量子點標記熒光免疫試紙條可視化檢測肉品中志賀氏菌研究

朱芳茜，何擴*，張秀媛，魏東，王碩，李育峰，陳一，趙瑞平

（1.河北省農產品食品質量安全與檢測重點實驗室，河北北方學院，河北 張家口 075000；2.南開大學，天津 300000）

志賀氏菌（Shigella sp.）是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌，在我國感染性腹瀉病原菌中高居首位，它主要侵染人體的結腸，引發腸道炎癥、潰瘍以及頻繁的黏液性血性腹渾，少數嚴重可導致驚厥、低鈉血癥、低血糖、溶血性尿毒綜合征、腸穿孔和死亡[1-2]。每年全世界有1.6億人傳染此類疾病，約有110萬人死亡，其中5歲以下兒童為主要受害者[3]。在我國，由于水源或食品受到志賀氏菌污染而引起痢疾、腹瀉等疾病時有發生[4]。因此，建立一種快速、準確的志賀氏菌檢測方法顯得尤為重要。

目前，志賀氏菌常規檢測方法主要有兩大類：一是傳統培養計數法，二是快速檢測法。傳統生化培養法具有結果準確，且無需復雜設備等特點，但由于步驟繁瑣、周期長、試劑繁多等缺陷，遠遠不能滿足現代快速檢測的需要[5-6]。基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、分子生物學原理的各種快速檢測法具有檢測準確的優點，但由于其需要昂貴的試劑和設備、有時需帶回專業實驗室檢測等缺陷，無法滿足現場分析的需要[7-9]。熒光量子點（quantum dot，QD）本身具備光穩定性好、熒光強度高、激發光譜寬而連續、發射光譜窄而對稱、發射波長可調等優越的發光特點，且通過對量子點表面修飾不同的官能團（如-COOH、-NH2），即可使其很容易與生物大分子如抗體等進行偶聯[10-11]，因此，以量子點作為標記物可顯著提高免疫層析試紙條的靈敏度和穩定性。此外，運用發射波長差異的多種熒光量子點分別偶聯多種檢測抗體，可實現多種抗原的集成定量檢測[12-13]。

本研究采用CdTe量子點偶聯志賀氏菌抗體作為熒光標記，制備一種用于能快速可視化檢測志賀氏菌的免疫熒光試紙條，原理見圖1，該試紙條可實現對肉品中志賀氏菌的快速、簡便、可視化定量檢測。

圖1 量子點熒光免疫層析試紙條示意圖Fig.1 Schematic diagram of quantum dots fluorescent immunochromatographic strip

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰醋酸鎘[Cd（CH3COO）2·2H2O]、亞碲酸鉀（K2TeO3）、硼氫化鈉（分析純，96%）、氫氧化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；谷胱甘肽、羊抗鼠二抗：美國Sigma公司；志賀氏菌鼠單克隆抗體：河北省農產品食品質量安全檢測重點實驗室（河北北方學院）自制；志賀氏菌（ATCC12022）、沙門氏菌（ATCC 50071）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）菌株：河北省農產品食品質量安全檢測重點實驗室保存制備；樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙：上海金標生物科技有限公司；志賀氏菌膠體金試紙條：廣州市益滿生物科技有限公司；豬肉、火腿腸：市售；其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡：日本電子株式會社；F-2500 FL熒光光譜儀：日本Hitachi公司；pHS-3C酸度計：上海雷磁公司；HM3230點膜儀、ZQ2002自動切條儀：上海金標生物科技有限公司；WI95549冷凍干燥儀：東西儀（北京）科技有限公司；GZX-9240MBE電熱恒溫干燥箱：上海博迅實業有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 CdTe量子點的制備

稱取15.6 mg的冰醋酸鎘溶解于50 mL雙蒸水中，然后加入20 μL谷胱甘肽，緩慢滴加1 mol/L的氫氧化鈉溶液，至pH10.5。稱取5 mg的亞碲酸鉀溶解于50 mL雙蒸水中，將pH10.5冰醋酸鎘溶液和亞碲酸鉀溶液混合到一起，稱取40 mg的硼氫化鈉加入混合液中，攪拌至硼氫化鈉完全溶解為止后將溶液轉入到250 mL的三口圓底燒瓶，油浴加熱，100℃回流3 h，取樣2 mL于離心管中，分別用透射電子顯微鏡以及熒光光譜儀對其進行表征[14-15]。

1.3.2 量子點標記志賀氏菌抗體

取150 μL的谷胱甘肽穩定的CdTe量子點溶液加入到1 mL pH7.4 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）中，加入 50 μL 對乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺 [1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]和 50 μL N-N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），振蕩條件下活化20min，加入20 μL志賀氏菌單克隆抗體，37℃、180 r/min振蕩4 h，加入濃度為1%的牛血清白蛋白?；靹?30 min，15 000 r/min 離心 20 min，取沉淀，備用[16]。

1.3.3 熒光免疫層析試紙條組裝

在硝酸纖維膜上用HM3230點膜儀噴涂志賀氏菌鼠抗和羊抗鼠二抗形成檢測帶和質控帶，將量子點標記好的志賀氏菌抗體均勻地噴涂在樣品墊上，將樣品墊、硝酸纖維膜和吸水墊依次組裝，用試紙條切刀切割成試紙條，干燥箱干燥后封裝，避光保存于4℃備用[17-18]。

1.3.4 試紙條檢測方法建立及其結果判定

將志賀氏菌菌懸液10倍梯度稀釋制備的1×102CFU/mL～1×108CFU/mL志賀氏菌菌液分別滴加到試紙條加樣孔中，反應5 min，待免疫反應達到平衡后，在紫外燈下觀察質控線和檢測線，每個樣本重復測定6次。結果判定：目視T帶的熒光強度，與空白對照，熒光越弱，代表待測溶液中含被測物的濃度越低，出現熒光的最低濃度即為最低檢測限。

1.3.5 試紙條在食品樣品中檢測適用性評價

選取火腿腸、豬肉（肉制品實際樣品）作為檢驗對象，稱取1 g火腿腸和豬肉分別加5 mL超純水搗碎，濾去火腿和豬肉腸渣，分別取0.9 mL火腿腸和豬肉過濾液，加入100 μL志賀氏菌菌液。樣品分別10倍梯度稀釋成菌濃度約 1×105、1×104、1×103CFU/mL 待測，待測液分別用制備量子點熒光免疫層析試紙條和市售志賀氏菌膠體金試紙條進行檢測。

2 結果與分析

2.1 CdTe量子點的結構表征

量子點的結構表征結果見圖2。

圖2 CdTe量子點表征Fig.2 Symptom of CdTe quantum dots

從圖2（A）中可以看出，量子點微球的發射峰對稱且窄，同時量子點的熒光強度可達到9000左右，從圖2（B）可以看出制備的CdTe量子點大小均勻，粒徑大小約為50 nm。說明合成的量子點較好。

2.2 量子點與志賀氏菌抗體的偶聯

通過EDC/NHS活化體系活化后，偶連量子點與志賀氏菌抗體，分別取2 mL用PBS稀釋的量子點、量子點與抗體偶聯物、抗體原液，200 nm～800 nm全波長下紫外掃描鑒定，掃描結果見圖3。

圖3 量子點-抗體復合物紫外全波長掃描圖Fig.3 Full-wavelength scanning of quantum dot-antibody complex

量子點與抗體偶聯后，量子點的吸光度強度變大，志賀氏菌抗體的吸收峰基本接近于量子點的最大激發波長，導致量子點與抗體偶聯物的最大激發波長發生藍移。

2.3 量子點熒光免疫層析試紙靈敏度

將志賀氏菌菌懸液10倍梯度稀釋制備的1×102CFU/mL～1×108CFU/mL志賀氏菌菌液分別滴加到試紙條加樣孔中進行檢測，檢測結果見圖4。

圖4 熒光免疫試紙條靈敏度Fig.4 Sensitivity of fluorescent immunostrip

隨著志賀氏菌濃度的降低，熒光強度越來越弱，當志賀氏菌濃度小于1×103CFU/mL，熒光消失，所以熒光免疫試紙條的檢測限為1×103CFU/mL。

2.4 量子點免疫層析試紙特異性評價

將沙門氏菌、肉毒梭菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、蠟樣芽桿菌稀釋成濃度為1×107CFU/mL，用制備的熒光免疫層析試紙條進行檢測，每種菌樣同一濃度重復檢測6次，通過有無熒光判斷試紙條的交叉反應性，結果見圖5。

圖5 熒光免疫試紙條特異性Fig.5 Specificity of fluorescent immunostrip

試驗顯示制備的熒光免疫層析試紙條與其它致病菌均無交叉反應，表明制備的試紙條特異性較好。

2.5 試紙條在食品樣品中檢測適用性評價

利用CdTe量子點制備的熒光免疫試紙條和酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒對添加的志賀氏菌肉類實際樣品進行檢測，每個濃度菌樣檢測6次。檢測結果見表1。

表1 量子點熒光免疫試紙條適用性測試Table 1 Applicability test of quantum dots fluorescent immunostrip

當菌樣添加質量濃度為1×103CFU/mL時，試紙條檢測均為陰性；志賀氏菌添加濃度為1×104CFU/mL時，熒光免疫試紙條檢測結果為陽性，而膠體金試紙條為陰性。添加濃度為1×105CFU/mL時，熒光免疫試紙條和膠體金試紙條檢測結果均為陽性，表明制備的熒光免疫試紙條對肉類實際樣品的檢測限為1×104CFU/mL，與膠體金試紙條相比，其靈敏度仍要高一個數量級。

3 結論

本試驗利用谷胱甘肽為穩定劑成功合成了水溶性CdTe量子點，在EDC和NHS共價偶聯的作用下，通過酰胺鍵連接了志賀氏菌單克隆抗體，在優化的試驗條件下，成功制備了一種能特異性檢測志賀氏菌的熒光免疫試紙條，其對肉制品實際樣品的檢測限可達1×104CFU/mL（目前市場上廣泛引用的膠體金試紙條的檢出限為1×104CFU/mL），為志賀氏菌市場快速檢測提供了一個新的方法。