催化大豆油脫臭餾出物甲酯化的脂肪酶固定化研究

錢俊青 李新晨 鄢洪德 周文武

(浙江工業(yè)大學藥學院1，杭州 310014) (浙江工業(yè)大學生物工程學院2，杭州 310014)

大豆油脫臭餾出物中含有VE、甾醇、游離脂肪酸，VE可清除體內(nèi)自由基，具有優(yōu)異的抗氧化作用，同時亦有提高受孕率及免疫力的功效，因而在食品、藥品、化妝品中廣泛應(yīng)用[1]。

與大豆油脫臭餾出物化學法提取VE相比較，脂肪酶催化大豆油脫臭餾出物酯化，蒸餾提純VE的技術(shù)綠色安全，對環(huán)境影響小，具有理想的應(yīng)用前景。大豆油脫臭餾出物游離脂肪酸酶法酯化，可蒸餾分離脂肪酸酯，而甾醇與VE的凝固點相差100 ℃左右，采用冷卻結(jié)晶將兩者分離。因此，脂肪酸酯化率高，蒸餾分離效果就好，冷卻結(jié)晶得到的VE純度與回收率就理想。

根據(jù)已有關(guān)于脂肪酶催化大豆油脫臭餾出物脂肪酸酯化提取VE的研究，大豆油脫臭餾出物脂肪酸的酯化率是技術(shù)的關(guān)鍵，酯化率達到80%時，提取VE的回收率近90%，純度達65%以上[2-5]。而邵平等[6]報道酶法酯化菜籽油脫臭餾出物提取VE工藝，酯化率55%，提取的VE純度僅為25.2%。Facioli等[7]以固定化脂肪酶催化脂肪酸甲酯化，酯化率為88%，大豆油脫臭餾出物中VE的回收率達98%，純度為85%，提取效果突出。

與游離酶相比，固定化脂肪酶催化大豆油脫臭餾出物中脂肪酸酯化效率更高，固定化酶可重復(fù)利用，更加綠色經(jīng)濟。有研究采用固定化Novozym435脂肪酶催化大豆油脫臭餾出物脂肪酸甲酯化，作為提取VE的預(yù)處理，取得了良好的酯化效果[8-11]。但目前國內(nèi)外開展的酶法酯化預(yù)處理提取VE的研究，基本采用通用的固定化脂肪酶，針對催化大豆油脫臭餾出物酯化的脂肪酶固定化，研究報道甚少。已報道的為減少甾醇酯化并提高脂肪酸甲酯化，需在反應(yīng)體系加少量水[12,13]。而脂肪酶具有酯化與水解雙重催化性能，因而，針對大豆油脫臭餾出物酯化預(yù)處理的脂肪酶固定化，需提高酶的酯化活力而降低其水解活力。

凝膠包埋固定化酶方法和樹脂吸附固定化酶方法均提高了酶的穩(wěn)定性與耐受性[14-17]。與包埋法比較，樹脂吸附的固定化酶酶穩(wěn)定性更好[18]。而固定化載體的吸附作用影響酶蛋白空間結(jié)構(gòu)，一定程度改變其催化性能[19]。

我國大豆油脫臭餾出物產(chǎn)量大，提取利用其中的VE具有理想的效益。以酶法酯化脂肪酸提取VE綠色安全，因此采用國產(chǎn)材料開展針對大豆油脫臭餾出物酯化預(yù)處理的脂肪酶固定化研究，具有良好的應(yīng)用前景。為此，本實驗研究了國產(chǎn)大孔樹脂吸附固定化黑曲霉脂肪酶，根據(jù)大豆油脫臭餾出物中脂肪酸甲酯化的要求開展了酶固定化條件的研究，采用單因素條件實驗和Plackett-Burman實驗及曲面響應(yīng)分析法優(yōu)化了酶固定化條件，為國產(chǎn)樹脂固定化脂肪酶應(yīng)用于大豆油脫臭餾出物提取VE的預(yù)處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉脂肪酶，5 000 U/g；大豆油脫臭餾出物 (酸值75.03 mgKOH/g)；大孔樹脂AB-8、D101和NKA-9；橄欖油為化學純，其他試劑均為分析純。

1.2 固定化脂肪酶的制備方法

在緩沖液中固定化脂肪酶：稱取酶粉，用 pH 8.0 的 0.1 mol/L Tris-鹽酸緩沖液配成10 mg/mL 的酶溶液。在裝有0.50 g 大孔樹脂的25 mL具塞三角瓶中加入 5.0 mL酶液，在20 ℃水浴搖床中120 r/min振蕩2 h，抽濾，用緩沖液淋洗，40 ℃干燥，得固定化酶。

在有機相中固定化脂肪酶：稱取50 mg脂肪酶、0.50 g大孔樹脂與5.0 mL正己烷振蕩混合均勻，在20 ℃水浴搖床中120 r/min振蕩2 h。抽濾，用正己烷淋洗，40 ℃干燥，得固定化酶。

在緩沖液和有機溶劑兩相中固定化脂肪酶：稱取50 mg脂肪酶、0.50 g大孔樹脂與5.0 mL緩沖液和有機溶劑混合液振蕩混合均勻，在20 ℃水浴搖床中120 r/min振蕩2 h。抽濾，用有機溶劑淋洗，40 ℃干燥，得固定化酶。

所制備的固定化酶進行催化大豆油脫臭餾出物脂肪酸甲酯化實驗，計算酸值降低率，并檢測水解酶活回收率。以酸值降低率為主要考察指標，評價水解酶活的變化，確定脂肪酶固定化載體與介質(zhì)。

在確定脂肪酶固定化載體與介質(zhì)后，以固定化酶的酶活為指標，優(yōu)化酶固定化條件。優(yōu)化得到的固定化酶通過催化大豆油脫臭餾出物脂肪酸甲酯化檢驗其性能。

1.3 脂肪酶催化大豆油脫臭餾出物脂肪酸甲酯化實驗方法

根據(jù)游離酶催化大豆油脫臭餾出物中脂肪酸甲酯化方法[20]，將3.0 g大豆油脫臭餾出物加入25 mL的帶塞磨口錐形瓶中，添加脫臭餾出物量15%的Tris-鹽酸緩沖液0.45 mL，甲醇量為3倍游離脂肪酸 (mol∶mol)，30 ℃恒溫預(yù)熱并搖勻。然后加入0.4 g固定化酶或60 mg游離酶，充分混合。將錐形瓶置于30 ℃和200 r/min的恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)12 h。每組做平行樣，反應(yīng)結(jié)束靜置油水兩相分層，取上層油相，精確稱取1.00 g，測定酸值。以酸值降低率作為酶催化酯化效果的指標，計算游離脂肪酸酯化率[7,9]。

酸值降低率 = (脫臭餾出物的最初酸值-反應(yīng)結(jié)束時酸值)/脫臭餾出物的最初酸值×100%

1.4 分析方法

1.4.1 酸值測定

參照GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》。

1.4.2 脂肪酶水解活力測定

參照GB/T 23535—2009橄欖油乳化法測定脂肪酶水解活力。

水解酶活回收率=固定化酶總活力/(加入酶液總活力-殘液總酶活力) ×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化酶載體及介質(zhì)的選擇

2.1.1 緩沖液中固定化脂肪酶選擇載體

固定化載體的性質(zhì)對固定化酶性能而言至關(guān)重要[21]，由表1可知，從大豆油脫臭餾出物酸值降低率，非極性系列樹脂固定化酶的效果較理想。弱極性或非極性樹脂與極性較低的脫臭餾出物相容性較好，酶分子與底物的作用較強，顯示較高的酯化能力。同時，不同性能的樹脂固定化脂肪酶的水解酶活有較大差異，表明樹脂的吸附作用影響酶的催化性能。與文獻報道的樹脂固定化酶提高了酶催化選擇性相似[22]。

表1 不同樹脂固定化脂肪酶的效果

根據(jù)大豆油脫臭餾出物酯化預(yù)處理的要求，選擇脂肪酶固定化后酯化能力強而水解能力減弱的樹脂載體，AB-8樹脂與X-5樹脂比較理想。而實驗中X-5樹脂固定化酶易脫落，不利于重復(fù)使用，因而，選擇AB-8樹脂為脂肪酶固定化載體。

固定化條件：0.5 g AB-8樹脂，50 mg脂肪酶，5 mL Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.4)，20 ℃，在120 r/min水浴搖床中振蕩2 h。

2.1.2 有機相及緩沖液/有機相兩相固定化脂肪酶的介質(zhì)選擇

由表2實驗結(jié)果可知，溶劑疏水性越大，固定化酶催化甲酯化效果越好，可選擇正己烷作為酶固定化的有機溶劑。而表3實驗結(jié)果表明，緩沖液占比越大，固定化酶酯化效果越好，且緩沖液更利于環(huán)保和后續(xù)處理，故選擇緩沖液作為酶固定化介質(zhì)。

表2 不同有機溶劑中脂肪酶固定化效果影響

表3 不同比例水/有機兩相中脂肪酶固定化效果影響

圖1 固定化時間、pH、酶量、溫度和 振蕩速率對固定化酶活性的影響

2.2 脂肪酶固定化單因素實驗

2.2.1 固定化時間對酶固定化效果的影響

如圖1實驗結(jié)果所示，在1 g AB-8樹脂，5 mL、pH 7.5的10 mg/mL的酶溶液，20 ℃水浴搖床120 r/min振蕩吸附的條件下，固定化酶活力吸附3 h后增幅放緩，4 h后下降，所以選擇3 h為固定化時間。姜峻穎等[23]在探究固定時間對脂肪酶影響時有類似現(xiàn)象，8 h達到最大酶活。本方法較短時間達到最大固定化酶活，可能AB-8樹脂的吸附速率較快。

2.2.2 緩沖溶液pH值對酶固定化的影響

脂肪酶在固定化緩沖液中的表面離子狀態(tài)可以在有機溶劑中維持,即酶表現(xiàn)出“記憶”效應(yīng)[24]。從圖1實驗結(jié)果可知，當固定化條件為條件為1 g AB-8樹脂，5 mL、5 mg/mL的酶溶液，20 ℃水浴搖床120 r/min振蕩吸附3 h時，在pH 7.4的條件下固定所得酶的酯化活力最高。Wan等[25]以磺化大孔樹脂固定脂肪酶在中性pH達到最大酶活，與本實驗相似。

2.2.3 酶量對酶固定化的影響

圖1表明，在1g AB-8樹脂，5 mL、pH 7.4緩沖液，20 ℃水浴搖床120 r/min振蕩吸附3 h的條件下，酶量為50 mg/g樹脂時，固定化酶活最高。Yan等[26]在使用陽離子交換樹脂D152H固定脂肪酶，酶量為20 mg/g樹脂達到最大酶活，本方法選擇的AB-8樹脂固定化酶效果更好。

2.2.4 溫度對酶固定化的影響

不同溫度固定化酶的實驗結(jié)果見圖1，當固定化條件為1 g AB-8樹脂，5 mL、pH 7.4的10 mg/mL的酶溶液，水浴搖床120 r/min振蕩吸附3 h時，溫度高于25 ℃，固定化酶的活力下降。因此，酶固定化溫度控制在25 ℃。劉自琴等[27]研究報道30 ℃達到最大固定化酶活，再升高溫度酶活下降。與本實驗25 ℃固定脂肪酶酶活較高相似。

2.2.5 振蕩速率對酶固定化的影響

振蕩速率會影響酶分子在樹脂間的傳遞速率及固定化效率，由圖1可知，在1 g AB-8樹脂，5 mL、pH 7.4的10 mg/mL的酶溶液，25 ℃水浴搖床振蕩吸附3 h條件下，最佳振蕩速率為150 r/min,固定化酶活達111.0 U/g。

2.3 Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果[28]

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，用Plackett-Burman實驗設(shè)計確定對固定化酶酶活影響顯著的因素，實驗結(jié)果如表4所示。實驗結(jié)果采用Design Expert 7.1軟件進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果如表5所示，得到緩沖液pH、固定化溫度和時間是3個最顯著的因素 (P<0.1)。

表4 脂肪酶固定化的Plackett-Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)值

表5 Plackett-Burman 實驗設(shè)計各因素、水平及顯著性檢驗

2.4 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果分析[28]

2.4.1 模型方程的建立與顯著性檢驗

采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計法，對影響固定化酶酶活的顯著因素進行優(yōu)化，以獲得最佳條件及操作水平范圍。實驗輔助軟件為Design Expert 7.1。

根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果,以固定化酶活為響應(yīng)值，設(shè)為Y，以影響顯著的外界因子：緩沖液pH值、固定化溫度和時間為自變量，分別以X1、X2、X3代表，按方程xi=(Xi-X0)/ΔX對自變量進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長。因子編碼及各自變量水平見表6。

表6 Box-Behnken實驗設(shè)計因素水平及編碼

編碼值與真實值的關(guān)系為：x1= (X1-7.4)/0.4;x2= (X2-25)/5;x3=(X3-3)/1

設(shè)該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為：

(1)

式中：Y為預(yù)測響應(yīng)值；β0為常數(shù)項；βi為線性系數(shù)；Βij為交互項系數(shù)；Βii為二次項系數(shù)。

為了求得此方程的各項系數(shù)，需17組實驗來求解，實驗設(shè)計見表7。對于影響不顯著的其他工藝參數(shù)，選定在單因素實驗的最適水平，即酶量為50 mg/g，振蕩速率為150 r/min。

根據(jù)表7的實驗結(jié)果，采用逐步回歸的方法進行多元回歸擬合，得到固定化酶活對編碼自變量pH值、固定化溫度和固定化時間的二次多元回歸方程式：

(2)

表7 Box-Behnken 實驗設(shè)計及響應(yīng)值的實測值

表8 二次多項模型方差分析表

2.4.2 固定化酶條件的響應(yīng)面分析

通過對方程(2)進行響應(yīng)面分析發(fā)現(xiàn)，pH值和溫度對固定化酶活的交互影響不顯著，而當時間在3 h時，高酶活在pH(7.2～7.5)和23～27 ℃時得到。pH和固定化時間對固定化酶活的交互影響較顯著，而當溫度為25 ℃時，高酶活在pH7.2～pH7.5和2.5～4 h獲得。固定化溫度和時間對固定化酶活的影響也較顯著，而當pH為7.4時，高酶活則在22～27 ℃和2.5～4 h獲得。Li等[28]在探究吸附時間和pH以及酶量之間的交互影響時也得到類似結(jié)論。

2.4.3 模型驗證實驗

對回歸方程求一階偏導，解得X1=7.32、X2=24.9、X3=3.86和Y=112.38，即pH值、固定化溫度和時間分別為7.32、24.9 ℃和3.86 h時，固定化酶預(yù)測值為112.38 U/g。

為了驗證固定化酶活模型方程(2)的合適性和有效性，進行了最適脂肪酶固定化條件的驗證實驗。確定緩沖液pH、固定化溫度和時間分別為7.3、25 ℃和4 h，重復(fù)5次的固定化酶活平均值為112.43 U/g，實驗值與預(yù)測值吻合情況良好。該模型可以用于預(yù)測脂肪酶的固定化規(guī)律，證明了其合適有效性。

2.5 固定化脂肪酶應(yīng)用于催化大豆油脫臭餾出物脂肪酸甲酯化實驗

由圖2結(jié)果可知，在大豆油脫臭餾出物加水與甲醇的酶法酯化反應(yīng)中，使酸值降低率達到80%以上，固定化酶催化水含量10%即可，但游離酶需15%以上，表明酶固定化催化性能提高。在含水的有機介質(zhì)體系中，酶的催化效果與含水量密切相關(guān)，水過少會使酶的結(jié)構(gòu)“剛性化”，催化活力發(fā)揮受影響，而水量多會影響酯化效率[29]。圖3的結(jié)果表明，固定化脂肪酶催化脂肪酸甲酯化，首次酯化酸值降低率達88.3%，連續(xù)使用3次，酸值降低率均85%以上，與游離酶相比，大幅提高了脂肪酶利用率。此外，固定化酶易分離，有利于后續(xù)VE的提取純化。

注：反應(yīng)條件為3 g大豆油脫臭餾出物(最初酸值為75.03 mg KOH/g)，pH 8.2，3倍甲醇(mol∶mol游離脂肪酸)一步添加，游離酶量為100 U/g底物，固定化酶15 U/g底物，30 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)12 h。圖2 含水量對游離酶和固定化酶催化甲酯化效果的影響

注：反應(yīng)條件為3 g大豆油脫臭餾出物(最初酸值為75.03 mg KOH/g)，pH 8.2，3倍甲醇(mol∶mol游離脂肪酸)一步添加，游離酶量為100 U/g底物，固定化酶15 U/g底物，30 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)18 h。圖3 游離酶和固定化酶催化大豆油脫臭餾出物甲酯化的操作穩(wěn)定性

3 結(jié)論

經(jīng)大豆油脫臭餾出物脂肪酸甲酯化實驗，比較水解活力的變化，選用弱極性樹脂AB-8作為載體，在緩沖液中吸附固定化脂肪酶。對脂肪酶固定化的緩沖液pH、固定化溫度、固定化時間、酶量/g樹脂和吸附振蕩速率進行了單因素實驗，在單因素實驗基礎(chǔ)上應(yīng)用Plackett-Burman實驗篩選出緩沖液pH值、固定化溫度和時間為顯著影響因素，通過響應(yīng)面法優(yōu)化，AB-8樹脂固定化脂肪酶的適宜工藝為：緩沖液pH 7.3、固定化溫度25 ℃、時間4 h、酶量50 mg/g樹脂、吸附振蕩速率150 r/min，固定化酶活力為112.4 U/g。經(jīng)催化大豆油脫臭餾出物脂肪酸甲酯化實驗，固定化酶催化性能明顯優(yōu)于游離酶，首次酯化酸值降低率達88.3%，重復(fù)利用3次，酸值降低率仍達85%以上。