飲水中添加大蒜精油對蛋雞生長性能、腸道組織形態及盲腸菌群的影響

徐 靜 張子儒 王德賀 陳一凡 劉雪露 張 鶴 黃晨軒 劉 萌 張 波 侯建庫 周榮艷 陳 輝* 邸科前

(1.河北農業大學動物科技學院，保定071001；2.保定市順平縣農業農村局，保定071001；3.河北大學基礎醫學院，保定071001)

我國是雞蛋消費大國，蛋類的需求使得家禽的集約化生產成為必然。為了提高蛋雞的生產性能及抗病力，過去的幾十年中，抗生素常被當作飼料添加劑使用[1]，由于人類對抗生素會產生耐藥性，禁抗成為了新的發展趨勢[2]。鑒于此，研究人員致力于開發抗生素替代品，其中天然植物精油是當今的研究熱點之一。大蒜精油是取自鮮大蒜的一種天然植物精油，主要成分為大蒜素，大蒜素具有良好的誘食、促生長、抗菌和消炎等作用[3]，且在動物體內無殘留、無副作用。已有研究表明，飼糧中添加大蒜素可以提高產蛋雞的生產性能[4-5]，還可通過提高體液免疫和細胞免疫來提高機體的免疫力[6]。目前有關大蒜素或大蒜精油的研究多以肉雞為試驗對象，且大多探究其對肉雞生長、免疫及抗氧化等性能的影響，關于大蒜精油在蛋雞方面的應用研究較少，且極少有試驗探究大蒜精油對雞腸道形態及盲腸微生物區系的影響，而動物機體的腸道形態、飼糧營養物質消化和吸收、免疫系統發育、致病性腸道細菌的增殖等都與腸道菌群有關[7-9]。因此，本試驗在5～9周齡蛋雞的飲水中添加不同濃度的大蒜精油，通過測定生長性能、腸道組織形態及盲腸菌群等指標，探究大蒜精油對蛋雞的影響，為實際生產中合理使用大蒜精油提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選用200只1日齡健康狀況良好且體重相近的農大三號節糧蛋雞，隨機分為4組，每組5個重復，每個重復10只雞。各組試驗雞飼喂相同的基礎飼糧，對照組正常飲水，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組在飲水中添加大蒜精油(大蒜精油中大蒜素含量為7.5%)，使其濃度分別為0.04、0.06和0.08 mL/L，試驗期為56 d。基礎飼糧參照我國《雞飼養標準》(NY/T 33—2004)配制，其組成及營養水平見表1。

1.2 飼養管理

試驗雞只采用雙層籠養的方式于河北農業大學試驗基地進行飼養，自由采食和飲水，試驗期間嚴格按照農大三號蛋雞飼養標準控制光照。

1.3 指標測定

1.3.1 生長性能測定

以重復為單位，每周末測定采食量。試驗第1天和第56天08：00分別測定試驗雞體重，作為初始體重和終末體重，并計算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 腸道組織形態測定

試驗第56天，于每個重復隨機取5只試驗雞進行屠宰，打開腹腔，分離出十二指腸、空腸和回腸，在每段腸道中段取3 cm左右腸道樣品，用生理鹽水把腸道內容物沖洗干凈，放到4%甲醛溶液中常溫保存，以備制作石蠟切片。制作切片的具體操作為固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色和封固，采用正置光學顯微鏡測定絨毛高度和隱窩深度，并計算絨隱比(絨毛高度/隱窩深度)。

1.3.3 盲腸菌群測定

試驗第56天，于每個重復隨機取2只試驗雞進行屠宰，無菌采集盲腸內容物放入凍存管，-80 ℃保存。采用Hiseq 2500高通量測序技術對盲腸微生物16S rDNA基因全長進行測序，由北京百邁克生物科技有限公司完成。測序流程為：使用德國MN公司的NucleoSpin 96 Soil(4×96)試劑盒提取樣品總細菌DNA后，根據16S rDNA全長引物27F和1492R，合成帶有Barcode的特異引物，進行PCR擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫(SMRT Bell)，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用PacBio Sequel進行測序。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

將PacBio下機數據導出為CCS文件(CCS序列使用Pacbio提供的smrtlink工具獲取)后，進行如下3個步驟的操作。

1)CCS識別：使用lima v1.7.0軟件，通過Barcode對CCS進行識別，得到的Barcode-CCS序列數據；

2)CCS長度過濾：使用北京百邁克生物科技有限公司自主研發的軟件，對Barcode-CCS序列進行過濾，得到有效序列；

3)去除嵌合體：使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到Optimization-CCS 序列。

對序列信息進行操作分類單元(OTU)、多樣性及差異性分析。

1.4 數據整理與分析

應用SPSS 21.0統計軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序對試驗數據進行分析，并采用Duncan氏法進行組間的多重比較。試驗數據以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 飲水中添加大蒜精油對蛋雞生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，飲水中添加0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油對蛋雞的平均日采食量無顯著影響(P>0.05)；飲水中添加0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油均使蛋雞的料重比極顯著降低(P<0.01)，其中以大蒜精油濃度為0.06 mL/L時效果最好；飲水中添加0.04和0.06 mL/L大蒜精油均使蛋雞的平均日增重極顯著升高(P<0.01)，同樣是以大蒜精油濃度為0.06 mL/L時效果最好。

表2 飲水中添加大蒜精油對蛋雞生長性能的影響

2.2 飲水中添加大蒜精油對蛋雞腸道組織形態的影響

由表3可知，與對照組相比，飲水中添加0.04 mL/L大蒜精油使蛋雞回腸絨毛高度極顯著降低(P<0.01)，蛋雞回腸隱窩深度及絨隱比無顯著變化(P>0.05)；飲水中添加0.06 mL/L大蒜精油使蛋雞回腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，回腸絨隱比極顯著升高(P<0.01)；飲水中添加0.04 mL/L大蒜精油使蛋雞空腸絨毛高度與絨隱比均極顯著升高(P<0.01)，回腸隱窩深度顯著下降(P<0.05)；飲水中添加0.06 mL/L大蒜精油使蛋雞空腸隱窩深度顯著下降(P<0.05)，十二指腸絨隱比顯著升高(P<0.05)；飲水中添加0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油使蛋雞十二指腸隱窩深度極顯著下降(P<0.01)，其中以大蒜精油濃度為0.06 mL/L時效果最顯著。

2.3 飲水中添加大蒜精油對蛋雞盲腸菌群的影響

2.3.1 OTU分析

圖2為根據不同分組繪制的OTU Venn圖，不同組用不同顏色表示，不同顏色圖形之間交疊部分數字為2個組之間共有的OTU個數。由圖2可知，各組共有126個OTU；對照組特有17個OTU；與對照組相比，大蒜精油組特有11個OTU。其中，對照組特有OTU含擬桿菌門的為14個，大蒜精油組特有OTU含厚壁菌門的為7個。

2.3.2 α多樣性分析

由表4可知，飲水中添加大蒜精油對蛋雞盲腸微生物α多樣性指數無顯著影響(P>0.05)。

A、B、C、D分別為對照組以及0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油組十二指腸組織切片(40×)；E、F、G、H分別為對照組以及0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油組空腸組織切片(40×)；I、J、K、L分別為對照組以及0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油組回腸組織切片(100×)。

CK：對照組 control group；C1：0.04 mL/L大蒜精油組 0.04 mL/L garlic essential oil group；C2：0.06 mL/L大蒜精油組 0.06 mL/L garlic essential oil group；C3：0.08 mL/L大蒜精油組 0.08 mL/L garlic essential oil group。下圖同 the same as below。

2.3.3 β多樣性分析

將構建的OTU進行主成分分析，由圖3可知，第1主成分和第2主成分的貢獻率分別為46.53%和23.46%，4組間樣品無交疊情況，各組盲腸在菌群構成上無相似性。

2.3.4 各樣品在門、屬水平上的菌群結構分析

由圖4可知，在門水平上，試驗雞盲腸中主要檢出擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、梭桿菌門(Fusobacteria)以及互養菌門(Synergistetes)等菌群，其中擬桿菌門、厚壁菌門與變形菌門為優勢菌門。由圖5可知，在屬水平上，試驗雞盲腸中主要檢出擬桿菌屬(Bacteroides)、別樣桿菌屬(Alistipes)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)等菌群，其中擬桿菌屬為核心優勢菌屬。由表5可知，與對照組相比，各大蒜精油添加組擬桿菌門與厚壁菌門的相對豐度均無顯著變化(P>0.05)；飲水中添加0.08 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中變形菌門的相對豐度極顯著升高(P<0.01)。與對照組相比，飲水中添加0.04 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中擬桿菌屬的相對豐度極顯著升高(P<0.01)；飲水中添加0.06 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中別樣桿菌屬和考拉桿菌屬的相對豐度均顯著升高(P<0.05)；飲水中添加0.08 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中脫硫弧菌屬的相對豐度極顯著升高(P<0.01)。

表4 α多樣性分析結果

圖3 主成分分析散點圖

3 討 論

3.1 飲水中添加大蒜精油對蛋雞生長性能的影響

本試驗結果顯示，飲水中添加大蒜精油對蛋雞的平均日采食量無顯著影響，0.06 mL/L大蒜精油組與對照組相比料重比極顯著降低，平均日增重極顯著升高。Lim等[10]研究報道在蛋雞飼糧中添加大蒜素后蛋雞的采食量無顯著變化，王凡等[11]的試驗結果表明大蒜素可增加蛋雛雞的平均日增重和降低料重比，與本試驗研究結果基本一致。大蒜精油能夠促進禽類生長，可能是因為大蒜精油中的主要成分大蒜素具有刺激性，能夠加快腸道蠕動、促進營養物質吸收，進而提高飼料的利用率，降低成本[12]。

Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；Synergistetes：互養菌門；Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Elusimicrobia：迷蹤菌門；Others：其他；Unclassified：未分類。

Bacteroides：擬桿菌屬；Alistipes：別樣桿菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；Parabacteroides：副擬桿菌屬；Akkermansia：艾克曼菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Megamonas：巨單胞菌屬；Fusobacterium：梭桿菌屬；Others：其他；Unclassified：未分類。

表5 蛋雞盲腸菌群在門、屬水平上的相對豐度

3.2 飲水中添加大蒜精油對蛋雞腸道組織形態的影響

本試驗結果顯示，飲水中添加0.06 mL/L大蒜精油能夠明顯改善蛋雞回腸、空腸和十二指腸的組織形態。小腸結構與功能的完整性影響著營養物質的消化、吸收與轉運，其中小腸絨毛高度和隱窩深度與腸道生理相關，并且也是衡量腸道功能的重要指標[13]。小腸絨毛的高度、粗細以及排列密度代表著該段腸道接觸食糜的多少，與食糜接觸越多，對營養物質的攝入就越充分[14-15]。隱窩深度與腸上皮細胞的增殖率成反比，細胞成熟率上升的表觀即為隱窩深度下降，營養物質利用率升高。絨隱比則是小腸功能的綜合體現，絨隱比增加說明小腸的消化吸收能力增強[16]。因此，本試驗結果說明在蛋雞飲水中添加大蒜精油能夠提高飼糧中營養物質的吸收利用效率。

3.3 飲水中添加大蒜精油對蛋雞盲腸菌群的影響

動物的生長發育與腸道微生物區系的平衡有著直接關系，當動物腸道受有害菌入侵時，會減少腸道菌群的多樣性，使得腸道微生態失衡，從而降低機體抵抗力，影響動物的生長性能[17]。本試驗使用Usearch軟件[18]對Tags在97%的相似度下進行聚類獲得OTU，OTU反映腸道菌群的物種數目信息。α多樣性反映了單個樣品物種豐度及物種多樣性，可通過Chao1、Ace、Shannon和Simpson指數等指標進行衡量。Chao1和Ace指數表示了物種數量，Shannon和Simpson指數表示物種多樣性，當物種豐度相同時，Shannon指數越大、Simpson指數越小的樣品物種多樣性越高[19]。OTU的覆蓋率(coverage)反映了測序結果是否具有代表性，其值越高，樣本中物種被測出的概率越高。

本試驗結果顯示，蛋雞盲腸菌群在門水平上的優勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，與前人研究結果[20]一致。厚壁菌門的纖維分解菌較豐富[21]，盲腸擬桿菌門豐度較高時，纖維分解菌的數量也有所增加，因此當擬桿菌門與厚壁菌門的豐度升高時，盲腸的發酵作用也隨之增強[22]。擬桿菌門在維持腸道微生態平衡中起著重要的作用，能夠改善宿主健康狀況[23]。而變形菌門則包括很多病原菌，如沙門氏菌和幽門螺桿菌等。洪偉[24]在蛋雞飼糧中添加150 mg/kg大蒜素，結果顯示大蒜素對變形菌門中大腸桿菌有顯著的抑制作用，Sarica等[25]、何云等[6]在肉雞上也得到相似的試驗結果。本試驗中，在蛋雞飲水中添加大蒜精油，結果發現厚壁菌門相對豐度增加，但擬桿菌門與厚壁菌門的相對豐度均無顯著變化，0.04、0.06 mL/L大蒜精油對蛋雞盲腸中變形菌門的相對豐度無顯著影響，0.08 mL/L大蒜精油使變形菌門的相對豐度極顯著升高，與上述前人研究結果不同。本試驗結果說明過高濃度的大蒜精油可能增加了有害微生物對蛋雞腸道健康的危害。

本試驗結果顯示，蛋雞盲腸菌群在屬水平上的優勢菌群主要為擬桿菌屬，隨后別樣桿菌屬、考拉桿菌屬和脫硫弧菌屬的相對豐度依次遞減。擬桿菌屬不僅能夠維持腸道微生態平衡，還能夠加速多糖的分解和利用[26]，促進機體免疫系統的發育?？祭鷮賹儆诤癖诰T，能夠在腸道內發酵產生短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸能夠通過保護腸道黏膜屏障為腸道上皮細胞供能，具有降低動物機體的炎癥水平以及增強胃腸道功能的作用[27]。腸道脫硫弧菌屬的豐度是潰瘍性結腸炎疾病的重要特征。本試驗中，在蛋雞飲水中添加0.04 mL/L大蒜精油使盲腸中擬桿菌屬的相對豐度極顯著升高；添加0.06 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中別樣桿菌屬和考拉桿菌屬的相對豐度均極顯著升高；添加0.08 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中脫硫弧菌屬的相對豐度極顯著升高。大蒜精油有較好的抗菌能力，其通過抑制細菌代謝達到抑菌和殺菌的效果[28]，高濃度的大蒜精油會損傷腸道，益于有害菌增長；而低濃度的大蒜精油則能夠增加擬桿菌門和厚壁菌門中有益菌的數量，改善蛋雞的腸道形態和腸道健康，提營養物質利用率，最終提高生長性能。

4 結 論

飲水中添加0.04和0.06 mL/L大蒜精油能夠增加蛋雞盲腸中有益菌的種類和數量，有助于盲腸微生態平衡的建立，提高盲腸消化能力和免疫機能，且添加0.06 mL/L大蒜精油能夠有效改善蛋雞十二指腸、空腸和回腸腸道組織形態，有助于蛋雞對營養物質的吸收和利用，提高蛋雞的平均日增重，降低料重比，從而提高蛋雞的生長性能。