不同栽培基質誘導對香菇液體發酵產漆酶活性的影響

熊雪 李鵬 張貴合 向準 陶文廣 周光燕 和耀威

（1. 貴州省生物研究所，貴陽 550009；2. 貴州農業職業學院，貴陽 551400）

香菇（Lentinula edodes）是世界上第二大食用菌類別［1］，因其獨特的鮮香口感，豐富的維生素和氨基酸，并皆具多種保健功能一直被大眾喜愛［2］，市場價值極高。尤其在“十三五”期間，聚焦國內“脫貧攻堅”、“產業扶貧”等政策，食用菌產業被列為脫貧主導產業大力發展之后，香菇作為我國生產區域最廣、總產最高、影響最大的菇類，也隨之成為南北方貧困地區實施產業精準扶貧的主導產業，其栽培規模更是成倍增長。據調查，作為西南山區貧困代表的貴州省，2018年香菇總產量已達42.4萬t，占貴州省食用菌總產量的47%。現被貴州引種栽培的香菇品種繁多，但較為適宜貴州山區氣候的品種且栽培面積較廣的有香菇808及慶科系列香菇，如慶科212、慶科R20等。

香菇在自然界中是一類重要的白腐真菌，廣泛的分布在林區落葉闊葉樹的腐木上，具有較強的木質纖維素降解能力。漆酶作為主要的木質素降解酶，參與香菇生長發育的每一個階段［3］，在一定程度上可以反映為菌株生長和菌絲對基質的利用率［4］。在現行國家行業標準中，香菇菌棒以木屑為主，麥麩、玉米芯或棉籽殼等為輔進行不同比例搭配而成，不同的菌棒配方香菇的產量和品質差異較大［5-7］。故本文選用貴州主栽品種香菇808、慶科R20以及貴州特有馬桑香菇為研究對象，初步研究了香菇菌株間的區別性差異，并以香菇袋料栽培常用基質麥麩、玉米芯和青杠木屑、馬桑木屑為誘導基質進行液體發酵培養，初步探討香菇不同菌株產漆酶能力，旨在得到高產漆酶的栽培基質，從而為提高和改善香菇的產量和品質奠定理論基礎，助推貴州香菇產業振興。

1 材料與方法

1.1 材料

馬桑香菇、香菇808及慶科R20菌株由貴州省食用菌工程技術研究中心提供，現保存于貴州省生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 培養基 固體活化培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B110 mg，瓊脂粉20 g，去離子水1 L，pH自然。

PDA培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 L，pH自然。

種子液培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g、酵母膏10 g，定容至1 L，121℃滅菌30 min。

誘導培養基：以葡萄糖10 g，蛋白胨2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1 g、KH2PO40.46 g，定容至1 L，為基礎培養基。分別于100 mL基礎培養基中加入3 g孔徑粒度為20-60目的馬桑木屑（BM+MS）、青杠木屑（BM+QG）、玉米芯（BM+YMX）、麥麩（BM+MF）誘導物，121℃滅菌30 min。

1.2.2 香菇菌株間的區別性鑒定 將保存的馬桑香菇、香菇808、慶科R20分別接種于活化培養基上，25℃恒溫活化8 d，備用。

（1）拮抗試驗。接種組合為2組。第一組：同種供檢菌種，于同一PDA平板上各接種1個接種塊；第二組：3種供檢菌種，于同一PDA平板上各接種1個接種塊，每組3個重復，分別進行對峙培養。

（2）建立香菇系統發育樹。采取購買的生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離純化3種香菇菌株基因組DNA，提取之后的DNA選用真菌通用引 物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）進行PCR擴增。采用25 μL的PCR反應體系：基因組DNA（基因組20-50 ng/μL）0.5 μL ；10×buffer（ 含 Mg2+）；dNTP（各 2.5 mmol/L）1 μL；Taq酶 0.2 μL；正向引物 F（10 μmol/L）0.5 μL ；反 向 引 物 R（10 μmol/L）0.5 μL；加去離子水至25 μL。反應程序為94℃預變性4 min，94℃變性45個循環，55℃退火45個循環，72℃延伸1 min，30個循環，72℃延伸8 min，4℃終止反應保存。擴增得到的PCR產物經1.0%瓊脂糖電泳檢測擴增結果后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序后登陸GenBank對比，通過BLAST對測序結果進行比對分析，下載最相近菌株的ITS rDNA序列，并構建系統發育樹。

（3）不同溫度生長速度測定。按照國家農業部頒布的中國人民共和國農業行業標準NY/T 2560-2014《 植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南 香菇》中香菇菌絲生長階段的測定方法對3種香菇菌株菌絲進行不同溫度生長測試。

取3種香菇備用活化平板，使用打孔器打取直徑5 mm接種物，接種于PDA平板上，分別置于10、15、20、25、30℃下培養，觀察菌絲生長情況。菌絲生長速度測定采用“十”字交叉法，從菌絲萌發開始，每24 h測量一次，同時記錄菌絲萌發時間，菌絲日均生長速度以吃料后菌落平均每日直徑增長量統計。菌絲鋪滿平板時，觀察記錄菌落的菌絲形態、色澤、菌落形狀、菌絲長勢和邊緣特征等，用“+”、“-”表示菌絲的長勢，“+”越多表示菌絲生長得越好、越健壯、均勻，“-”表示菌絲不生長。

1.2.3 液體發酵培養及漆酶活測定方法 取備用活化平板，使用打孔器打取直徑5 mm接種物，每100 mL種子培養基中無菌條件下放入5個接種物，25℃、150 r/min搖床避光培養。8 d后取勻漿機將三角瓶內的菌絲球攪拌30 s使其成均質體。分別向100 mL含不同基質培養料的誘導培養基（BM+MS、BM+QG、BM+YMX、BM+MF）中加入3 mL攪拌均勻的香菇均質體，于25℃、150 r/min搖床避光培養，每個處理3個重復。

發酵液經雙層濾紙抽濾后，并于5℃低溫條件下12 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

漆酶活性的測定：3 mL反應體系中含1 mL 1 mmol/L 2，2′-連氮 - 雙（3-乙基苯并噻唑 -6-磺酸）［2，2′-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonicacid），ABTS］底物、1.9 mL 50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.2）和100 μL適當稀釋的酶液，于420 nm處測定5 min內的吸光值變化。定義每分鐘轉化1 μmol ABTS所需的酶量為一個活性單位（U）。ABTS在420 nm處摩爾吸光系數為3.6×104L（/mol·cm）。從培養后第2天開始測定其漆酶活性，連續測至培養12 d。

1.2.4 數據處理 利用EXCEL和SPSS 18.0對所得數據進行整理，并進行顯著性分析和雙因素方差檢驗（two-way ANOVA）。

2 結果

2.1 香菇菌株間的區別性鑒定

2.1.1 拮抗試驗 拮抗是檢測自身同其他種間是否有差異的傳統手段，親緣關系較近的菌株之間無拮抗或拮抗不明顯，而親緣關系較為疏遠、不同遺傳背景的菌株之間則拮抗作用十分明顯［8-9］。由表1和圖1可知，馬桑香菇、香菇808、慶科R20菌株自身均無拮抗反應，馬桑香菇同慶科R20和香菇808之間存在明顯的色素沉淀和拮抗溝，說明馬桑香菇同慶科R20和香菇808之間拮抗作用明顯，即馬桑香菇菌株同慶科R20和香菇808菌株間存在差異。而慶科R20和香菇808之間雖然存在溝型，但并無明顯色素產生，說明慶科R20和香菇808間拮抗作用不明顯。

圖1 3種香菇拮抗反應Fig. 1 Antagonistic reaction of 3 kinds of L. edodes strain

表1 3種香菇拮抗試驗對比Table 1 Antagonistic reaction of 3 kinds of L. edodes strain

2.1.2 建立香菇系統發育樹 3種香菇菌株的DNA提取結果見圖2。由圖2可知，香菇菌株DNA條帶清晰，DNA的濃度、純度以及產率均比較高，可用于PCR擴增。

圖2 3種香菇菌株rDNA ITS區段的PCR產物Fig. 2 PCR products of the rDNA ITS segments of the 3 kinds of L. edodes strain

經PCR擴增和序列測定，結果顯示3種香菇菌株rDNA ITS區段長度均在700-800 bp之間，且所得序列經Blast搜索，擊中結果均為Lentanula edodes，下載其相近序列10條，并結合香菇屬下其他種rDNA序列：Lentinula aciculospora、L. boryana、L. lateritia、L. madagasiksrensis、L. novaezelandiae、L.raphanica（每種隨機挑選2條），共同構建系統發育樹（圖3）。系統發育樹表明，3種供試菌株均為有機香菇Lentanula edodes，與其他香菇屬下種有本源差異，且3種香菇分別為有機香菇下的不同分支，且分支較遠，說明菌株間有差異。

圖3 基于ITS序列構建的香菇系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of L. edodes constructed based on ITS sequence

2.1.3 不同溫度條件對3種香菇生長的影響 結合表2和圖4可知，在所設溫度范圍內，供試馬桑香菇、香菇808和慶科R20菌株菌落均呈絨毛狀白色圓形菌落，其日均生長速度隨溫度升高均呈先增后減的趨勢，且在P＜0.05水平上有差異，峰值均在25℃條件下，分別為0.89、0.85和0.89 cm/d。

圖4 不同溫度條件下香菇菌絲日均生長速度Fig. 4 Average daily growth rate of L. edodes under different temperature conditions

表2 不同溫度條件對3種香菇菌株生長的影響Table 2 Effects of different temperature conditions on the growths of 3 kinds of L. edodes strain

馬桑香菇在所設溫度范圍內菌絲日均生長速度依次為 25℃＞20℃＞30℃＞15℃＞10℃，且在 15-30℃下菌落長勢較好，其中20-25℃下最佳。說明馬桑香菇菌絲適宜溫度范圍較廣，最適溫度為25℃，且中低溫較中高溫條件下菌絲生長更好。香菇808在所設溫度范圍內菌絲日均生長速度依次為 25℃＞20℃＞30℃＞15℃＞10℃，且在 20-30℃下菌落長勢較好，其中25-30℃下最佳。說明香菇808菌絲適宜溫度范圍較廣，最適溫度為25℃，且中高溫條件下菌落長勢較好。慶科R20在所設溫度范圍內菌絲日均生長速度依次為25℃＞20℃＞15℃＞30℃＞10℃，且在 15-25℃下菌落長勢較好，最佳為25℃，且該溫度下菌絲生長也最快。說明慶科R20最適溫度為25℃，且中低溫條件較中高溫條件生長更好且更快。

綜上，說明3種香菇菌株菌絲生長速度受溫度影響較大，但菌落長勢受溫度影響較小，且雖然不同菌株的最適溫度均為25℃，但對中高溫和中低溫有不同的傾向性。

2.2 不同香菇菌株對漆酶活性的影響

雙因素方差檢驗結果顯示，香菇不同菌株在不同培養基中的產漆酶能力各不相同，且在整個培養過程中，香菇液體產漆酶活性受菌株遺傳差異和不同栽培基質的影響均為極顯著（P＜0.001）。

由表3、圖5可知，連續12 d培養中，同一誘導培養基上3種香菇菌株液體產漆酶活性有差異，且菌株對香菇液體產漆酶活性皆具有極顯著的影響（P＜0.001）。

圖5 3種香菇菌株在不同誘導培養基上液體發酵產漆酶活性對比Fig.5 Comparison of the laccase production activities of 3 kinds of L. edodes strains in liquid fermentation on different induction media

表3 4種栽培基質對不同香菇漆酶活性的影響Table 3 Effects of 4 cultivation substrates on the laccase activities of different L. edodes

整個培養過程中，不同菌株在相同的培養基上產漆酶活性有差異，所有菌株在連續培養12 d的漆酶活性變化趨勢均為先升后降，且培養前期活性較低，后期漆酶旺盛。具體表現為培養期前6 d，在所有誘導培養基中，菌株香菇808和馬桑香菇均能檢測到相對較弱的漆酶活性，但不穩定，且呈波浪狀上升；而慶科R20僅在含玉米芯（BM+YMX）、麥麩（BM+MF）誘導培養基中能檢測到較弱的漆酶活性，而在含馬桑木屑（BM+MS）誘導培養基中，前6 d均未能檢測到漆酶活性，在含青杠木屑（BM+QG）誘導培養基中，直至第6天才檢測出微弱的漆酶活性，平均酶活僅為0.16 U/L。

而對整個培養期而言，香菇808產漆酶能力在含馬桑木屑（BM+MS）、青杠木屑（BM+QG）及玉米芯（BM+YMX）的誘導培養基上較馬桑香菇和慶科R20具有明顯優勢，其漆酶活性最大分別達到238.64、288.94和464.06 U/L，且該峰值分別出現在第8天、第10天和第9天。此外，在BM+MS培養基上，慶科R20產酶能力最低，酶活性峰值出現在第11天，達41.75 U/L；在BM+YMX培養基上，所有菌株產漆酶能力均較高，其中最低的是馬桑香菇，酶活性峰值達237.15 U/L，也于培養第11天出現；而在BM+QG培養基上，馬桑香菇菌株較慶科R20先檢測到酶活，但培養8 d后，產酶能力開始略低于慶科R20，最大酶活僅為22.08 U/L比慶科R20峰值（35.82 U/L）低13.74 U/L。在BM+MF培養基中，慶科R20較其他2種菌株產漆酶優勢明顯，并于培養第10天達到峰值，酶活達265.07 U/L；香菇808產酶能力略低于慶科R20，最大酶活峰值于培養第9天出現，酶活達205.44 U/L；馬桑香產酶能力最低，但在培養第6-10天之間快升快降，酶活峰值出現在第8天，達161.83 U/L。

綜上可知，誘導基質相同時，不同香菇菌株液體產漆酶的能力強弱不同，相對菌株馬桑香菇和慶科R20，香菇808在含馬桑木屑、青杠木屑及玉米芯的誘導培養基中液體產漆酶能力最強；而基質麥麩對慶科R20的誘導力更強；馬桑木屑對馬桑香菇的誘導力僅低于香菇808，青杠木屑誘導下，馬桑香菇和慶科R20的產酶能力相當，說明菌株的遺傳差異對漆酶活性大小有影響，同雙因素方差檢驗結果一致。

2.3 不同栽培基質對香菇產漆酶活性的影響

由表3、圖6可知，連續12 d培養中，在4種誘導培養基上同一菌株液體產漆酶活性有差異，且培養基對香菇液體產漆酶活性皆具有極顯著的影響（P＜0.001）。整個培養過程中，菌株馬桑香菇、香菇808和慶科R20在4種不同誘導培養基發酵產漆酶活性均隨培養時間呈現先增后降的趨勢，但出現達到峰值的時間有差異，主要集中在第8-11天之間。

在不同培養階段，4種栽培基質誘導對馬桑香菇產漆酶能力強弱不同，BM+MS、BM+QG培養下，馬桑香菇酶活峰值出現在培養后期（第10天），酶活性分別為108.61和22.08 U/L，且整個培養過程馬桑木屑均表現出強于青杠木屑的誘導力。4種基質中，以BM+MF培養下馬桑香菇漆酶活性變化最為劇烈，且酶活峰值最高，出現在培養中期（第8天），值為161.83 U/L，且在7-9 d酶活遠高于BM+MS培養。而在BM+YMX培養下前10 d，馬桑香菇漆酶活性均較BM+MS、BM+MF培養基低，在第10天后其活性遠高于BM+MF培養基，第11天后略高于BM+MS培養基，酶活峰值出現在培養后期（第11天），酶活為117.81 U/L。

菌株香菇808在整個培養過程中其誘導產漆酶活性表現出明顯優勢的是BM+YMX培養基，其變化峰值出現在第9天，活性為464.06 U/L。而整個培養期，香菇808在培養基BM+MS、BM+QG及BM+MF培養下的產漆酶能力變化趨勢相互交錯（圖6），其酶活峰值分別出現在培養期第8、9和10天，酶活分別為238.64、205.44和288.94 U/L；且在培養前9 d，培養基BM+MS誘導力優勢明顯，培養基BM+QG誘導力最低，培養9 d后，培養基BM+QG誘導力優勢明顯，培養基BM+MS最低。

圖6 不同栽培基質對香菇液體發酵產漆酶活性的影響Fig.6 Effects of different cultivation substrates on laccase production activities of different L. edodes strains

培養過程中，菌株慶科R20在BM+MF培養基產漆酶活性較其他培養基優勢明顯，其次為BM+YMX培養基，其最高酶活性分別為265.07和237.15 U/L。BM+QG和BM+MS分別于培養第6天和第7天后方才檢測出微弱的漆酶活性，且整個培養期兩種培養基的最高酶活僅為35.82和41.75 U/L。

綜上可知，同一菌株在受到不同的栽培基質誘導時，液體產漆酶活性有差異。4種栽培基質中，除青杠木屑外，其他基質均對馬桑香菇產漆酶有較強的誘導力，且基質麥麩對誘導馬桑香菇產漆酶的時間最為集中且反應迅速，但高水平誘導力更持久的是馬桑木屑，而基質玉米芯對香菇808的產漆酶誘導力最強，麥麩對慶科R20產漆酶的誘導力麥麩最強。這表明，栽培基質的差異能直接影響菌株漆酶的分泌情況，同雙因素方差檢驗結果一致。

3 討論

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，主要存在于植物和真菌中，其中植物漆酶主要參與形成木質素，而真菌漆酶的作用則是降解木質素［10］，也是分解木質素的三大酶類中最具代表性的酶類［11-12］。漆酶在食用菌生產中可以直接反映木質素降減情況［13］，間接反映食用菌菌絲活力、產量和品質［14-16］。本試驗以貴州香菇主栽品種香菇808、慶科R20以及貴州特有馬桑香菇為研究對象，初步研究了香菇菌株間的區別性差異及不同栽培基質誘導下3種香菇液體發酵產漆酶活性連續12 d的變化。研究表明馬桑香菇、香菇808和慶科R20雖均同為香菇屬的下屬分支，但菌株間是有區別的，存在一定種源差異。此外，香菇液體產漆酶活性受菌株遺傳差異和不同誘導培養基的影響均為極顯著，但各處理漆酶整體變化規律均呈現先升后降的趨勢。這說明菌株和誘導物的差異僅對漆酶活性大小有影響，但不改變漆酶的變化規律。這一結果在諸多漆酶變化研究中均有體現［17-19］。

3種菌株在培養初期所有處理檢測到的酶活性均較低，慶科R20在兩種木屑誘導培養基上甚至無法檢測到漆酶活性，這除了同菌株間的遺傳差異有關外，很大因素可能是因為香菇菌絲在生長過程中對營養物質吸收順序有一定選擇性造成的。一般來說，香菇菌絲吸收營養物質時，會將淀粉、纖維素、半纖維素先降解吸收，最后才降解木質素［3，20-21］。香菇808作為開發較為成熟且全國栽種廣泛的香菇品種，在含馬桑木屑、青杠木屑及玉米芯的誘導培養基中液體產漆酶能力均是最強，其中以玉米芯誘導力最強，且在含麥麩的誘導培養基上產酶能力也僅低于慶科R20，這說明香菇808對4種基質木質素都有較強的降解能力。慶科R20是低溫型香菇品種，在含麥麩、玉米芯的培養基上產漆酶能力明顯優于兩種木屑培養基，其中基質麥麩對其產漆酶誘導力最強。在以往香菇漆酶的研究中，明確指出漆酶參與香菇生長發育的每一個階段，是香菇生長關鍵酶，其活性越高，香菇轉色時間越早，出菇時間也越早，并且其活性與香菇產量呈顯著正相關［3，14］。這表明香菇808、慶科R20在制種過程中用馬桑木屑或青杠木屑作原料時，香菇808應比慶科R20長勢更佳，但添加玉米芯或麥麩，都是能促進兩種香菇菌絲對木質素的降解吸收的。而馬桑香菇菌株是由生長于馬桑樹上的貴州特有野生香菇選育而來的，其味道比一般香菇更鮮香，營養價值也更為豐富［22-23］，但目前栽培上不管是椴木栽培還是袋料栽培，其主要原料均基于馬桑木材。本文所選4種基質中，除青杠木屑外，其他基質均對馬桑香菇產漆酶有較強的誘導力，且基質麥麩對誘導馬桑香菇產漆酶的時間最為集中且反應迅速，但高水平誘導力更持久的是馬桑木屑，這說明，馬桑香菇對馬桑木屑具有一定的偏好性，栽培基質中適當添加可以提高菌絲體的生長速度和產量，這與徐彥軍等的研究結果一致［24］。而基質麥麩和玉米芯對馬桑香菇產漆酶的誘導力同馬桑木屑差距不大，理論上是可以適量增加這些基質在配方中的占比，從而減少馬桑香菇產業發展對馬桑木材帶來的用料壓力的，但具體用量比例需進一步研究。

4 結論

馬桑香菇、香菇808和慶科R20雖均同為香菇屬的下屬分支，但菌株間存在一定種源差異。此外，香菇液體產漆酶活性受菌株遺傳差異和不同誘導培養基的影響均為極顯著。香菇808在含玉米芯、馬桑木屑及青杠木屑的誘導培養基中液體產漆酶能力均為最強，最大酶活分別為464.06、238.64、288.94 U/L。而麥麩對慶科R20的誘導力更強，最大酶活達265.07 U/L；麥麩對誘導馬桑香菇產漆酶能力短時間內最強，最大酶活達161.83 U/L，但高水平誘導力更持久的是馬桑木屑，最大酶活達108.61 U/L。綜上，從產漆酶水平上看，香菇808、慶科R20和馬桑香菇對4種基質木質素降解吸收能力差異較大，最佳基質分別為玉米芯、麥麩和馬桑木屑。