構，降解產物之一3-epi-DON的毒性是DON的1/350[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

污染DON不同程度的小麥 ，1#小麥DON含量731 μg/kg、2#小麥DON含量8 995 μg/kg、3#小麥DON含量4 023 μg/kg；DON標準物質，5 mg，純度98.0%；DON參考標準物質，Lot # D-C-622，含量1 900 μg/kg；甲醇、乙腈，色譜純。

1.1.2 儀器與設備

膨化罐：304不銹鋼，自制(見圖2)；Waters e2695高效液相色譜儀，UHPLC-QTOF-MS 6545高效液相色譜-飛行時間串聯質譜儀。

1.2 方法

1.2.1 潤麥

取500 g小麥于潤麥瓶中，加入水至實驗要求的水分，充分混合均勻，密閉放置24 h，使水被小麥完全吸收。

加水量按公式(1)計算：

w水=w樣(m1-m0)/(100-m1)

(1)

式中：w水為需要加水數量/g；w樣為實驗樣品的數量/g；m1為樣品需要加到的水分/%；m0為樣品原始水分/%。

1.2.2 小麥中DON的降解脫毒處理

實驗用膨化機膨化腔2.5 L，轉速30 r/min和60 r/min 2擋可以選擇，煤氣加熱，設計最高使用壓力1.3 MPa。

將1.2.1潤麥處理后的小麥300 g置于高溫高壓膨化機中，在不同水分、壓力下膨化處理，控制加熱時間和轉速，使膨化腔達到規定的壓力后，啟動泄壓開關，達到膨化的目的，冷卻至室溫后粉碎，粉碎后的樣品檢測其DON含量，確定降解脫毒的最佳實驗條件。

1.2.3 DON 標準物質降解實驗

將5 mg DON 標準物質溶解于1 mL乙腈中，并稀釋成500 μg /mL 的DON標準溶液，將膨化罐置于烘箱中加熱至80 ℃，把1 mL DON乙腈標準溶液滴加到膨化罐內部，使乙腈自然揮發干，將膨化罐置于高溫高壓膨化機中，按1.2.2確定的最佳條件隨同樣品一起膨化處理。

圖2 膨化罐結構示意圖(單位mm)

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 按照GB 5009.111—2016《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法測定小麥降解脫毒處理前后的DON含量。

1.2.4.2 按照 LS/T 6113—2015《糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定 膠體金快速定量法》測定小麥降解脫毒處理前后的DON含量。

1.2.4.3 高效液相色譜-飛行時間串聯質譜儀解析DON降解產物

UHPLC-QTOF-MS實驗條件為，液相色譜柱: Agilent Eclipse Plus C18(RRHD)(柱長150 mm，柱內徑 3.0 mm, 填料粒徑1.8μm)；流動相: A相：水溶液(0.5 mmol/L 氟化銨+ 4.5 mmol/L 甲酸銨+ 0.1% 甲酸)；B相：甲醇溶液 (0.5 mmol/L 氟化銨+ 4.5 mmol/L 甲酸銨+ 0.1% 甲酸)；梯度洗脫；流速: 0.40 mL/min；柱溫: 40 ℃；進樣量：10 μL；離子源: 電噴霧離子源；質量數掃描范圍: 40m/z～1 000m/z(+)；40m/z～1 100m/z(-) ；干燥氣溫度: 300 ℃；干燥氣流量: 7 L/min；霧化器壓力: 40 psi；鞘氣溫度: 375 ℃；鞘氣流量: 12 L/min；毛細管電壓: 3 500 V/4 000 V；噴嘴電壓: 0 V/1 000 V；采集頻率：2 Spec/s。

2 結果與分析

2.1 測定結果準確度的質量控制

不同方法測定DON的結果均符合GB 5009.111—2016中25%的重復性實驗要求，也達到DON參考標準物質第一范圍800～1 000 μg/kg的要求，從而確定本研究對DON測定結果的可靠性。

2.2 小麥中DON降解條件選擇實驗

2.2.1 膨化機檢漏和預熱

檢漏和預熱：在膨化腔加入100 mL水，關閉密封閥，檢查是否漏水。開啟自動旋轉器30 r/min、點火加熱至1.3 MPa，關閉加熱和旋轉器，開啟膨化開關。如果有漏氣，檢查或更換密封墊片后繼續實驗。

實驗結果表明，膨化壓力在0.7 MPa以下時，轉速選擇30 r/min和60 r/min均可，膨化壓力在0.7 MPa以上時，應選擇轉速60 r/min，保證受熱均勻和膨化效果。

2.2.2 水分對DON降解的影響

將2#小麥潤濕至水分為15%、20%、25%，分別置于高溫高壓膨化機中，調整壓力為0.7 MPa， 小麥降解后DON檢測結果見表1。

表1 水分對降解的影響結果

實驗結果表明，水分對降解脫毒效果影響不大，考慮到能耗，選擇20%。

按照設想，水分的增加會有利于小麥中DON的降解。按照克拉伯龍方程PV=nRT,1 moL 水完全氣化，在理想狀態下的體積是22.4 L，體積膨脹1 244倍，飽和水蒸氣在0.7 MPa時的溫度約165 ℃，在壓力P一定時，v1/T1=v2/T2，當溫度從20 ℃(293 K)升高到165 ℃(438 K)時，體積增加1.5倍，即1 moL水完全氣化，溫度達到165 ℃時的體積膨脹1 866倍，水分體積的瞬間爆破，有可能將小麥連同DON一起撕裂，但實驗結果表明，增加水分并不會提高降解效果。

2.2.3 壓力對DON降解的影響

將2#小麥潤濕至水分為20%，分別置于高溫高壓膨化機中，調整壓力為0.7、1.0、1.3 MPa，小麥降解后DON檢測結果見表2。

表2 壓力對降解的影響結果

實驗結果表明，壓力是影響降解脫毒效果的關鍵因素，選擇壓力1.3 MPa。

膨化時的溫度、壓力是影響膨化效果的關鍵因素，溫度是由壓力確定的，所以調節壓力是本實驗的主要控制條件，但因本膨化機設計的最高使用壓力是1.3 MPa，為安全計只能使用到最高設計壓力。增加壓力即提高溫度，分子獲得足夠能量，化學鍵斷裂，說明在高溫高壓下瞬間爆破使化學鍵獲得足夠的能量是DON降解的必要條件。

2.2.4 小麥中DON降解的重復性實驗

將1#、2#、3#小麥潤濕至水分為20%，置于高溫高壓膨化機中，在1.3 MPa壓力下，在不同時間進行重復性實驗，在不同的實驗室測定其原料和處理后產品的DON含量，結果見表3。

實驗結果表明，在一年內不同時間，對不同DON含量的小麥進行降解實驗，降解率在61.9%～81.1%，平均75.2%，說明本方法對于污染不同濃度DON的小麥降解脫除效果是可重復實現的，方法是可靠的。降解率的差異，應該是樣品檢測及實驗參數的差異引起的，而不是方法的不穩定引起的。

表3 DON重復性實驗的結果表

2.3 DON標準物質的降解脫毒處理及其降解產物的分析

2.3.1 DON標準物質的降解脫毒處理

將1.2.3處理的膨化罐隨小麥在壓力為1.3 MPa時膨化處理，然后將膨化罐置于乙腈中浸泡清洗罐中的DON及其降解產物，濃縮后用UHPLC-QTOF-MS解析其降解產物。

2.3.2 主要降解產物的變化方式和降解產物的基本參數

根據UHPLC-QTOF-MS分析檢定，解析出以下5種DON降解產物，見表4和圖3。

表4 DON主要降解產物

2.3.3 DON主要降解產物的高分辨質譜圖

DON降解的主要途徑為DON的3-OH的β、α異構化和酮基化及內醚鍵的水化反應、C5、C6位基團的降解脫落等。3-OH和內醚結構是 DON的重要毒位點，3-OH的異構化和內醚鍵水化反應使內醚鍵的斷裂對DON毒性的降低意義重大。

2.3.3.1 主要降解產物之一

水化-DON的保留時間和同位素分布匹配圖，見圖3。

圖3 水化-DON的保留時間和同位素分布匹配圖

圖3a為水化-DON的保留時間和豐度圖，圖3b為水化-DON的同位素分布的理論值(方框)和實際值(方框內棒狀)完美匹配，基本確定了降解產物水化-DON的分子式、分子結構式、分子質量，化學反應方程結構式如圖4。

圖4 DON發生水化反應生成水化-DON的反應結構方程式

雜環內醚結構是目前已知DON的重要毒位點之一，水化反應是醚鍵打開，結合一個H2O分子，此處分子鍵的斷裂對毒性的降低意義重大。 此處化學鍵的斷裂，意味著DON的雜環結構變成不穩定的單鍵連接，猜測雜環結構完全斷裂的可能性極大。

2.3.3.2 主要降解產物之二

3-epi-DON的保留時間和同位素分布匹配對比圖見圖5。

圖5a為DON和3-epi-DON的保留時間和豐度對比圖，圖5b為DON和3-epi-DON的同位素分布的理論值(紅框)和實際值(紅框內棒狀)匹配對比圖，基本確定了3-epi-DON的分子式、分子結構式、分子質量。

圖5 DON和3-epi-DON的保留時間和同位素分布匹配對比圖

盡管3-epi-DON只是DON的3位羥基發生差向異構，是 DON的同分異構體，與DON的分子式、分子質量、質核比一樣，但二者的分子結構式不同，保留時間有較大差異，這也說明了二者的化學性質有較大差異，也從另一方面證明了3-epi-DON與DON的毒性有較大差異。

3 結論

污染了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的小麥，經高溫高壓膨化處理，61.9%～81.1%的DON發生了降解反應，已經解析出的降解產物有水化-DON、3-epi-DON、3-kedo DON；降解機理是DON分子化學鍵獲得足夠能量發生斷裂，其斷裂途徑主要是DON的3位羥基發生差向異構和酮基化，1位內醚發生水化反應；壓力是影響降解脫毒效果的關鍵因素；通過UHPLC-QTOF-MS基本確定了DON部分裂解產物的分子式有C15H20O6、C15H18O6、C15H22O7，分子質量分別是296.126 0、294.110 3、314.136 6 ku。