濕法糖基化處理大豆11S蛋白后的表面活性變化

杜沁嶺 周思懿 吳岱澤 張效銘 王 珮 楊文鈺 張 清

(四川農業大學食品學院1，雅安 625014) (四川省作物帶狀復合種植工程技術研究中心2，成都 611130)

大豆11S蛋白是大豆蛋白的主要儲藏蛋白之一，約占大豆蛋白總量的31%[1]，與大豆蛋白的功能性質密切相關[2]。大豆11S蛋白具有水合性質、乳化性、持水持油性等表面活性，同時還具有可降解性，是一種環境友好的天然可再生資源。然而，由于提取的大豆 11S 蛋白具有緊密的分子結構，多數基團被包裹在分子內部，導致其本身表面活性較差，在食品中的應用受到限制[3]。所以，為了改良大豆11S蛋白的表面活性，需要對其進行改性處理。

糖基化改性具有反應過程溫和、改性蛋白性質穩定和無有毒有害試劑添加等優點，常被選為大豆蛋白的理想改性方法[4]。大豆蛋白的糖基化改性已有廣泛研究，潘男等[5]、Lu等[6]和Seo等[7]分別研究了大豆蛋白與不同種類多糖發生糖基化反應后凝膠性、溶解性、乳化性等功能性質的改善情況。另外，前人也對大豆11S蛋白的二級結構、表面疏水性[8]、熱處理凝膠性[9]進行了研究。而對于大豆11S蛋白與多糖發生糖基化反應改性后表面活性變化的研究卻鮮有報道。

本研究以3種不同分子質量大小(4、10、70 ku)的葡聚糖對大豆11S蛋白進行濕法糖基化反應，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和熒光光譜測定其反應發生程度，對大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物的表面疏水性、Zeta電位、溶解性(不同pH條件下)、乳化性、持水持油性進行測定，從結構特征和功能性質兩方面分析糖基化反應后表面活性變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(合豐57)，葡聚糖(4、10、70 ku)；Lowry法蛋白質含量測定試劑盒，8-苯胺萘磺-1-酸鹽(ANS)，大豆油，其他化學試劑均為分析純級。

1.2 主要儀器與設備

高速粉碎機(CS-700)，臺式恒溫振蕩器(150638)，高速剪切均質機(AD500S-H)，冷凍干燥機(FD-1A-50)，冷凍離心機(Micro17)，紫外-可見分光光度計(UV-6)，熒光分光光度計(Thermo scientific R)，Zeta電位儀(Nano ZS)。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆11S蛋白的提取

大豆經粉碎機粉碎1 min過80目篩后置于錐形瓶中，與乙醚(1∶8)混勻后振蕩4 h(25 ℃，110 r/min)；靜置15 min，待料液分層后棄去上層溶劑，將下層脫脂大豆粉置于通風櫥中風干[9]后分散在0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液中(1∶10)，在45 ℃、pH 8.5的條件下磁力攪拌1 h后離心(4 ℃，8 500 r/min，20 min)。向上清液中加入NaHSO3使其濃度為0.01 mol/L，調節pH至6.4；于4 ℃冰箱過夜后再離心(4 ℃，6 500 r/min，20 min)，沉淀部分即為11S蛋白[10]。通過SDS-PAGE對提取樣品進行鑒定。

1.3.2 大豆11S蛋白濕法糖基化處理

將大豆11S蛋白配成5 mg/mL的蛋白溶液，再加入等質量的葡聚糖，混勻后密封放置在80℃的恒溫水浴鍋中進行糖基化反應，分別反應1、2、3、4、5 h后取出樣品，迅速放入冰水浴中終止反應，得到大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物。將樣品冷凍干燥后置于4 ℃條件下保存備用。

1.3.3 SDS-PAGE測定

分離膠、濃縮膠濃度分別為13%、5%，樣品質量濃度為2 mg/mL，上樣量為10 μL，凝膠電泳于恒定電壓下進行(120 V)。電泳后用考馬斯亮藍R-250染色，脫色完成后，對凝膠拍照并進行分析[11]。

1.3.4 內源熒光光譜測定

樣品分散在10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)中，濃度為0.15 mg/mL，設置激發波長為290 nm(狹縫寬度5 nm)，以20 nm/s的速率在300～510 nm內掃描，測定熒光強度[12]。

1.3.5 表面疏水性測定

將糖基化蛋白樣品分散于蒸餾水中制成蛋白濃度1 mg/mL的溶液，充分攪拌后離心(4 ℃，10 220r/min，20 min)，取上清液4 mL，加入8 mmol/L的ANS溶液40 μL，充分振蕩混勻后靜置3 min，測定樣品的熒光強度(FI)。設置激發波長為365 nm(狹縫寬度5 nm)，以20 nm/s的速率在400～600 nm范圍內掃描，測定熒光強度。以掃描范圍內最大熒光強度值作為蛋白質的表面疏水性(H0)[13]。

1.3.6 Zeta電位測定

配制0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)，脫氣后，再加入糖基化產物充分溶解至蛋白質量分數為0.2%，測定zeta電位，測定溫度為25 ℃，重復測定3次以上，取平均值[14]。

1.3.7 不同pH條件下溶解性測定

將10 mg糖基化蛋白樣品分散于10 mL蒸餾水中，混勻后用0.05 mol/L乙酸溶液、0.05 mol/L磷酸鹽溶液、0.05 mol/L Tris溶液分別調節溶液pH至pH=3、4和5；pH=6、7和8；pH=9。配置好后離心(4 ℃，10 220 r/min，20 min)，采用Lowry法測定上清液中蛋白質含量，以0.5 mg/mL牛血清白蛋白為標準物制作標準曲線(標準曲線方程為：y=47.509x+0.066 1，R2=0.998 2)。蛋白質溶解度表示為上清液中蛋白質量與樣品中總蛋白質量的比值[15]。

(1)

式中：m1為上清液中蛋白質量；m0為樣品中總蛋白質量。

1.3.8 乳化活性(EA)及乳化穩定性(ES)測定

將糖基化蛋白樣品分散于pH=6.5、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中制成蛋白濃度為1 mg/mL溶液，按體積比4∶1加入大豆油，于2 000 r/min下高速勻漿1 min，立即或10 min后從距燒杯底部0.5 cm處取勻漿液100 μL加入到10 mL 0.1%的SDS溶液中，振蕩混勻后用紫外分光光度計在500 nm波長處測定吸光度，記作A0或A10。以0.1%的SDS溶液作空白對照。蛋白溶液的EA和ES，分別用式(2)、式(3)計算[16]。

(2)

(3)

式中：c為蛋白質質量濃度/g/mL；φ為油相所占體積分數(φ=0.25)；A10為靜置10 min時乳狀液的吸光值；A0為靜置0 min時乳狀液的吸光值。

1.3.9 持水性(WRC)及持油性(ORC)測定

將50 mg(m0)糖基化蛋白樣品分散于10 mL蒸餾水中，室溫下水合18 h后離心(4 ℃，10 000r/min，20 min)，棄去上清液，記錄沉淀質量m1，再將沉淀在60 ℃下干燥至恒重，記錄質量m2。在相同操作步驟下，用大豆油代替蒸餾水即為持油性測定方法。按照式(4)計算 WRC或ORC[17]。

(4)

1.4 統計分析

每個樣品重復3次實驗；采用差異顯著性分析處理數據，并由SPSS V17.0軟件完成，P<0.05為顯著性差異；采用Origin9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 大豆11S蛋白濕法糖基化反應程度分析

2.1.1 SDS-PAGE電泳圖譜分析

如圖1所示，與marker相比，泳道1中11S蛋白條帶顏色明顯，其余條帶顏色較淺，有少量雜蛋白殘余。目前鮮見研究能提取出純凈的11S蛋白，這說明本實驗從大豆蛋白中提取出的11S蛋白可作為樣品使用。對比泳道1～6，大豆11S蛋白與不同分子質量葡聚糖在發生糖基化反應后，酸性和堿性亞基條帶顏色隨反應時間延長而逐漸變淺，4 h最淺。考馬斯亮蘭作為染料常與蛋白質中的自由氨基結合而呈現顏色，因此條帶顏色變淺可以間接證明自由氨基減少[18]，這表明大豆11S蛋白的氨基與葡聚糖的羰基發生共價結合即發生了糖基化反應且在4 h時反應程度最大。泳道2～6在分離膠頂部出現新的化合物條帶，這是因為糖基化反應生成了大分子聚合物，即為蛋白-多糖軛合物，由于其分子質量較大，不能穿過凝膠網絡而堆積在凝膠頂部。因此本實驗中大豆11S蛋白發生了糖基化反應并產生了大分子物質。該結果與章鼎敏等[19]的分析相似。

注：M為標準分子質量蛋白；1為大豆11S蛋白；2～6分別代表反應1、2、3、4、5 h大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物。圖1 大豆11S蛋白分別與4、10、70 ku 葡聚糖發生糖基化反應電泳圖

2.1.2 熒光光譜分析

熒光光譜技術的應用能夠較為靈敏的反應蛋白質三級結構的變化。如圖2所示，大豆11S蛋白與不同分子質量葡聚糖發生糖基化反應后生成軛合物的最大熒光強度值與未處理的大豆11S蛋白相比發生了不同程度的下降，說明糖基化反應影響了蛋白質的三級結構。葡聚糖多糖鏈與蛋白質的色氨酸殘基結合后，對色氨酸殘基產生屏蔽作用，其被包圍在疏水環境中使蛋白具有更加緊密的三級結構[12]，從而導致軛合物最大熒光強度的不斷下降。如圖2a和圖2b，大豆11S蛋白與4、10 ku葡聚糖反應后最大熒光強度值在4 h最低；如圖2c，大豆11S蛋白與70 ku葡聚糖反應后最大熒光強度值在3 h最低，這說明反應3～4 h時對色氨酸的屏蔽作用最強。但在糖基化反應后期4～5 h時，最大熒光強度卻出現上升狀態，這可能是因為葡聚糖與大豆11S蛋白的進一步緊密結合，蛋白質色氨酸殘基之間相互接近其芳香族部位通過疏水相互作用形成復合物，這種復合物會導致最大熒光強度的峰值再次上升[20]。熒光光譜圖中最大熒光強度的變化證明了大豆11S蛋白發生了糖基化反應且該反應對蛋白結構造成一定影響。

圖2 大豆11S蛋白分別與4、7、10 ku 葡聚糖發生糖基化反應后熒光強度變化

2.2 大豆11S蛋白濕法糖基化反應后蛋白結構分析

2.2.1 表面疏水性分析

蛋白質表面疏水性的強弱與蛋白質表面的疏水基團的變化情況密切相關，通過分析表面疏水性變化可以反映糖基化反應后蛋白結構的變化[21]。如圖3，改性后的大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物表面疏水性低于改性前，并隨著反應時間的延長呈現出先增加后降低的輕微波動趨勢。該波動趨勢可能受兩方面因素影響，一方面由于蛋白質與葡聚糖結合后，葡聚糖相應的糖鏈部分可能會包裹或覆蓋位于蛋白質外層疏水性基團，多糖鏈的遮蔽作用使熒光探針難以與蛋白質分子內部的疏水基團結合[12]，從而使得疏水性下降；另一方面隨著糖基化反應程度加深，和蛋白質結合的葡聚糖也會攜帶部分疏水基團，并隨著糖基化反應遷移到蛋白表面[22]，從而提高疏水性。兩方面因素的共同作用使得糖基化反應后疏水性發生不同程度的改變，但是總體呈現降低趨勢。通過比較不同分子質量軛合物表面疏水性變化趨勢及峰值點，低分子質量葡聚糖(4、10 ku)糖基化反應程度最大，表面疏水性下降最明顯。

注：不同大小寫字母，標“*”字母分別表示大豆11S蛋白～4 ku葡聚糖軛合物、大豆11S蛋白～10 ku葡聚糖軛合物、大豆11S蛋白～70 ku葡聚糖軛合物之間的顯著性差異(P<0.05)。余同。圖3 大豆11S蛋白糖基化反應后表面疏水性變化

2.2.2 Zeta電位分析

Zeta電位是表征溶液膠體穩定性和蛋白質帶電荷情況的重要參數。如圖4，在中性條件下，大豆11S蛋白和大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物Zeta電位值均為負值，且軛合物Zeta電位絕對值大部分低于改性前，大豆11S蛋白表面有帶負電荷的羧基基團，葡聚糖不帶電荷，二者結合后仍帶負電。同時，葡聚糖親水性糖鏈與大豆11S蛋白發生共價結合后，對蛋白質表面電荷產生屏蔽作用[23]，導致Zeta電位絕對值下降。溶液中單個軛合物分子和可溶性的蛋白大粒徑聚集物同時存在，可能是Zeta電位呈現出波動變化的原因[24]。Zeta電位與表面疏水性變化趨勢相似，與齊寶坤等[14]的研究結果一致。軛合物Zeta電位絕對值下降可能受到蛋白質和多糖種類的影響[25]，大豆11S蛋白含有較多的含硫氨基酸，凝膠性好且結構不易被破壞[26]；葡聚糖的存在能夠更好地保護蛋白結構，使得蛋白處于一種相對緊湊的狀態[27]，兩方面因素可能導致蛋白表面帶電基團被遮蔽，內部帶電基團不易暴露，Zeta電位下降。

圖4 大豆11S蛋白糖基化反應后Zata電位變化

2.3 大豆11S蛋白濕法糖基化反應后理化性質分析

2.3.1 不同pH條件下溶解性分析

圖5為反應4 h后溶解度的變化，其余反應時間的變化與之相似。在不同的反應時間條件下，在pH 3～9的范圍內，大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物的溶解度隨著pH的增加表現出先降低后增加的趨勢，在pH=5時，溶解度最小。在所有反應時間下，大豆11S蛋白與不同分子質量的葡聚糖結合后生成的軛合物的溶解度均表現出不同程度的降低，且隨著分子質量增大，溶解度降低程度增加，這可能是由于糖基化反應程度加深，親水性糖殘基附著引起蛋白形成更加致密的結構，蛋白質內部基團不易暴露[28]，溶解度降低。但在等電點附近(pH=5～6)，大豆11S蛋白-葡聚糖(4、10 ku)軛合物溶解度高于未反應大豆11S蛋白，這可能是由于大豆11S蛋白在等電點附近因疏水相互作用而形成結構緊密的聚集體，阻礙了葡聚糖的進一步結合，同時已經結合在蛋白表面的多糖產生位阻效應以防止大豆11S蛋白進一步聚集而提高溶解性[29]。Xu等[30]也發現葡聚糖與肌原纖維蛋白濕法糖基化反應后軛合物在等電點附近溶解性顯著提高。在非等電點環境中，大豆11S蛋白結構容易受到pH的影響發生破壞，蛋白結構展開，體現出較好的溶解性，對其進行糖基化反應反而會生成不溶性大分子產生不利影響。低分子質量的葡聚糖形成的軛合物在堿性條件下比高分子質量葡聚糖形成的軛合物具有更高的溶解性，這可能是由于低分子質量多糖的空間位阻更小，更容易靠近蛋白質的氨基，糖基化反應的程度更大[31]。

大豆11S蛋白結構緊密，粒徑分布大于100 nm，溶解性較差[9]；葡聚糖具有良好的水溶性，但其糖基化修飾改善溶解度的效果不如葡萄糖、乳糖[32]。因此在對大豆11S蛋白進行改性的過程中，應選擇能夠提供更多羥基基團的糖，同時輔以一些其他手段(如：酶解、超聲等)進一步破壞大豆11S蛋白的結構，對溶解性的改善會更加明顯。

圖5 大豆11S蛋白糖基化反應4 h后在不同pH 條件下溶解度變化

2.3.2 乳化活性(EA)及乳化穩定性(ES)分析

如圖6所示，改性后的大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物EA明顯低于改性前，EA隨反應時間的變化趨勢不明顯，這可能是由于糖基化反應引入了更多的親水性糖殘基，破壞了水油界面平衡[33]，導致EA下降。大豆11S蛋白-4 ku葡聚糖軛合物EA最低，大豆11S蛋白-10 ku葡聚糖軛合物EA最高，這可能是受引入親水糖鏈和糖鏈所帶來的空間位阻的影響，低分子質量葡聚糖引入糖鏈多，降低EA；高分子質量葡聚糖糖鏈產生空間位阻大，提高EA。Dickinson等[34]和江連洲等[35]發現EA與表面疏水性、Zeta電位呈正相關，與本文結果相似。

改性后的大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物ES明顯高于改性前，ES隨反應時間延長呈現出先增加后減小的趨勢，3種軛合物都在反應4 h時，ES達到最大值。EA降低，反而導致ES上升，這意味著除了糖基化所帶來的對油水界面破壞外，ES更多受放置后油水界面形成的保護膜穩定性影響，隨著糖基化反應時間延長軛合物在形成乳狀液的過程中與油滴的起始界面相應變小，但接觸面一旦形成后，在隨后放置的過程中油水界面形成的保護膜反而更加穩定[36]，ES上升。而當反應進行到后期時，所形成的產物(褐變產物)會導致溶液絮凝和聚集，對ES產生了不利的影響[37]。

因此，不同分子質量葡聚糖糖基化反應改性大豆11S蛋白后對EA的影響是不利的，但對ES的影響是有利的，為了獲得更好的ES，低分子質量(4 ku)葡聚糖、反應時間4 h是理想的改性條件。

圖6 大豆11S蛋白糖基化反應后乳化性和乳化穩定性變化

2.3.3 持水性(WRC)及持油性(ORC)分析

如圖7，改性后的大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物WRC均上升，ORC均下降。這可能是因為濕法糖基化反應更加充分，增大了蛋白質、糖與水分子的接觸面積，由于糖基化反應中大豆11S蛋白的表面疏水性基團可能與葡聚糖糖鏈結合，使其喪失在原有體系中相關疏水性的表達，疏水基團不易暴露，因此WRC上升，ORC下降[38，39]。但隨著糖基化反應的不斷進行，對蛋白結構的破壞也使得疏水基團暴露，因此WRC也會出現下降趨勢，ORC出現上升趨勢。兩方面因素的共同作用導致WRC和ORC發生不斷地波動，這與表面疏水性的波動變化一致。大豆11S蛋白-70 ku葡聚糖軛合物由于參與反應葡聚糖分子質量較大，糖基化反應速率較慢，WRC和ORC波動并不明顯。總體而言，濕法糖基化反應能夠有效改善大豆11S蛋白的WRC，抑制ORC，低分子質量(4和10 ku)的葡聚糖對WRC的提高作用和對持油性的降低作用更明顯。

圖7 大豆11S蛋白糖基化反應后持水性和持油性變化

3 結論

大豆11S蛋白與不同分子質量(4、10、70 ku)的葡聚糖在濕法條件下發生了糖基化反應，通過SDS-PAGE和熒光光譜分析證實了大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物的形成，同時也表明糖基化反應程度隨時間延長逐漸加深，4 h是理想的改性時間。糖基化反應過程中親水性糖鏈的附著使得大豆11S蛋白結構更加致密，破壞水油界面平衡，內部基團不易暴露，因此大豆11S蛋白-葡聚糖軛合物與未處理的大豆11S蛋白相比表面疏水性、Zeta電位值、ORC、EA和在非等電點處(pH=3.0～4.0，7.0～9.0)溶解性均下降，WRC上升；而在等電點附近(pH=5.0～6.0)大豆11S蛋白易形成聚集物會阻礙葡聚糖進一步結合，同時已結合的葡聚糖產生空間位阻效應使得軛合物溶解性增加，ES的上升主要與放置后油水界面形成的保護膜的穩定性有關。另外，低分子質量葡聚糖對大豆11S蛋白濕法糖基化改性程度最大，對功能性質的影響更明顯。由于大豆11S蛋白結構緊密，糖基化修飾對增強大豆11S蛋白表面活性的效果有限，為了獲得更加理想的表面活性，選擇一些輔助手段對大豆11S蛋白結構進行破壞、暴露更多內部基團以獲得更好的糖基化效果是未來研究趨勢。