FoxO1 經ATF6調控Hcy誘導的肝細胞凋亡

王青青，焦 運，吳欣妍，海秀玲，徐 龍,張 輝,郭 偉,郝銀菊,姜怡鄧,4,5

(寧夏醫科大學 1.基礎醫學院、2.總醫院感染科、3.藥學院、4.寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室、5.國家衛生健康委代謝性心血管疾病研究重點實驗室，寧夏回族自治區,寧夏 銀川 750004)

高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)是由蛋氨酸代謝中胱硫醚β-合成酶(cystathionine β synthase，CBS)活性缺乏或減少導致同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)在體內的大量積聚造成的[1]。HHcy可參與肝硬化、慢性腎病和心腦血管等多種疾病的發生發展[2-3]。本課題組前期的多項研究表明，HHcy能夠明顯引起肝臟損傷[4-5]。細胞內誘導細胞凋亡的場所在內質網，而且過度的內質網應激會誘導細胞凋亡[6]。內質網應激在肝臟損傷中發揮重要作用，參與肝炎、肝硬化、肝癌等肝臟疾病中肝細胞凋亡的調控[7-8]。激活轉錄因子6(activate transcription factor 6，ATF6)作為內質網的傳感器，當內質網(endoplasmic reticulum，ER)應激誘導非折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)時被激活。ATF6在細胞中表達增加，進而調控促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)使得半胱氨酸天冬酰胺酶12(cysteine-containing aspartate-specific protease 12，caspase12)發生活化，促進細胞凋亡的發生[9-10]，但是ATF6是否在Hcy誘導肝細胞凋亡中發揮調控作用未見報道。叉頭框蛋白O1(forkhead box O1，FoxO1)是Fox基因家族的重要成員，廣泛參與哺乳動物細胞增殖、分化、代謝和凋亡等生物學功能[11]，在Hcy誘導的肝細胞凋亡中，DNA低甲基化是造成FoxO1表達上調的重要原因[12]，但其機制尚不明確。因此，本研究以ATF6表達改變為切入點，探討FoxO1在Hcy介導的肝細胞凋亡中的潛在機制，將為進一步研究肝損傷的發病機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器同型半胱氨酸(BCBV1026)，購自Sigma公司；cbs+/-與cbs+/+實驗小鼠由杰克遜實驗室(Bar Harbor,ME)提供，飼養于寧夏醫科大學動物中心。Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(9009907)，購自沈陽萬類生物生物技術有限公司；蛋白提取試劑盒(P0013F)、蛋白定量試劑盒(20191101)，購自上海碧云天生物技術有限公司；FoxO1(ab179450)、ATF6(ab227830)、Bcl-2 (ab32124)和Bax(ab32503)抗體，均購自Abcam公司；內參抗體β-actin(TA-09)，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；胎牛血清(2021472)和 RPMI 1640 培養液(812006)，購自Gibco公司；超凈工作臺，購自蘇州安泰有限公司；總RNA提取試劑盒(U8604)，購自北京天根生物技術有限公司；ATF6，FoxO1引物由上海生工合成；逆轉錄試劑盒(AJ90851A)與qRT-PCR試劑盒(AJE1566A)，購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；流式細胞儀，購自美國ACEA；普通PCR儀與qRT-PCR 儀，購自耶拿公司；CO2培養箱和5415D 型微量臺式離心機，購自Eppendorf公司；BS110S 型精密天平，購自Sartoriu公司；垂直電泳儀和 Model680 全自動酶標儀，購自BioRad公司。

1.2 細胞培養人正常肝細胞株HL-7702，購自上海名勁生物科技有限公司。用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培養基培養，并將細胞置于37 ℃、5% CO2的培養箱中進行培養。當細胞密度增長至50%時，以0、100 μmol·L-1Hcy干預48 h的人肝細胞分別作為對照組和Hcy組，收集細胞用于后續實驗。

1.2.1siRNA 轉染肝細胞 轉染前1 d，在400 μL的培養基(不加抗生素)中接種2×105個細胞。將 250 μL RPMI 1640 純培養基和0.5OD 6.25 μL的siRNA(序列如Tab 1所示)混合，輕輕吹吸3-4次。再將250 μL 1640純培養基與5 μL的 Lipofectamine 2000混合，輕輕吹吸3-4次，靜置 5 min。將混合轉染試和siRNA稀釋液混合，輕輕吹吸3-4次，于室溫下靜置 20 min。將上述轉染混合物加入培養瓶中，再加入1.5 mL純培養基，輕搖培養瓶混合均勻。將培養瓶置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養6 h，更換新鮮的培養基，并加入 Hcy 藥物干預48h，進行后續其他實驗。

Tab 1 FoxO1 and ATF6 siRNA sequences

1.2.2流式細胞儀檢測肝細胞凋亡水平 用胰蛋白酶消化肝細胞，1 500g離心5 min，收集肝細胞，用4 ℃預冷的PBS將細胞洗滌2次，再次1 500g離心5 min收集肝細胞，用500 μL 1×Annexin V結合液懸浮細胞，其濃度大約為1 × 109cells/L。接著加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI 染色液，輕輕混勻后置于避光處孵育15 min，并在1 h內用流式細胞儀檢測肝細胞凋亡率。

1.2.3Western blot檢測FoxO1、ATF6以及凋亡相關蛋白的表達 按照蛋白提取試劑盒配置的蛋白裂解液將收集的肝細胞裂解，使用BCA法對蛋白裂解液進行定量，將濃度定量的總蛋白加入適量的蛋白上樣緩沖液煮沸5 min以徹底變性，經SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉至PVDF膜，并用5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗膜10 min×3 次，與1 ∶1 000稀釋的FoxO1、ATF6、Bax和Bcl2的一抗在4 ℃孵育過夜，PBST洗膜10 min×3 次，再與 1 ∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，PBST洗膜10 min×3 次，采用ECL化學發光試劑顯色，用Image Lab 軟件分析檢測結果的灰度值，計算目的條帶灰度值與內參β-actin 灰度值的比值，進行結果分析。

1.2.4qRT-PCR檢測FoxO1和ATF6的mRNA表達 按照總RNA提取試劑盒操作提取組織與細胞的總RNA，根據Gene Bank查詢序列并交由生工設計引物，FoxO1(人源)：Forward：GTACGCCGACCTCAT CACCAAG，Reverse:GCACGCTCTTCACCATCCACTC；FoxO1(鼠源)：Forward：TGTCCTACGCCGACCTCAT CAC，Reverse:GCACGCTCTTGACCATCCACTC；ATF6(人源)Forward：GCGGAGCCACTGAAGGAAGATAAG，Reverse：TGTTTGAGTCTTGGGTGCTGCTG；ATF6(鼠源)Forward：TGCCTTGGGAGTCAGACCTATGG，Reverse：CTGTGGACCGAGGAGAGGAGATG。逆轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ forever；qRT-PCR擴增程序95 ℃ 30 s 1x，95 ℃ 5 s 60 ℃ 34 s 40 x，Dissociation 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，75 ℃ 15 s，以內參作為對照，目的基因的相對量根據公式2-△△Ct，△△Ct=[Ct目的基因(待測樣本)-Ctβ-actin(待測樣本)]-[Ct目的基因(校正樣本)-Ctβ-actin(校正樣本)]。

2 結果

2.1 FoxO1在cbs小鼠肝臟及人源肝細胞中的表達情況qRT-PCR和Western blot 檢測cbs+/+與cbs+/-小鼠肝臟中FoxO1 的mRNA和蛋白表達水平改變。結果顯示，與cbs+/+相比，cbs+/-小鼠肝臟中FoxO1的mRNA與蛋白表達水平顯著增加(P<0.01，Fig 1A，B)。使用100 μmol·L-1Hcy干預肝細胞48 h，模擬體外HHcy,接下來用qRT-PCR和Western blot檢測FoxO1的mRNA與蛋白表達，結果顯示，與control組相比，Hcy組FoxO1的表達顯著增加(P<0.01，Fig 1C，D)，提示FoxO1表達增加可能在Hcy誘導肝損傷過程中發揮關鍵作用，見Fig 1。

Fig 1 Expression of FoxO1 in hepatocytes detected by qRT-PCR and Western blotA:qRT-PCR was used to detect the FoxO1 mRNA expression in liver of cbs+/+ and cbs+/- mice(,n=8);B:Western blot was used to detect FoxO1 protein expression in liver of cbs+/+ and cbs+/- mice(,n=8);C:qRT-PCR was used to detect the FoxO1 mRNA expression in hepatocytes (±s,n=3).**P<0.01 vs cbs+/+group or control group.

2.2 FoxO1 siRNA敲低效率驗證構建FoxO1的siRNA并轉染肝細胞，qRT-PCR和Western blot檢測FoxO1表達改變。結果顯示，3組干擾片段均能引起FoXO1表達下調(Fig 2A，B)，且以FoxO1-siRNA-1338(siFoxO1)效果最好，可用于后續試驗。

2.3 敲低FoxO1抑制肝細胞凋亡轉染FoxO1 siRNA至肝細胞后，且用 Hcy處理48 h。結果顯示，與Hcy+si-NC組相比，Hcy+siFoxO1組Bax的表達顯著降低(P<0.05，Fig 3A)，Bcl2的表達顯著增加(P<0.01，Fig 3A)，同時流式細胞術顯示肝細胞凋亡率顯著降低(P<0.01，Fig 3B)，提示FoxO1敲低可下調肝細胞凋亡水平。

Fig 2 mRNA and protein expression of FoxO1 in hepatocytes detected by qRT- PCR and Western blotA:qRT-PCR was used to detect the FoxO1 mRNA expression in hepatocytes (,n=3);B:Western blot was used to detect FoxO1 protein expression in hepatocytes(,n=3).*P<0.05,**P<0.01 vs si-NC group.

2.4 FoxO1參與調控ATF6的表達改變ATF6作為內質網應激中未折疊蛋白反應致細胞凋亡的重要蛋白，為了驗證其在肝細胞凋亡中的作用，首先采用qRT-PCR和Western blot檢測小鼠肝臟組織和肝細胞中ATF6的表達。結果顯示，與cbs+/+組相比，cbs+/-組肝臟組織中ATF6的表達明顯增加(P<0.05，Fig 4A)，同時Hcy處理的肝細胞中表達明顯上調(P<0.01，Fig 4B)，結果與動物水平保持一致。肝細胞轉染FoxO1 siRNA后，qRT-PCR和Western blot檢測ATF6的表達改變，與Hcy+si-NC組相比，Hcy+siFoxO1組ATF6表達顯著降低(Fig 4C)(P<0.05)，說明Hcy通過上調FoxO1促進ATF6表達進而激活內質網應激反應。

Fig 3 Hcy induced hepatocyte apoptosis inhibited by decreased FoxO1 expressionA:Western blot was used to detect Bcl2 and Bax protein expression(,n=3);B:Apoptotic rate of hepatocytes (,n=3).*P<0.05,**P<0.01 vs Hcy+si-NC group.

Fig 4 Expression of ATF6 in hepatocytes regulated by FoxO1A:qRT-PCR and Western blot was used to detect ATF6 expression in liver(,n=8);B:qRT-PCR and Western blot was used to detect ATF6 expression inhepatocytes;C:Hepatocytes were transfected with FoxO1 siRNA,Hcy to interfere with hepatocytes,and ATF6 expression was detected by qRT-PCR and Western blot(,n=3).*P<0.05,**P<0.01 νs control and Hcy+si-NC group.

2.5 FoxO1通過調控ATF6表達改變參與肝細胞凋亡調控為了進一步探討FoxO1在調控肝細胞凋亡中的分子機制，構建ATF6 siRNA并轉染肝細胞。qRT-PCR和Western blot結果顯示，在引起ATF6表達下調的3個干擾片段中，siRNA-ATF6-homo-2105 (siATF6)敲低效果最佳，可用于后續試驗(Fig 5A)。為證明ATF6在Hcy誘導肝細胞凋亡過程中的調控作用，將ATF6 siRNA 轉染肝細胞，Western blot和流式細胞術分別觀察肝細胞凋亡情況。結果顯示，與Hcy+si-NC組相比，Hcy+siATF6組Bax蛋白表達顯著降低(P<0.01，Fig 5B)，而Bcl2蛋白表達明顯增加(P<0.05，Fig 5B)。流式細胞術的結果顯示肝細胞凋亡率亦顯著降低，這與Western blot結果一致(P<0.01，Fig 5C)。為進一步的證明FoxO1通過調控ATF6的表達改變調控肝細胞凋亡，在Hcy干預的條件下，肝細胞分別轉染FoxO1過表達腺病毒或轉染FoxO1過表達腺病毒加ATF6siRNA，Western blot檢測Bax和Bcl2的表達改變，結果顯示，與Ad-FoxO1組相比，Ad-FoxO1+siATF6組Bax表達顯著降低(P<0.05,Fig 5D)，Bcl2的表達顯著增加(P<0.05，Fig 5D)。以上結果說明，FoxO1通過調控ATF6表達改變調控Hcy誘導的肝細胞凋亡。

Fig 5 Hcy-induced hepatocyte apoptosis significantly relieved by down-regulation of ATF6A:Hepatocytes were transfected with ATF6 siRNAs,qRT-PCR and Western blot to detect ATF6 expression (,n=3);B:Hepatocytes were transfected with ATF6 siRNA,Western blot to detect Bax and Bcl2 expression (,n=3);C:Hepatocytes were transfected with ATF6 siRNA,observation of hepatocyte apoptotic rate by flow cytometry(,n=3);D:FoxO1 overexpression adenovirus or FoxO1 overexpression adenovirus plus ATF6siRNA in hepatocytes,Western blot to detect Bax and Bcl2 expression(,n=3).1：Control;2:si-NC;3:ATF6-homo-1734;4:ATF6-homo-2105;5:ATF6-homo-1038.*P<0.05,**P<0.01 νs control+si-NC group or Ad-FoxO1 group.

3 討論

Hcy是一種含硫氨基酸，在生物體內硫醇新陳代謝中起到的關鍵作用。當血漿Hcy濃度高于15 μmol·L-1時，將會超出機體自身調節能力，使機體患有嚴重疾病，包括造血功能異常、阿爾茨海默病、神經毒性和肝臟損害等[13]。大量研究表明，肝臟正常情況下肝細胞很少發生凋亡，當肝細胞大量凋亡發生時，肝臟會出現明顯的損傷，因此研究肝細胞的凋亡機制對于預防肝臟損傷至關重要。本課題組前期的大量研究表明，高同型半胱氨酸血癥顯著引起肝臟損傷，肝細胞凋亡在其中發揮了重要的調控作用，且采用不同濃度的Hcy處理體外培養肝細胞，發現肝細胞損傷隨著Hcy濃度的增加而逐漸加重[4-5]。

FoxO1是體內重要信號傳導途徑中的關鍵調節劑之一。研究表明缺氧狀態下顆粒細胞(granulosa cell，GC)中FoxO1的表達增加，通過JNK途徑的細胞凋亡顯著增加，敲低FoxO1表達后顯著抑制缺氧暴露后GC的凋亡[14]。課題組前期的研究亦發現，FoxO1啟動子區的低甲基化造成FoxO1的表達增加，可能在Hcy誘導的肝細胞內質網應激未折疊蛋白反應中發揮重要作用[12]，但是抑制FoxO1的表達后，Hcy誘導肝細胞內質網應激未折疊蛋白反應致肝細胞凋亡是否會緩解，以及FoxO1通過何種途徑緩解肝細胞凋亡均未知，基于此，本課題進行了大量研究，研究結果證明，Hcy能夠顯著促進FoxO1的表達，在抑制FoxO1的表達后，Hcy處理的肝細胞凋亡程度顯著降低。內質網應激在誘導細胞凋亡過程中發揮著重要的作用，內質網應激未折疊蛋白反應主要由3條途徑激活分別是：(1)PERK /eIF2α/ ATF4分支，二聚化和自磷酸化會激活PERK，導致eIF2α發生磷酸化并抑制蛋白質表達，eIF2α磷酸化后會促進轉錄表達因子4(activate transcription factor 6，ATF4)[15]。(2)IRE1 / XBP1分支，病理狀態下IRE1與葡萄糖調節蛋白(glucose-regulated protein 78，GRP78)解鍵激活，并導致XBP1的進一步剪接。新產生的剪接XBP1(sXBP1)作為轉錄因子調節ER蛋白的表達[16]。(3)ATF6分支，當發生內質網應激時，ATF6從GRP78上解離，導致ATF6表達增加并易位至細胞核并誘導ER應激反應基因CHOP的表達，促進細胞凋亡[17]。本課題組前期的研究同樣也表明，Hcy顯著促進肝細胞發生內質網應激未折疊蛋白反應[5]，也證明了Hcy促進肝細胞中ATF6的表達增加，FoxO1能夠調控ATF6的表達，為進一步的證明ATF6途徑在Hcy誘導肝細胞凋亡中的重要作用，Hcy干預肝細胞的狀態下敲低ATF6的表達，發現Hcy引起的肝細胞凋亡顯著降低，說明在內質網應激未折疊蛋白反應中ATF6途徑發揮著重要的調控作用。在Hcy干預的基礎上，過表達FoxO1，發現Bax的表達顯著增加，Bcl2的表達降低，與此同時過表達FoxO1的同時敲低ATF6的表達，Bax的表達顯著降低，Bcl2的表達增加，此時凋亡相關蛋白Bax和Bcl2的變化與只敲低ATF6的結果是一樣的，與只過表達FoxO1的結果是正好相反的，這說明FoxO1必須經過ATF6才能發揮功能，提示ATF6在FoxO1在調控肝細胞凋亡過程中發揮著關鍵的作用。

綜上所述，Hcy通過促進FoxO1的表達激活ATF6途徑發生內質網應激未折疊蛋白反應造成肝細胞凋亡導致肝臟損傷，這為深入研究HHcy引起肝細胞凋亡提供了新的實驗依據，而且為HHcy引起的肝損害提供了新的防治依據和治療靶點。