一株枯草芽孢桿菌降解黃曲霉毒素B1產物分析

唐瓔 黃佳 鄧展瑞 楊曉楠

（甘肅省產品質量監督檢驗研究院，蘭州 730050）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）是一類對肝臟及免疫系統有強抑制性，對人畜有高致癌、致突變、致畸性的真菌毒素［1］。其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是已發現的AFT中毒性及致癌性最強的，1993年國際癌癥研究機構（IARC）將AFB1劃分為I類致癌物［2］。AFB1分子有3個毒性結構，分別是呋喃環雙鍵，香蘭素內脂環和戊烯酮環［3-4］。目前，食品中常用的AFB1吸附方法有物理法，化學法，生物法及基因干預4種方法。生物法去除AFB1效率最高，特異性最強，污染最小。生物利用本身特異性結構或代謝產物吸附、修飾、破壞AFB1毒性分子結構，達到去除毒素的效果［5-6］。

目前對生物降解AFB1產物分析較少，邵帥等［7］分析篩選到的霉菌HSK8降解AFB1后，AFB1熒光減弱，產生新的熒光物質，菌株降解AFB1后產物也具有熒光特性。Samuel等［8］通過氣相色譜質譜聯用儀及傅里葉紅外光譜儀發現惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）降解AFB1后產物產生低毒性化合物AFD1，AFD2和AFD3，菌株降解AFB1結構中呋喃、內脂環和戊烯酮環等結構。Eshelli等［9］發現紅平紅球菌菌株（Rhodococcus erythropolis）降解AFB1途徑是經過脂肪酸代謝和糖發酵積累中間體形成分子式為C13H16O4的芳香族化合物。張曉雪等［10］篩選的新型黑曲霉FS-UV1（Aspergillus Niger FSUVI）降解產物通過動物實驗證明降解產物為低毒性化合物。但是綜上研究對菌株降解產物的結構研究較少，不能明確降解產物的究竟是哪種化合物，以及分子結構，也不能有效分析菌株降解AFB1的機制，且對產物毒性分析研究不足。

本研究以實驗室前期篩選的一株可降解AFB1的枯草芽孢桿菌WTX1（Bacillus subtilis WTX1）為研究對象，利用液相色譜串聯三重四級桿質譜聯用儀（UPLC-MS/MS）及核磁共振氫譜（1H NMR）檢測菌株WTX1降解AFB1產物，兩種方法互相驗證，明確降解產物結構，預測菌株WTX1降解機制，同時進行細胞實驗，評估降解產物對細胞代謝毒性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞來源 實驗室前期采集青藏高原牦牛糞，從中分離出一株AFB1降解率為83.5%（AFB1濃度為10 μg/mL的培養液）的芽孢桿菌屬菌株WTX1，該菌株4℃保藏于營養瓊脂斜面。

L-02（正常人體肝細胞）細胞由中國科學院細胞保存庫傳代保存。

1.1.2 主要試劑

（1）培養基與試劑。胰蛋白胨大豆瓊脂培養基TSA（CM168），胰蛋白胨大豆肉湯 TSB（CM301），磷 酸 緩 沖 鹽 溶 液（phosphate buffer saline，PBS）（CM1022）由北京陸橋提供。RPMI 1640細胞培養基（Cat No：27016021）美國Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Cat No：26140），美國 Gibco；0.05%trypsin-EDTA（Cat No：25300054）美國 Gibco。

（2）UPLC-MS/MS試 劑。 乙 晴（ 色 譜 純，sigma）；二氯甲烷（色譜純，sigma）；甲醇（色譜純，sigma）；苯（色譜純，sigma）。

（3）核磁共振氫譜（1H NMR）：氘代氯仿-D 0.03%TMS（僑怡生物科技（上海）有限公司）。

（4）AFB1標準溶液（色譜純，sigma）；AFB1-MRS/RPMI 1640溶液（濃度10 μg/mL）：將AFB1加入滅菌后的MRS/RPMI 1640培養基中，濃度為10 μg/mL。

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1.1.3 儀器設備 超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜聯用儀（QTRAP 4500），SCIEX；核磁共振波譜儀（AVANCE III 400），瑞士布魯克，蘭州大學功能有機分子化學國家重點實驗室；立式蒸汽滅菌器（LDZF-50KB-II），上海申安醫療器械廠；電子天平（TLE204E102），瑞士梅特勒托利多；恒溫培養箱（MIR-H163-PC），日本松下；超凈工作臺（SWCJ），蘇州安泰空氣技術有限公司；恒溫培養搖床（Stab Mini），上海潤度生物科技有限公司；倒置顯微鏡（TS100），日本尼康；細胞計數分析儀（Vi-CELL XR），貝克曼庫爾特。

1.2 方法

1.2.1 菌株降解液檢測 將純化的WTX1菌株，制備濃度為107CFU/mL菌懸液（PBS，pH7.4），取50 mL接種于500 mL AFB1-TSB培養液中（10 μg/mL），30℃避光發酵72 h后，收集上清液（12 000 r/min，15 min，4℃）。取1 mL上清液，用等體積二氯甲烷渦旋振蕩萃取3次，萃取液在55℃條件下氮吹干燥。用1 mL甲醇（GR）溶解沉淀，0.22 μm有機相濾膜過濾，渦旋混勻進樣。用UPLC-MS/MS方法檢測上清液中殘留的AFB1含量，測量菌株AFB1降解率。利用公式［11-12］：

S：菌株AFB1降解率，%；C：接種菌株發酵一段時間后樣品中剩余AFB1對應峰面積；F：對照樣品中（未接種菌株發酵）AFB1對應峰面積。

1.2.2 UPLC-MS/MS質譜條件 參照唐瓔等［11］方法條件。色譜條件：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱箱溫度：40℃；流動相（乙酸銨/甲醇）液相色譜梯度洗脫。質譜條件：電離方式：電噴霧電離（electrospray i-onization，ESI+）；檢測方式：多反應監測模式（multi-polyreaction monitoring，MRM）；氣簾氣（CUR）：35 psi；碰撞氣（CAD）：medium；離子化電壓（IS）：5 500V；離子源溫度：550℃；噴霧氣（GSI）：55 psi；輔助 加熱器（GS2）：60 psi，以不含AFB1標準溶液發酵液做對照，扣除降解產物圖譜中基質的干擾。

1.2.3 菌株WTX1降解產物分析 優化李文明等［13］方法，取30℃發酵72 h菌株降解AFB1降解液，離心（8 000 r/min，15 min，4℃）分離上清液。上清液前處理同1.2.1中步驟。采用UPLC-MS/MS檢測菌株WTX1降解上清液，采集降解液總離子流圖，將總離子流圖峰值頂點的質譜圖，導入NTST MS search 2.2軟件，降解液中化合物質譜圖與標準質譜圖進行對比，分析降解產物可能的結構，初步預測菌株WTX1的降解機制。

1.2.4 菌株降解產物核磁共振波譜法（1H NMR）檢測 參考楊登輝等［14］方法，取20 μL降解液于玻璃離心管中，加入氘代氯仿-D 0.03%TMS溶液0.5 mL，震蕩均勻，待測。核磁共振條件：測試溫度25℃，以TMS內標物校準化學位移零點，掃描次數=64，譜線寬度=0.4 Hz，采集時間：8 min 50 s，工作頻率為400.14 MHz，光譜寬度為8 023.75 Hz。采用1H NMR法測定AFB1及菌株降解產物譜圖，并用TopSpin軟件扣除產物中AFB1標物圖譜，分析產物中主要物質結構，與UPLC-MS/MS檢測結果做驗證。

1.2.5 菌株降解產物毒性分析 取第一次WTX1菌株降解液，進行二次降解，確保在菌株降解產物進行細胞毒理試驗之前，降解液中無原始添加的AFB1標液殘留量，避免影響評估降解產物的細胞毒性。用UPLC-MS/MS檢測降解液中AFB1含量，降解液中AFB1含量低于檢出限（＜0.03 μg/L）。

1.2.5.1 細胞倍增時間檢測 正常的L-02人體肝細胞倍增時間為20 h，細胞在培養過程中受誘導突變的化合物影響，倍增時間會發生改變，檢測菌株WTX1降解AFB1降解液是否對細胞具有誘變性［15］。參照組：用RPMI 1640培養液培養L-02標準細胞；對照組：AFB1-RPMI 1640溶液（AFB1濃度10 μg/mL）培養L-02標準細胞；試驗組：100 mL RPMI 1640培養液中加入10 mL菌株WTX1降解液培養L-02標準細胞；計算3組實驗中細胞的倍增時間。L-02細胞接種密度為5×104/ cm2，在24 孔板中先每個孔加入有血清的培養物，然后每個孔加入100 μL（細胞濃度0.1×106cells/mL），并且同時接3塊24孔板，分別在37℃，5%CO2，培養3 d，培養第1、2、3天消化計數，以細胞總數為縱坐標，培養時間為橫坐標，計算不同培養物中L-02細胞倍增時間。細胞倍增時間用公式（2）計算［16］。

1.2.5.2 細胞形態分析 在培養第1、2、3天，取接種培養在24孔板的參照組、對照組和試驗組細胞，在顯微鏡下觀察細胞形態，比較3組細胞形態變化。

1.2.5.3 細胞活性分析 利用細胞計數分析儀，在計數的同時，計算活細胞占比，比較參照組，對照組和試驗組3種培養物對細胞活性的影響。

1.2.6 數據處理 實驗結果采用minitab與Excel軟件進行極差、單因素方差分析，每組實驗重復6次，采用單因素方差分析數據間差異，顯著性水平設定為 P＜0.05［17］。

2 結果

2.1 菌株WTX1降解AFB1產物結構

采用UPLC-MS/MS方法，分析菌株WTX1降解AFB1產物成分，降解液總離子流圖中有6個明顯峰值，如圖1所示。將降解液總離子流圖與AFB1標準溶液培養物總離子流圖做對比，用不添加AFB1的發酵液扣除基質影響，AFB1標準品譜圖如圖2所示。根據保留時間及峰值頂點的質譜圖，總離子流圖中第6個峰代表化合物AFB1。其余峰值頂點質譜圖與NTST MS search 2.2軟件標準譜庫做對比，根據保留時間和碎片離子大小，產物1-5與AFB1有若干相同碎片離子，如39，51，63，77等，AFB1標準物質總離子流圖中保留時間5.3 min的峰與菌株降解液總離子流圖中相近時間產物2峰的全質譜圖比較，兩者為不同物質，且無重疊。據此可以判斷，降解液總離子流圖中峰值高的化合物1-5是菌株WTX1降解AFB1的產物，且有較高的同源性。根據NTST MS search 2.2軟件質譜圖對比結果，產物1-5可能的結構如圖3所示，分別是產物1：C3H4，m/z：40.0313；產物2：C6H6，m/z：78.0469；產物3：C7H8O2，m/z：78.0469；產 物 4：C8H6O2，m/z：134.03677；產物5：C11H10O4，m/z：206.057909。

圖1 菌株降解液總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of strain degradation fluid

圖2 AFB1標準物質總離子流圖（A）及質譜圖（B）Fig.2 Total ion flow chromatogram（A）and mass spectrum（B）of AFB1 standard material

圖3 降解上清液提取質譜圖及產物結構圖Fig.3 Mass spectrogram of degradation supernatant extracts and product structure

2.2 菌株降解產物核磁共振波譜（1H NMR）分析

采用1H NMR法測定AFB1及菌株降解產物譜圖，并用TopSpin軟件扣除產物中AFB1標物圖譜，分析產物中主要物質結構，產物結構主要是碳氫單鏈（圖4中結構式1-2），亞甲基（圖4中結構式3），苯環（圖4中結構式4），苯環與呋喃環（圖4中結構式5）。將核磁共振氫譜譜圖結果與UPLC-MS/MS軟件預測結果對比，菌株降解AFB1主要產物結構兩者基本一致，僅產物3結構略有不同，核磁共振氫譜譜圖中C=O位置處多2個-H鍵。核磁共振氫譜譜圖能更好的反應產物結構式，產物結構以核磁共振結果為準。但是UPLC-MS/MS方法可以通過質譜分析離子碎片，佐證降解液中主要產物1-5與AFB1之間離子的同源性，確認降解液中1-5化合物是菌株分解AFB1的產物。

圖4 菌株降解液核磁共振氫譜譜圖及主要物質結構示意圖Fig.4 1H nuclear magnetic resonance spectrum of strain degradation fluid and schematic diagram of main material structures

2.3 預測菌株WTX1降解AFB1機制

通過軟件比對WTX1降解AFB1產物質譜圖，得到5種含量較高產物可能的結構式，在這5種產物結構中不存在AFB1致毒性強的呋喃環雙鍵，香蘭素內脂環和戊烯酮環結構。推測WTX1降解機制是轉化AFB1中致毒性強的結構，達到降解毒素的效果。預測菌株降解AFB1機制如圖5所示，菌株降解AFB1是通過2次裂解完成的，一級裂解是將AFB1結構中香蘭素內脂環（10，11，15位點）和戊烯酮環（14位點）結構直接從AFB1母體上裂解，同時將8，9位的呋喃環結構破壞修飾，形成產物5（C11H10O4）；二次裂解是將產物5中苯環和-C=C-C=O-鏈斷開，形成產物4（C8H6O2）和產物3（C7H8O2）；一二級裂解會產生副產物即產物1（C3H4）和產物2（C6H6）。為驗證AFB1因毒性結構被破壞，達到降低毒性的效果，對WTX1菌株降解液進行細胞毒理試驗。

圖5 預測菌株WTX1降解AFB1機制Fig. 5 Predictive mechanism of strain WTX1 degrading AFB1

2.4 菌株WTX1降解AFB1產物毒性分析

2.4.1 WTX1菌株AFB1降解產物對細胞生長的影響 利用細胞計數分析儀，在培養1 d、2 d、3 d分別對3組實驗進行細胞計數。根據表1所示，實驗組與參照組相比，參照組培養的L-02細胞倍增時間約21 h-22 h，試驗組細胞倍增時間也為21 h-22 h，兩組之間倍增時間無差異性（P＞0.05），細胞增長量無差異（P＞0.05），說明WTX1菌株降解AFB1產物對細胞不具有誘變性。試驗組與對照組相比較，對照組隨培養時間延長，倍增時間增加，細胞增長緩慢，從培養第2天開始，細胞大量凋亡，說明AFB1對細胞有強致毒和變異性；菌株WTX1降解AFB1產物對細胞影響不顯著，達到顯著解毒效果。

表1 降解產物對細胞L-02細胞生長的影響Table 1 Effects of degraded products on the growth of L-02 cells

2.4.2 WTX1菌株AFB1降解產物對細胞形態的影響 在培養1 d、2 d、3 d時，觀察細胞形態，如圖6所示。參照組細胞形態呈上皮樣細胞標準形態，具有橋粒和張力厚纖維。試驗組細胞形態無變化，與參照組培養的L-02細胞一致。對照組細胞生長率減緩，培養第2天，細胞數量無明顯增長，細胞形態變長，有溶解現象，細胞活力變弱。培養第3天，細胞自然凋亡。說明AFB1毒素對細胞毒性很強，能促使細胞變異死亡，而菌株降解AFB1的產物，毒性大大降低，對細胞基本無毒害。

圖6 不同培養基下細胞形態變化Fig.6 Morphological changes of cells in different media

2.4.3 WTX1菌株降解AFB1產物對細胞活性的影響 在培養1 d、2 d、3 d時，根據細胞計數分析儀數據，比較參照組，試驗組，對照組細胞活力。參照組細胞具有較好活力（98%-99%）。試驗組細胞活力很好（98%），與參照組培養的L-02細胞活力相似。對照組細胞活力逐漸減弱，第3 天細胞活力只有23%，細胞在培養過程中逐漸凋亡，如圖7所示。菌株WTX1菌株降解AFB1的產物不影響細胞活力，細胞可以正常生長。

圖7 不同培養基培養細胞活性比較Fig.7 Comparison of cell activities in different media

3 討論

趙春霞等［18］研究AFB1有3個致毒、致變異的結構，分別是呋喃環雙鍵、香豆素內脂環、環戊烯酮結構。本實驗證實菌株降解AFB1，破壞這3個致毒、致畸變結構后，產物毒性減弱，明確菌株WTX1的致毒機理。

Rao等［19］用篩選到的CFR1地衣芽孢桿菌（bacillus licheniformis CFR1）降解AFB1，等到的產物通過HPLC、高效液相色譜法和ESI-MS分析，降解產物熒光消失，證明AFB1被轉化無其他未知物質。本實驗用UPLC-MS/MS檢驗方法延伸Rao等［19］的實驗。檢測采集菌株WTX1降解AFB1產物的總離子流圖和質譜圖，創新用NTST MS search 2.2軟件進行比對，明確產物種類和結構，并分析菌株降解機制，證實菌株將AFB1的3個毒性結構降解，產生小分子化合物，達到降解的效果。

參考張丹楓，楊登輝等［14，20］，利用核磁共振氫譜檢驗手段確定化合物結構，并驗證UPLC-MS/MS質譜結果，結果表明兩者檢測產物結構基本相同，核磁共振氫譜檢驗更準確，但是UPLC-MS/MS質譜可以通過分析質譜離子碎片，溯源降解液中化合物和AFB1化合物之間的同源性，佐證降解液中化合物是AFB1的降解產物。

Samuel等［8］篩選的惡臭假單菌（Pseudomonas putida）降解AFB1產物采用氣相色譜-質譜和紅外光譜檢測后，發現AFB1的脫毒機制是通過呋喃，內脂環的修飾和戊烯酮環丟失，轉化為結構不同且毒性較低的新化合物（AFD1，AFD2和AFD3）。這與本實驗研究的WTX1菌株脫毒機制略微不同。WTX1菌株是通過生物降解AFB1，將致突變結構呋喃雙鍵，香豆素內脂環及戊烯酮環結構破壞，重新成為小分子的化合物。經過細胞毒理試驗，降解后的小分子產物無細胞毒性。

本實驗用L-02細胞為研究對象，驗證菌株WTX1降解AFB1產物對細胞的毒性。因為AFB1毒素對肝臟細胞損害最多［21］，所以研究選用正常人體肝細胞L-02作為實驗對象，更靈敏反應降解產物對細胞的毒性。并且實驗前，進行二次降解，確保前期添加的AFB1無殘留，避免影響降解產物細胞毒理分析。實驗用AFB1降解菌株是前期從青藏高原牦牛糞中篩選到的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該類菌株為食品中常用的發酵菌株，是食品級微生物，相較多數研究篩選的嗜麥芽窄食單胞菌［22］、假蜜環菌［23］、孢霉［24］、紅躥紅球菌［25］及綠色木霉等菌株［26］，本實驗用菌株更具有食品安全性。

Wang等［27］從一株YK-624白腐真菌（Phanerochaete sordida）中純化的錳過氧化物酶，通過降解AFB1的8，9-不飽和碳-碳鍵生成AFB1-二氫二醇，達到脫毒的效果。本實驗篩選到的WTX1枯草芽孢桿菌通過降解AFB1中3個毒性位點結構，產生無毒的降解產物，達到脫毒目的，后期會分離純化菌株及代謝產物，明確菌株脫毒起主要作用的物質。

4 結論

本研究以實驗室前期篩選到的枯草芽孢桿菌WTX1為研究對象，通過UPLC-MS/MS及1H NMR方法，分析菌株降解AFB1產物結構，得到菌株WTX1降解AFB1的機制是通過兩次裂解，破壞AFB1結構中的呋喃雙鍵，香豆素內脂環及戊烯酮環，產生小分子化合物。對降解產物進行細胞毒理實驗，發現WTX1降解AFB1的產物對細胞無致突變性，無毒性。