臭氧處理對花生蛋白結構性能的影響

嚴永紅 鄭召君 林 葉 李進偉

(無錫中糧工程科技有限公司1，無錫 214035) (江南大學食品學院2，無錫 214122)

作為我國重要的油料作物，花生年產量已逾1700萬t，其中約50%以上用于榨油[1]。而榨油后副產物——花生蛋白質含量高，約占40%～50%，其必需氨基酸含量約占總蛋白的11%左右，是一種優質的植物性蛋白資源[2-4]。然而花生蛋白在加工利用過程中易受氧化劑的影響，蛋白質結構特性發生改變，進而影響相關產品的品質。因此，解析氧化劑對花生蛋白結構特性的影響對改善產品加工品質具有重要意義。

作為一種可接觸型食品氧化劑和消毒劑，臭氧自從1977年被美國FDA公認為食品類安全添加劑以來，被廣泛應用于食品工業領域[5]。臭氧處理可以改變麥谷蛋白的二級結構，提高其蛋白分子尺寸及緊密度，進而改變面團的流變特性，并對小麥粉具有增白效果[6, 7]。臭氧具有殺菌消毒作用，安全無污染，也常被應用于水產品的加工與貯藏[8]。此外，有研究表明臭氧有助于氧化降解花生仁、玉米、開心果中的黃曲霉毒素[9, 10]，且其對花生仁的降毒效果明顯優于小麥粉[11]。林葉等[12]發現臭氧處理可降低花生中黃曲霉毒素B1(140 μg/kg)，使其低于國家標準GB 13078—2001的限量要求，但臭氧處理會導致蛋白體外消化率與溶解性、乳化性、凝膠性等功能特性的降低。因此，臭氧因其氧化、消毒和降毒功能而被廣泛應用于食品加工過程，但臭氧處理對花生蛋白結構特性的影響尚不明晰。

本研究以花生蛋白為研究對象，探討臭氧處理前后蛋白的氨基酸組成、空間結構、巰基以及羰基變化，進而深入探討臭氧處理對花生蛋白結構特性的影響，為臭氧應用于花生提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生、丙烯酰胺、1-苯氨基萘-8-磺酸、(ANS)、四甲基乙二胺(TEMED)、5,5′-二硫代二硝基苯甲酸(5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)、十二烷基硫酸鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HY-003臭氧發生器，Jasco J-715圓二色譜儀，Waters高效液相色譜儀，F-7000熒光光譜儀，FE20 pH計，HH-4數顯恒溫水浴鍋，TA Q100差示掃描量熱儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 臭氧處理花生粕

花生粕樣品(100 g)置于通入100 mg/L臭氧的空氣洗瓶中，此時氣體流量為4.0 L/min，每充氣兩分鐘充分振搖一次，并于臭氧處理0、2、5、10、20 min時收集樣品，即為不同臭氧處理時間下的花生粕樣品。

1.3.2 提取花生蛋白

參考Reddy等[13]花生蛋白提取方法，并稍作修改。處理前后的花生樣品溶于去離子水以制備濃度為10%的溶液，隨后加入2 mol/L NaOH溶液調節至pH 9.0。室溫震蕩1 h后9 690 g、4 ℃離心30 min，收集上清液。而后加入2 mol/L HCl調節pH至4.5以沉淀蛋白，9 690 g、4 ℃離心20 min，收集沉淀后加水復溶，并調節溶液至pH 7.0。冷凍干燥獲得花生蛋白樣品，4 ℃儲存備用，并采用凱氏定氮法測定蛋白含量。

1.3.3 氨基酸組成測定

150 mg花生蛋白樣品與 8 mL 6 mol/L HCl 混合均勻，置于110 ℃條件下水解約22 h。水解液過濾、離心，收集上清液，采用高效液相色譜法測定樣品中氨基酸含量。

1.3.4 巰基與二硫鍵含量測定

參照Beveridge等[14]報道的方法，測定臭氧處理前后花生蛋白的游離巰基(SH)與二硫鍵(-S-S-)含量。按照式(1)計算總巰基(Total SH)含量。

總巰基含量/(μmol/g Pro)=2×二硫鍵含量+游離巰基含量

(1)

1.3.5 羰基含量測定

參考Levine等[15]的方法并稍作修改。將1.0 mL花生蛋白溶液(2 mg/mL)與3.0 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼溶液(含2 mol/L HCl)混合均勻，室溫條件下避光反應1 h。在上述混合液中加入1 mL三氯乙酸(50%)后，10 000 g離心20 min收集沉淀，并用乙醇-乙酸乙酯溶液(1∶1)反復洗滌沉淀3次。之后加入3 mL鹽酸胍溶液(6 mol/L)，37 ℃水浴20 min溶解沉淀，并于367 nm波長處測定所得溶液的吸光值。

1.3.6 差示量熱掃描

采用差示掃描量熱儀(DSC)測定花生蛋白的熱性質。2.5 mg樣品加入10 μL磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.0)混勻加入鋁盤并密封，進行DSC掃描，溫度掃描范圍20～110 ℃，升溫速率5 ℃/min。利用Universal Analysis 2000 軟件處理圖譜獲得花生樣品的變性溫度(Td)和總變性焓(ΔH，J/g干物質)。

1.3.7 表面疏水性測定

參照Kato等[16]方法，利用ANS熒光探針法測定臭氧處理前后花生蛋白的表面疏水性。采用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.0)配制一系列花生蛋白溶液，溶度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL。隨后將20 μL ANS溶液加入至4.0 mL蛋白溶液中，混合均勻，利用熒光光譜儀進行熒光強度的測定，激發波長和發射波長分別為365、484 nm。蛋白質表面疏水性則表示為熒光強度隨蛋白質濃度變化曲線的初始斜率。

1.3.8 圓二色(CD)光譜測定

參考Zhao等[17]方法并稍作調整。10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)溶解花生蛋白制備濃度為0.25 mg/mL的樣品溶液，并利用CD光譜儀分析其CD特性。主要參數為：掃描波長190～250 nm，掃描寬度1.0 nm，掃描速率100 nm/min，掃描頻率5次。記錄光譜并分析花生蛋白的二級結構。

1.3.9 十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

參照Jiang等[18]方法并稍作修改，分別采用還原型和非還原型SDS-PAGE方法測定花生蛋白的分子量分布。分離膠和濃縮膠濃度分別為12%和4%，上樣10 μL，在恒流模式下進行蛋白電泳。與非還原型SDS-PAGE相比，還原型SDS-PAGE蛋白電泳樣品另外加入1 mmol/L β-巰基乙醇。電泳結束后，采用考馬斯亮藍染液對蛋白膠進行染色，隨后利用甲醇-醋酸溶液脫色，并用凝膠成像儀采集電泳圖像。

1.4 數據統計分析

本研究試驗組內測定3次平行，結果采用“均值±標準誤”形式表示，并采用Origin 8.0統計軟件進行數據統計分析并作圖，不同的小寫字母表示P<0.05。

2 結果與討論

2.1 臭氧處理對花生蛋白氨基酸組成的影響

蛋白質一級結構主要表現為氨基酸組成與含量，氨基酸組成的差異影響蛋白質的結構與功能[19]。眾所周知，加工處理過程可能會造成氨基酸的差異，這與底物蛋白、氨基酸類型以及加工方式有關[20]。因此，臭氧處理對花生蛋白氨基酸組成的影響見表1。花生蛋白中占比最高的必需氨基酸為苯丙氨酸，其含量隨臭氧處理時間延長而呈下降趨勢，這可能是因為部分苯丙氨酸被臭氧氧化成醌類化合物[21]。類似的是，甲硫氨酸和半胱氨酸等含硫氨基酸含量也呈現出時間依賴性，隨臭氧處理時間增加而逐漸下降。推測其原因，可能是因為臭氧氧化含硫氨基酸的巰基生成二硫化物類，從而導致甲硫氨酸和半胱氨酸分別轉化為砜和胱氨酸[21, 22]。相比較而言，其他氨基酸含量變化不明顯，這可能與氨基酸種類以及氨基酸殘基所處蛋白質中的位置有關，氨基酸殘基蜷縮于空間結構內部，呈現相對穩定狀態而不易被臭氧氧化或對臭氧作用不敏感。

表1 臭氧處理前后花生蛋白的氨基酸組成/%

2.2 臭氧處理對花生蛋白巰基與二硫鍵的影響

臭氧處理導致花生蛋白甲硫氨酸和半胱氨酸含量下降，這可能與其內部的巰基和二硫鍵息息相關，而其含量的變化標志著蛋白質氧化[23]。由圖1可知，隨著臭氧處理時間延長，巰基含量顯著性下降(P<0.05)，而二硫鍵含量則呈現明顯上升趨勢。究其原因，可能是臭氧處理過程中形成氧自由基，氧化巰基而形成二硫鍵，導致巰基下降而二硫鍵升高的現象[24]；此外，臭氧可以促進巰基與其他化合物發生反應，從而降低游離巰基含量[25]。臭氧處理后花生蛋白中二硫鍵含量的不斷增加也許與巰基以及含硫基團被氧化有關，或者是兩分子的半胱氨酸側鏈上的巰基發生聚合形成胱氨酸，從而提高了二硫鍵含量。相似地是，Liu等[26, 27]研究發現，氧自由基導致氧化蛋白質的二硫鍵含量升高而巰基含量下降。值得注意的是，花生蛋白質中二硫鍵約是同等條件下巰基含量的幾十倍，因此總巰基與二硫鍵含量變化趨勢相似，隨臭氧處理時間延長而逐漸增加。

圖1 臭氧處理對花生蛋白巰基和二硫鍵含量的影響

2.3 臭氧處理對花生蛋白羰基含量的影響

蛋白質中的氨基酸側鏈基團易被氧化劑氧化成羰基衍生物，因此羰基含量的變化直接與蛋白質氧化程度相關聯[28]。由圖2可知，與對照組相比，臭氧處理導致花生蛋白質中羰基含量顯著提升，且隨臭氧處理時間延長而不斷上升。這說明臭氧導致部分蛋白發生氧化反應，產生氧自由基，而活性氧則會攻擊氨基酸殘基中游離氨基或亞氨基生成羰基，或是高活性氧自由基導致肽鏈骨架斷裂而生成羰基衍生物[29]。此外，樣品中殘留脂質在臭氧作用下氧化形成高活性的自由基，從而與花生蛋白殘基反應，導致蛋白質中羰基含量增加[30]。

圖2 臭氧處理對花生蛋白羰基含量的影響

2.4 臭氧處理對花生蛋白熱性質的影響

臭氧處理可導致蛋白構象變化，從而改變了蛋白質的熱穩定性。與對照組相比，臭氧處理導致花生蛋白的初變性溫度(Tm)以及變性溫度(Td)升高，進而引起吸熱焓增加，表明臭氧可使蛋白質熱穩定性提高，蛋白質結構舒展變性需要更高的能量(表2)。隨著臭氧處理時間延長，花生蛋白的變性溫度呈上升趨勢，這可能是因為臭氧處理導致二硫鍵共價聚集形成更緊密的蛋白結構，進而強化了蛋白熱穩定性[31]。相同地是，在0～10 min時，花生蛋白的吸熱焓與臭氧處理時間呈正相關，但處理20 min后的花生蛋白吸熱焓略有下降。原因可能是長時間臭氧處理破壞蛋白有序的折疊結構，這與臭氧作用于小麥蛋白的結果相似[32]。

表2 臭氧處理前后花生蛋白的變性溫度及變性焓

2.5 臭氧處理對花生蛋白表面疏水性的影響

如上所述，臭氧處理導致苯丙氨酸和蛋氨酸等疏水性氨基酸含量有所下降，由此推測臭氧可能影響花生蛋白的表面疏水性。由圖3可知，0～10 min臭氧處理可導致花生蛋白的表面疏水性下降，處理時間與表面疏水性呈負相關線性關系(R2=0.988 1)。由此可推斷，臭氧逐漸氧化花生蛋白表面的疏水性基團，降低疏水性；或者是臭氧作用加劇了花生蛋白內部的疏水性基團的過度暴露，基團之間彼此相互作用，導致部分疏水性位點被遮蓋，從而降低了疏水性。而相反地是，臭氧處理20 min的花生蛋白表面疏水性反而顯著高于處理10min的樣品，表明過度臭氧處理加速暴露蛋白內部的疏水性基團；也可能是長時間臭氧氧化生成具有疏水特性的化合物，反而增加了花生蛋白的表面疏水性。

圖3 臭氧處理對花生蛋白表面疏水性的影響

2.6 臭氧處理對花生蛋白二級結構的影響

CD光譜是表征蛋白質二級結構變化的一種精準、快速技術。如圖4所示，對照組(臭氧處理0 min)在195～200 nm呈現正峰模式，210 nm左右則顯示出負峰，表明花生蛋白具有明顯的α-螺旋/β-折疊結構。而經過臭氧處理后，花生蛋白的CD光譜強度呈現隨處理時間延長而逐漸降低趨勢，正峰波長隨處理時間延長而發生藍移，負峰波長則發生紅移現象。由此推測，臭氧可誘導花生蛋白二級結構的變化，有序的蛋白結構逐漸失穩轉向不規則的二級結構。從表3也可以看出，臭氧處理導致花生蛋白中α-螺旋、β-折疊以及β-轉角結構的比例明顯減少，隨處理時間延長而逐漸下降，相反地，無規則卷曲結構所占比例呈現顯著上升趨勢。這說明臭氧可導致花生蛋白結構的部分展開或者發生蛋白聚集，從而使其嚴謹有序的二級結構趨于松散[33, 34]。此外，臭氧處理后蛋白二級結構的變化也可能與二硫鍵共價聚集有關，從而導致蛋白發生部分聚集，這與圖1的結果相一致。

圖4 臭氧處理前后花生蛋白的圓二色譜圖

表3 臭氧處理前后花生蛋白的二級結構組成

2.7 臭氧處理花生蛋白的電泳分析

臭氧處理不同時間條件下花生蛋白的非還原和β-巰基乙醇還原型SDS-PAGE結果如圖5所示。由圖5a可以看出，大分子蛋白條帶(>250 ku)發生明顯遷移現象，隨臭氧處理時間的延長，該條帶亮度逐漸增加且上移。推測原因是臭氧處理使蛋白分子間的二硫鍵發生一定程度的聚集和交聯，形成新的大分子蛋白聚集體[24, 35]，這與二硫鍵含量隨臭氧處理時間延長而增加的結果(圖1)相符。而由圖5b可知，>250 ku條帶和花生球蛋白II亞基(61 ku)條帶并未發生遷移但顏色明顯變淺甚至消失，這可能是因為在還原態電泳中，β-巰基乙醇的加入打斷了大分子蛋白聚集體中的二硫鍵。相比于非還原態電泳，經β-巰基乙醇處理后的花生球蛋白(40.5、37.5、35.5、23.5 ku)和伴花生球蛋白I亞基(18.0、17.0、15.5 ku)條帶明顯變粗變亮，但臭氧處理的影響效果甚微。由此可知，臭氧處理可誘導花生蛋白中二硫鍵發生一定程度的交聯和聚集，其處理時間與聚集程度呈正相關，進而在一定程度上改變了蛋白結構。

圖5 臭氧處理前后花生蛋白的SDS-PAGE電泳圖

3 結論

本研究借助氨基酸分析、圓二色譜、SDS-PAGE等技術深入表征臭氧處理對花生蛋白結構特性的影響。研究發現，臭氧處理可顯著降低苯丙氨酸和含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)含量，且其含量隨處理時間延長而逐漸下降。相似地，隨著臭氧處理時間的增加，花生蛋白的巰基含量顯著下降，而二硫鍵以及羰基含量則呈上升趨勢，這可能與臭氧促進蛋白質氧化有關。此外，臭氧處理有助于提升花生蛋白的熱穩定性，其變性溫度和吸熱焓隨臭氧處理時間(0～10 min)延長而增加，表面疏水性總體則呈下降趨勢。有趣地是，臭氧作用可誘導花生蛋白中α-螺旋、β-折疊以及β-轉角結構比例的下降，而無規則卷曲結構則呈現顯著上升趨勢，說明臭氧處理可導致蛋白質的二級結構發生明顯變化。SDS-PAGE電泳結果也表明，臭氧氧化可誘導花生蛋白中二硫鍵發生部分交聯和聚集，產生大分子蛋白聚集體(>250 ku)。綜合而言，臭氧主要通過作用于分子內的巰基和二硫鍵而改變花生蛋白的結構特性。