奇亞籽蛋白酶解制備抗氧化肽的工藝優化

馬倩，潘夢瑩，陳秋鑾，陳雪芹，孟春，洪晶

（福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

奇亞籽，即芡歐鼠尾草的種子（Salvia hispanica L.），屬于薄荷科，原產于墨西哥中部、南部以及危地馬拉，大小類似芝麻（1 mm～2 mm），形狀呈橢圓形。奇亞籽被譽為“超級食品”，含優質蛋白質（16%～26%）、脂肪酸（30%～33%）、膳食纖維（18%～30%）、抗氧化物等多種營養成分[1]。2009年，奇亞籽作為一種新穎性食物通過歐洲理事會和歐洲議會，2014年在我國被批準為新食品原料[2]。作為一種新食品原料，奇亞籽有巨大的營養價值和治療潛力。其蛋白質含量高于其它傳統作物，如小麥、玉米、大米、燕麥等[3-4]，且不含任何有毒成分和麩質蛋白，適合于乳糜瀉患者食用[5]。在氨基酸組成方面，奇亞籽含有8種必需氨基酸和10種非必需氨基酸，評分基本符合聯合國糧農組織和世衛組織的理想氨基酸模式[6-7]。資料顯示，奇亞籽具有抗氧化、降血糖、降血壓、降血脂、抗血小板凝聚等多種保健作用[8-11]。目前，國內對奇亞籽的研究較少，主要集中于營養成分的測定和分析[7，12]；國外對奇亞籽的研究主要集中在兩個方面，一方面是直接添加至產品中，研究其加工特性[13-15]，另一方面是集中于油脂的研究[9，16]，對奇亞籽中蛋白及活性多肽的研究利用很少。

抗氧化肽是生物活性肽的一種，由二到幾十個氨基酸殘基組成，能通過清除氧自由基和羥自由基達到抗氧化的功能[17]。化學合成的抗氧化劑本身可能具有毒副作用[18]，食源抗氧化肽活性高，易被人體消化吸收，食用安全性高[19-20]，極具發展潛力。通過酶解法制備抗氧化肽條件溫和易控制，是目前國內外生產多肽的主要方法。近年來，關于植物蛋白水解物抗氧化性的研究已有許多報道，如大米蛋白[21]、高粱蛋白[22]、核桃蛋白[23]、雙孢菇蛋白[24]等，但對奇亞籽蛋白酶解產物的研究相對較少。且去油之后的奇亞籽通常被廢棄，使得其中大量的優質蛋白未能有效利用。

本文以奇亞籽為原料，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥基自由基清除率為指標，以中性蛋白酶酶解制備抗氧化肽，在單因素試驗結果的基礎上，通過響應面法對抗氧化肽制備工藝進行優化，可充分利用奇亞籽蛋白資源，開發奇亞籽的潛在價值，為奇亞籽優質蛋白及多肽的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奇亞籽：市售，經中藥粉碎機粉碎、過篩，后經石油醚脫脂干燥后制成脫脂粉，4℃儲藏備用，脫脂后蛋白含量為（31.35±0.05）%。

堿性蛋白酶（149533U/g）、中性蛋白酶（41553U/g）、胰蛋白酶（79 260 U/g）、木瓜蛋白酶（63 360 U/g）：北京諾特萊斯生物科技有限公司；DPPH：美國Sigma公司；水楊酸、過氧化氫（H2O2）：西隴化工股份有限公司；硫酸亞鐵（FeSO4）：國藥集團化學試劑有限公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

高速粉碎機（AZL-600T）：永康市艾澤拉商貿有限公司；高速冷凍離心機（Z 323K）：德國HERMLE Labortechnik GmbH；紫外分光光度計（EU 2600）：上海昂拉儀器有限公司；數顯恒溫水浴搖床（HH-4）：國華電器有限公司；pH 計（pH700）：美國 Eutech Instruments；電子天平（JA2003N）：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 奇亞籽抗氧化肽制備工藝

以堿提酸沉法提取奇亞籽蛋白，提取條件為前期優化所得。即取奇亞籽脫脂粉，按1∶40（g/mL）比例加入0.2 mol/L NaOH溶液，35℃水浴攪拌120 min，離心，上清液調pH值至3.5使蛋白沉降，離心后沉淀即為奇亞籽粗蛋白，冷凍干燥后作為酶解原料。

酶解工藝流程為：奇亞籽蛋白溶液→酶解→滅酶→離心→上清液（酶解液）。

將奇亞籽蛋白粉配成一定濃度溶液，加入一定量的酶，調pH值，恒溫水浴搖床酶解，酶解過程中每隔30min調pH值，酶解結束后于100℃水浴滅酶10 min，冷卻后于4℃下10 000 r/min離心20 min，取上清液測抗氧化活性。

1.3.2 最適酶篩選

以抗氧化活性為指標，選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶及木瓜蛋白酶，分別在其最適條件下進行酶解（表1），以選取最適酶。酶解工藝流程參照1.3.1。

表1 不同酶酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of different proteases

1.3.3 單因素試驗

采用1.3.2中選出的最適酶，以DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率為指標測定酶解物的抗氧化能力。對影響酶解產物抗氧化能力的加酶量、pH值、酶解時間、酶解溫度4個因素各設置不同水平做單因素試驗，酶解步驟按照1.3.1。

固定加酶量5 000 U/g，底物濃度0.015 g/mL，pH 7.0，酶解溫度50℃，酶解時間3 h進行試驗。各變量因素水平分別設定為加酶量（500、1 000、1 500、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g），pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃），酶解時間（2、3、4、5、6 h），各組試驗均重復 3 次，數據取平均值。

1.3.4 響應面法優化奇亞籽蛋白酶解工藝

根據單因素試驗結果，使用Design-Expert V8.0.6軟件進行Box-Behnken設計，建立三因素三水平試驗，確定奇亞籽蛋白酶解最佳工藝條件。以DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率為響應值，加酶量（A）、酶解pH值（B）、酶解時間（C）為自變量，因素水平編碼見表2。

表2 響應面試驗設計Table 2 Code and level of factors chosen

1.3.5 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率測定參照Hong Jing等[25]的測定方法稍作修改。用95%乙醇配制質量濃度為0.4%的DPPH溶液，低溫避光保存。樣品溶液與DPPH溶液按體積比1∶1混合并振蕩均勻，室溫（25℃）避光反應30 min，對照組用95%乙醇混合樣品溶液，空白組即用95%乙醇代替奇亞籽酶解液。每組3個平行，于波長517 nm處測定吸光值。DPPH自由基清除率計算公式如下。

式中：Ai為樣品組（DPPH+樣品）吸光度；Aj為對照組（95%乙醇+樣品）吸光度；A0為空白組（DPPH+95%乙醇）吸光度。

1.3.6 羥基自由基清除率

羥基自由基清除率作為奇亞籽酶解物抗氧化能力測定的另一指標，參照Zhang Yufeng等[26]的方法進行測定。配制8 mmol/L的FeSO4溶液、20 mmol/L的H2O2及3 mmol/L水楊酸。取0.335 mL樣品與0.1 mL FeSO4、0.335 mL 水楊酸及 0.08 mL H2O2混勻，37℃保溫30 min后流水冷卻。加入0.15 mL蒸餾水使反應液總體積達1 mL，5 000 g離心10 min后于510 nm波長處測定上清液吸光值，分別以蒸餾水代替樣品和H2O2溶液作為空白組和對照組。羥基自由基清除率計算公式如下。

式中：A0為空白組吸光值；As為樣品組凈吸光值。

1.4 抗氧化能力值（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）測定

抗氧化能力值測定參照Blanca Hernndez Led-esma等[27]描述的方法。采用熒光素鈉（sodium fluorescein，FL）為熒光指示劑進行測定。

1.5 數據處理

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類的篩選

不同酶對酶解物抗氧化活性的影響見圖1。

圖1 不同酶對酶解物抗氧化活性的影響Fig.1 Comparative effectiveness of 4 kinds of proteases in hydrolyzing Chia seeds

蛋白酶的特異性對水解物的生物活性有著重要的影響，由于抗氧化肽是由特定肽片段組成的，因此蛋白酶的種類及其水解能力的差異決定了多肽抗氧化活性的差異。由圖1可知，在各酶最適pH值、溫度，以及相同酶添加量、酶解時間、底物濃度條件下，測得中性蛋白酶的DPPH自由基清除率最高，為90.64%，其羥基自由基清除率為11.93%；堿性蛋白酶的羥基自由基清除率最高，為31.63%，DPPH自由基清除率為67.31%。兩者綜合下，中性蛋白酶的抗氧化活性相對較好，因此，選取中性蛋白酶進行后續酶解工藝優化。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 加酶量對酶解物抗氧化活性的影響

加酶量對酶解物抗氧化活性的影響如圖2所示。

由圖2可知，在加酶量處于500 U/g～2 000 U/g時，酶解物的DPPH自由基及羥基自由基清除率均呈現出緩慢的上升趨勢，此時蛋白酶水解蛋白質成為多肽，釋放抗氧化活性，上升趨勢緩慢可能的原因在于加酶量此時還較小，水解不完全，抗氧化活性還未完全釋放出來。當加酶量增加到3 000 U/g時，酶解物的自由基清除活性大大提高，可能是由于酶量的增加使酶與底物結合效率提高，蛋白質利用率提高，水解更充分，3 000 U/g～7 000 U/g范圍內酶與底物基本達到飽和，抗氧化活性變化趨勢平緩。因此結合經濟因素，選擇3 000 U/g為最佳加酶量。

圖2 加酶量對DPPH自由基和羥基自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on DPPH free radical scavenging rate and hydroxyl radical scavenging rate

2.2.2 酶解pH值對酶解物抗氧化活性的影響

pH值對產物抗氧化活性的影響如圖3所示。

圖3 pH值對DPPH自由基和羥基自由基清除率的影響Fig.3 Effect of pH on DPPH free radical scavenging rate and hydroxyl radical scavenging rate

DPPH自由基清除率及羥基自由基清除率在pH 7.0時均達到最大，偏離7.0時抗氧化活性均呈現下降趨勢。推測pH值對酶解產物活性的影響與蛋白酶構象、酶分子與底物分子的解離狀態有關，酶解體系環境pH值過高或過低會引起酶活力減弱甚至失活，酶與底物結合效率減弱，使得酶解效率降低[28]。因此，選擇pH 7.0為最佳pH值。

2.2.3 溫度對酶解物抗氧化活性的影響

溫度對酶解產物抗氧化活性的影響結果見圖4。

圖4 溫度對DPPH自由基和羥基自由基清除率的影響Fig.4 Effect of temperature on DPPH free radical scavenging rate and hydroxyl radical scavenging rate

總體來說，溫度對兩種自由基清除率的影響較小。隨著溫度的升高，自由基清除率先上升后下降，到50℃時達到峰值，這是由于溫度較低（30℃～40℃）時，酶與底物的接觸碰撞較溫和，酶解效率較低，隨溫度升高，反應速率逐漸升高，水解程度增大，而當溫度過高時，蛋白酶因高溫逐漸變性甚至失活，抑制了活性肽的生成，水解度降低。因此選擇50℃為最佳酶解溫度。

2.2.4 時間對酶解物抗氧化活性的影響

酶解時間對酶解產物抗氧化活性的影響如圖5所示。

圖5 時間對DPPH自由基和羥基自由基清除率的影響Fig.5 Effect of time on DPPH free radical scavenging rate and hydroxyl radical scavenging rate

在1 h到4 h內，兩種自由基清除率均緩慢上升，在5 h時急劇升高并達到最大值，在5 h～7 h區間內快速下降。推測原因是酶解時間不同，其產生的肽鏈的長度和結構也不同，當達到最適值后，酶解時間繼續延長，一部分具有抗氧化性的活性肽可能被過度水解，生成不具有抗氧化活性的片段或游離氨基酸[29]，導致自由基清除活性降低。綜上，選擇5 h為最佳酶解時間。

2.3 響應面試驗設計方案和結果分析

綜合單因素試驗結果，以DPPH自由基清除率（Y1）及羥自由基清除率（Y2）為指標，選取加酶量、pH值、酶解時間為考察因素，設置底物濃度為0.015 g/mL，溫度50℃，根據響應面分析法中心組合設計原理進行響應面試驗，共進行17組試驗，響應面設計及結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計及試驗結果Table 3 Respond surface experimental design and results

利用Design-Expert V8.0.6軟件進行多元回歸擬合分析，得到DPPH自由基清除率回歸方程為：Y1=54.98+0.45A-5.75B-0.98C-0.67AB-0.84AC-2.04BC-2.21A2-8.67B2-2.42C2。

羥基自由基清除率回歸方程為：Y2=41.17+2.36A-3.23B-0.19C-1.12AB-0.18AC-1.41BC-6.74A2-5.74B2-3.94C2。

回歸方程的方差分析結果分別見表4、表5。

DPPH自由基清除率的回歸模型（表4）F值為7.45，P 值（P=0.007 4）小于 0.01，所得模型較顯著；羥基自由基清除率的回歸模型（表5）F值為17.86，P值（P=0.000 5）小于0.001，回歸模型極顯著。此外，兩者的模擬誤差失擬項分別為0.141 8、0.947 5，均大于0.05，表明回歸模型誤差較小，擬合度好，可靠性較高。因此，所建立的兩個回歸模型均能夠對奇亞籽酶解工藝的優化進行較好地分析和預測。

2.3.1 各因素對奇亞籽蛋白酶解產物抗氧化活性的影響

通過方差分析中F值的大小可評價各因素對指標的影響程度，F值越大，影響越顯著。由表4可知，F（A）=0.16，F（B）=26.08，F（C）=0.75，即在以 DPPH 自由基清除率為指標時，各因素對奇亞籽酶解工藝的影響順序為：酶解 pH值（B）＞酶解時間（C）＞加酶量（A）。由表 5 可知，F（A）=12.37，F（B）=23.13，F（C）=0.077，在以羥基自由基清除率為指標時，各因素對酶解工藝的影響順序為：酶解pH值（B）＞加酶量（A）＞酶解時間（C）。綜合可知，酶解pH值對兩指標的影響最為顯著，且一次項和二次項的影響顯著，而交互作用影響不顯著，表明響應值變化較為復雜。各因素交互作用的響 應面及等高線圖見圖6、圖7。

表4 DPPH自由基清除率回歸模型方差分析Table 4 ANOVA of regression equation for DPPH free radical scavenging rate

表5 羥基自由基清除能力回歸模型方差分析Table 5 ANOVA of regression equation for hydroxyl radical scavenging rate

圖6 各因素對酶解液DPPH自由基清除率影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the effects of various factors on DPPH free radical scavenging rate

三維響應面的坡度體現了各因素對響應值影響的大小，如果坡度相對平緩，說明因素對響應值影響較小。等高線圖反映變量間交互作用的強弱，等高線形狀越近似橢圓形，則表明交互作用越強，越近似圓形，則表明交互作用越弱。同時，等高線沿因素所在坐標軸的變化程度越大，則此因素相較另一因素對響應值的影響越大。

圖6反映各因素對酶解產物DPPH自由基清除率的影響。由圖 6（a）、圖 6（b）可知，奇亞籽酶解物的DPPH自由基清除率隨pH值升高呈現先增大后降低的趨勢，存在極大值；隨加酶量、酶解時間的增加呈現先增后趨于平緩的趨勢。此外，由等高線可知，等高線沿pH值軸變化趨勢明顯高于加酶量和酶解時間，由此可推斷，pH值對酶解產物DPPH自由基清除率的影響大于加酶量和酶解時間。又由圖6（c）可知，等高線沿酶解時間的變化趨勢大于加酶量，說明酶解時間對該酶解工藝的影響大于加酶量。

圖7 各因素對酶解液羥基自由基清除率影響的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of effect of various factors on hydroxyl radical scavenging rate

圖7反映各因素對酶解產物羥基自由基清除率的影響。由圖 7（a）、圖 7（b）可知，在所考察的加酶量、酶解pH值、酶解時間范圍內，酶解產物的羥基自由基清除率先增大后降低，存在極大值。由等高線可知，酶解pH值的等高線變化趨勢較加酶量和酶解時間大，由此可知，pH值對酶解物羥基自由基清除率的影響大于加酶量和酶解時間。又由圖7（c），加酶量等高線變化趨勢較酶解時間陡峭，因此，加酶量對該酶解工藝的影響大于酶解時間。

綜上所述，各因素對奇亞籽酶解產物DPPH自由基清除率的影響主次順序為：酶解pH值＞酶解時間＞加酶量，對酶解物羥基自由基清除率的影響主次順序為：酶解pH值＞加酶量＞酶解時間，與方差分析結果一致。

2.3.2 最佳提取條件確定及驗證

利用Design-Expert V8.0.6軟件分析，以使兩指標DPPH自由基及羥基自由基清除率同時達到最大值進行條件優選，得到最佳條件為：加酶量3 170 U/g，pH 6.94，酶解時間4.92 h，此時兩種自由基清除率分別為55.39%及41.15%。

采用雙指標下的最佳酶解條件進行驗證性試驗。鑒于可操作性，將最佳酶解條件調整為：加酶量3170U/g，pH 6.9，酶解時間4.9 h。對此條件下的抗氧化活性進行鑒定，結果如表6所示。

表6 抗氧化肽活性鑒定Table 6 Identification of antioxidant peptide activity

DPPH 自由基清除率為（54.90±0.94）%，與預測值相對誤差為0.88%；羥基自由基清除率為（41.03±0.16）%，與預測值相對誤差為0.29%，兩者誤差均較小，由此可見由響應面優化分析得到的回歸模型較可靠。此外，該工藝制得的抗氧化肽具有較好的抗氧化能力值，為（0.53±0.03）μmol TE/mg。

3 結論

本文以奇亞籽為原料，在單因素的基礎上，同時以DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率為指標，利用響應面法建立奇亞籽蛋白制備抗氧化肽工藝的二次數學模型，通過方差分析，所得模型較顯著，回歸方程擬合度較好。DPPH自由基及羥基自由基清除率同時達到最佳值時，抗氧化肽最佳制備工藝為：加酶量3 170 U/g，pH 6.9，酶解時間4.9 h。此時，測得兩種自由基清除率分別為54.90%、41.03%，與理論值55.39%、41.15%均無顯著差異，表明通過響應面分析得到的回歸方程能較好地預測試驗結果。同時，該工藝下制得的抗氧化肽具有較好的抗氧化能力值，為（0.53±0.03）μmol TE/mg。本試驗的結果為奇亞籽抗氧化肽的進一步研究提供了一定基礎。