綠豆皮牡荊素對H2O2損傷HUVEC細胞的預防和治療作用

羅 磊 杜冠尚 張向輝 夏迎利 段雪瑩 朱文學

(河南科技大學食品與生物工程學院；河南省農產品干燥裝備工程技術研究中心，洛陽 471023)

心腦血管疾病是一類高患病率和高死亡率的疾病，致死率居世界首位，嚴重威脅人類尤其是中老年人健康[1, 2]。人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)，是覆蓋于心血管和淋巴管內表面的單層扁平細胞，其氧化損傷能誘發多種血管類疾病，相比其他細胞具有繁殖快，培養周期短等特點。曹致超等[3]建立HUVEC細胞氧化損傷模型，考察黃芩莖葉總黃酮對其保護作用及機制；吳瓊等[4]探究葒草花提取物對H2O2誘導的HUVEC細胞氧化損傷的保護作用研究。氧化應激反應是造成血管內皮細胞損傷的重要因素之一，H2O2作為體內常見的活性氧分子，能直接作用于細胞膜，造成脂質過氧化，破壞細胞組織[5, 6]，常被用來誘導細胞氧化建立損傷模型。

綠豆(Mung Bean)，又名青小豆，蝶花亞科豇豆屬，產量和出口量均居世界首位[7, 8]。綠豆皮是包裹在綠豆外部的種皮，占綠豆質量的8%，在綠豆深加工過程中常被廢棄，造成很大的資源浪費和環境污染[9]。研究表明，綠豆皮中黃酮含量為10.18 mg/g，牡荊素占其中的51.99%，被認為是綠豆皮主要抗氧化成分[10]。An等[11]發現金蓮花牡荊素能提高小鼠血清SOD等抗氧化酶系，延緩衰老；Guimaraes等[12]研究發現牡荊素能減弱Aβ神經毒性，減輕細胞損傷；周欣等[13]發現牡荊素能抑制細胞內自由基活性，減少活性氧復合物。目前鮮見牡荊素對HUVEC細胞氧化損傷的預防和治療作用，因此本實驗以綠豆皮牡荊素為研究對象，考察其對HUVEC細胞氧化損傷的保護作用，以期為綠豆皮應用于血管類疾病的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆皮牡荊素實驗室自制；禾盛澤綠豆皮，粉碎過篩；纖維素酶(酶活≥150 U/mg)輔助APG聯合超聲醇提，經HPD100B大孔吸附樹脂純化所得；人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)、DMEM培養基、胎牛血清、胰酶、噻唑藍(methyl thiazoly1 tetrazolium，MTT)、雙抗(青霉素-鏈霉素)、二甲基亞砜(DMSO)、BCA蛋白定量試劑盒、MDA、SOD、LDH、GSH、GSH-Px測定試劑盒；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SNWTZ-5N冷凍干燥箱，XKX41倒置微鏡，FM-CJ-6FD超凈工作臺，E191IR型CO2細胞培養箱，XW-80A漩渦混合儀，L5S紫外-可見分光光度計，680全自動酶標儀，KQ-500DE超聲波清洗儀，HH-S6A水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，1.7 μm)；紫外檢測器波長278nm；柱溫：25 ℃；進樣量20 μL；流速1.0 mL/min；流動相：A為水(0.5%甲酸)，B為乙腈(色譜級)；梯度洗脫條件：0～3 min，5% B；3～6 min，10% B；6～9 min，15% B；9～12 min，20% B；12～15 min，25% B；15～20 min，30% B；20～25 min，20% B；25～30 min，10%B；30～35 min，5%B。

1.3.2 綠豆皮牡荊素提取和含量測定

提取方法參照李俠等[10]、HAN等[14]有改動，并利用HPLC法進行含量測定[15]：稱取10 g過80目篩的綠豆皮粉末，放入90 mL水中，加入0.5%纖維素酶，在pH4.5、50 ℃條件下酶解60 min，沸水滅酶3 min，抽濾得濾渣和酶提液V1，濾渣和70%乙醇以1∶10的比例混合，加入APG0810調整濃度為0.5%、調pH為8.5，室溫浸泡2.5 h后，350 W、50 ℃超聲45 min，過濾得提取液V2，合并V1、V2得綠豆皮牡荊素粗提液V，50 ℃旋蒸濃縮至一定體積，4倍體積無水乙醇沉淀離心去大分子，過0.22 μm濾膜，278 nm下高效液相色譜測定峰值，帶入牡荊素標準曲線(y=41.997x+16.217，R2=0.999 5)，按式(1)計算提取量：

(1)

式中：C為綠豆皮牡荊素濃度；V為粗提液總體積；N為稀釋倍數；M為綠豆皮質量。

1.3.3 綠豆皮牡荊素的純化

預處理HPD-100B型樹脂，將2 BV質量濃度為1.5 mg/mL的綠豆皮牡荊素提取液以1.5 mL/min的速度過柱吸附(pH 4.0)，吸附完全后先用3 BV蒸餾水洗脫除雜，再用3BV體積分數為70%的乙醇以1.0 mL/min的速度進行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至有淡黃色固體析出，真空冷凍干燥得綠豆皮牡荊素，測定純度為(81.690±0.241)%。

1.3.4 HUVEC細胞培養

配制含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基，將復蘇后細胞移入裝有適量培養基的25 cm2的細胞培養瓶中。在5%CO2、37 ℃細胞培養箱中培養觀察，及時更換培養液，待細胞覆蓋率達80%左右，以1∶2比例傳代。

1.3.5 HUVEC細胞氧化損傷模型建立

取對數生長期細胞懸液加入相同比例臺盼藍溶液，進行細胞計數，調整細胞濃度為2.0×105個/mL，每孔200 μL接種于96孔板，在5% CO2、37 ℃條件下培養至細胞貼壁。棄上清，加入不同濃度H2O2進行細胞損傷，共10個梯度，6個平行，相同條件下培養24 h，PBS沖洗1～3次，每孔先加入200 μL培養基、再加入10 μL質量濃度為5 mg/mL的MTT，繼續培養4 h棄上清，每孔加入150 μLDMSO，室溫放置10 min，放入酶標儀，調節濾光片至490 nm，記錄吸光度值，帶入式(2)計算細胞存活率。

(2)

式中：A0為空白組吸光度均值；A1為不同濃度H2O2吸光度均值。

1.3.6 綠豆皮牡荊素質量濃度選擇

用培養基配制不同濃度的綠豆皮牡荊素溶液代替H2O2，其余操作步驟及計算方法參照1.3.5。

1.3.7 細胞及細胞培養液制備

預防組：在六孔板中設置空白組、模型組、低、中、高劑量組、VC對照組，參照1.3.5調整細胞濃度為2.0×105個/mL，每孔接種2.0 mL，在5% CO2、37 ℃條件下培養24 h，棄培養液。3個劑量組各加入2.0 mL相應質量濃度的綠豆皮牡荊素培養液；對照組加入2.0 mL質量濃度為100 μg/mL的VC培養液，其余兩組加入2.0 mL培養基，5% CO2、37 ℃條件下培養24 h，棄上清。除空白組外每孔加入2.0 mL濃度為900 μmol/L的H2O2，在相同條件細胞培養箱中培養4 h。收集培養液離心(1 500 r/min、5 min)取上清待測；細胞消化后，用PBS吹洗離心(1 000 r/min、10 min)，取細胞沉淀團塊加1.0 mLPBS，冰浴超聲破碎(450 W、5s/次、間隔30 s、重復3次)待測。

治療組：按上述步驟將細胞接種培養24 h后，先加入H2O2損傷細胞，再加入不同濃度綠豆皮牡荊素溶液和VC培養液，其余操作方法保持不變。

1.3.8 MDA、SOD、LDH、GSH、GSH-Px測定

參照試劑盒方法測定細胞及培養液中的各項指標。

1.4 數據處理

用Origin85軟件作圖、用DPS7.5軟件中Tukey法進行完全隨機單因素方差分析，不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜結果

經HPD100B大孔吸附樹脂純化后綠豆皮牡荊素色譜圖如圖1b所示，與圖1a牡荊素標準溶液色譜峰保留時間一致，說明提取成分為牡荊素。

圖1 標準品和樣品HPLC色譜圖

2.2 過氧化氫及綠豆皮牡荊素濃度篩選

過氧化氫(H2O2)是機體氧化應激過程中產生的活性氧，能分解產生氧自由基，過量存在可誘發細胞內的某些蛋白變性，造成內皮細胞損傷從而導致細胞凋亡[16-18]。如圖2，H2O2濃度越高對HUVEC細胞抑制作用越明顯，細胞存活率越低。當H2O2濃度為900 μmol/L時，細胞半數致死，存活率為51.32%。H2O2濃度過高細胞死亡損傷嚴重，濃度過低不能有效抑制細胞生長，兩種情況均不能客觀反映后期藥物處理對細胞的保護作用[19]，因此選擇900 μmol/L作為模型損傷濃度。

綠豆皮牡荊素質量濃度在0～100 μg/mL范圍內，細胞存活率與濃度呈正相關，藥物濃度越高，細胞存活率越高；小于60μg/mL時，藥物對細胞生長影響不顯著(P>0.05)；為60、80、100 μg/mL時，細胞增值加速，影響效果顯著(P<0.05)，存活率分別為110.61%、122.3%、131.68%；藥物濃度高于100 μg/mL時，產生高濃度抑制，細胞存活率顯著下降(P<0.05)。因此選擇能顯著促進細胞生產的藥物濃度作為后期低、中、高劑量處理濃度(即60、80、100 μg/mL)。

圖2 不同濃度H2O2及綠豆皮牡荊素對HUVEC細胞生長的影響

2.3 HUVEC細胞及培養液中MDA含量

MDA是機體中氧自由基與多不飽和脂肪酸結合產物，能降低細胞免疫機能，影響細胞分裂，促使細胞凋亡[20-22]。如圖3，H2O2能顯著增高細胞和培養液中MDA含量(P<0.05)，不同濃度藥物處理均能顯著降低MDA含量(P<0.05)；預防組細胞和培養液中MDA含量整體低于治療組，且藥物濃度越大，組間差異越小；治療組細胞中MDA抑制能力與藥物

圖3 HUVEC細胞和培養液中MDA含量

濃度呈明顯正相關(P<0.05)；當藥物濃度為100 μg/mL時，預防組細胞和培養液中MDA含量與VC對照組基本一致。說明一定濃度的綠豆皮牡荊素能降低MDA含量，增強細胞抗氧化能力，且損傷前預防優于損傷后治療。

2.4 HUVEC細胞及培養液中SOD活性

SOD是機體內重要的酶類抗氧化物，能通過歧化反應及時清理氧自由基，是反映機體抗氧化能力的重要指標[23-25]。從圖4可看出，H2O2處理后細胞及培養液中SOD活力顯著降低，劑量組與模型組相比SOD活力顯著上升(P<0.05)；治療組細胞和培養液中SOD活力高于預防組；當綠豆皮牡荊素質量濃度為100 μg/mL時，治療組細胞和培養液中SOD活力與VC組持平(P>0.05)；預防組藥物質量濃度為80、100 μg/mL時，培養液中SOD活性相差不大。說明綠豆皮牡荊素質量濃度在80～100 μg/mL內，能起到調節機體內氧化平衡的作用。

圖4 HUVEC細胞和培養液中SOD活性

2.5 HUVEC 細胞及培養液中LDH活性

LDH是一種存在于細胞內部，促進機體能量代謝的氧化還原類酶，當細胞受損時，會透過細胞膜滲透到細胞外部，其活性大小可客觀反映細胞損傷程度[26, 27]。如圖5，H2O2處理能顯著降低細胞中LDH活性，提高培養液中LDH活性(P<0.05)；預防組和治療組細胞中，低、中、高劑量組LDH活性差異顯著，與藥物濃度呈明顯正相關(P<0.05)，濃度為100 μg/mL時，治療組細胞中LDH活性與VC治療組無明顯差異(P>0.05)；預防組和治療組培養液中LDH活性隨藥物濃度變化差異不顯著(P>0.05)，中、高劑量藥物治療效果幾乎與VC組持平。

圖5 HUVEC細胞和培養液中LDH活性

2.6 HUVEC細胞及培養液中GSH含量

GSH是細胞內重要的代謝調節物質，能還原機體細胞在氧化損傷過程中殘存的H2O2為H2O，本身作為反應底物被大量消耗，因此GSH含量可作為評價機體抗氧化能力大小的指標[28, 29]。如圖6所示，

圖6 HUVEC細胞和培養液中GSH含量

H2O2能顯著降低細胞和培養液中GSH含量(P<0.05)；治療組細胞和培液中GSH含量與藥物劑量呈顯著正相關(P<0.05)，中、高劑量藥物(綠豆皮牡荊素質量濃度分別為80、100 μg/mL時)處理后，預防組細胞和培養液中GSH含量差異不顯著(P>0.05)；當藥物質量濃度100 μg/mL時，治療組細胞和預防組培養液中GSH含量與VC處理組無顯著差異(P>0.05)。

2.7 HUVEC 細胞及培養液中GSH-Px活性

GSH-Px是機體內廣泛存在的抗氧化酶，能特異催化GSH與H2O2反應生成H2O，從而降低體內H2O2濃度，維持細胞結構完整性，在機體抗氧化過程中表現積極[30, 31]。如圖7，模型損傷組、劑量組細胞和培養液中GSH-Px活性相比空白組顯著下降(P<0.05)，各藥物處理組細胞和培養液中GSH-Px活性相比模型組顯著上升(P<0.05)，各劑量組之間存在明顯差異；當藥物質量濃度為100 μg/mL時，治療組細胞和培養液中GSH-Px活力與VC處理組無明顯差異(P>0.05)。

圖7 HUVEC細胞和培養液中GSH-Px活性

3 討論

機體內促氧因子和抗氧因子失衡導致的自由基過剩能誘導細胞衰老病變，是造成心腦血管疾病和癌癥等慢性疾病產生的重要因素，因此增加機內抗氧化物質是治療這類疾病的有效手段[32]。研究表明食物中的活性成分(酚類、黃酮等)能顯著抑制體內自由基活動，長期食用富含抗氧化成分的食物能增強人體免疫力，減少血管類疾病的發病率[33-35]。

牡荊素的抗氧化活性與其結構密切相關，其C環上連接的酚羥基活性最高，能與自由基反應生成較穩定的半醌式自由基，從而終止自由基的鏈式反應，其C2和C3之間的雙鍵結構在一定程度上能增強B環酚羥基作用，增強抗氧化效果[36, 37]。關于牡荊素是否能在機體內直接作用于內皮細胞，以及其在體內的代謝產物有待進一步研究。

4 結果

采用H2O2誘導HUVEC細胞建立細胞氧化損傷模型，觀察不同綠豆皮牡荊素濃度對細胞生長的影響，確定最佳藥物濃度，探究其對細胞氧化損傷的預防和保護作用。結果表明，H2O2能不同程度的抑制HUVEC細胞增值，900 μmol/L H2O2濃度為最佳損傷濃度；HUVEC細胞存活率在一定范圍內隨綠豆皮牡荊素濃度增加，呈現先上升后下降的趨勢；無論是損傷前預防還是損傷后治療，低、中、高濃度綠豆皮牡荊素均能顯著降低細胞和培養液中MDA含量，增加GSH含量，提高SOD、GSH-Px酶活，并存在一定劑量依賴性；同時綠豆皮牡荊素能減輕細胞膜受損程度，阻礙細胞內LDH滲透到細胞外；當藥物質量濃度為100 μg/mL時，細胞保護能力相當于VC對氧化損傷細胞的保護能力。綠豆皮牡荊素有較好的抗氧化能力，能有效避免機體有害成分和活性氧累積，提高各種抗氧化酶類活性，保護細胞完整性。