腐殖酸煤對牛糞好氧堆肥臭氣釋放量及微生物群落多樣性的影響

趙旭 王文麗 李娟

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730070）

好氧堆肥是處理有機固體廢棄物最經(jīng)濟、最有效的方法，其在人為控制的條件下（適宜的碳氮比、含水率、曝氣速率、有機物含量、pH和溫度等參數(shù)），利用自然界存在的微生物降解有機廢棄物，形成穩(wěn)定的高腐殖化物質(zhì)［1］。然而好氧堆肥過程常常釋放大量臭氣，如NH3、揮發(fā)性含硫化合物（VSCs）等，不僅污染了環(huán)境，而且阻礙了有機固體廢棄物堆肥化處理的應(yīng)用和推廣［2-3］。氨氣是惡臭的主要成分，通過控制氨氣揮發(fā)可以降低惡臭，提高堆肥產(chǎn)品的含氮量［4］。堆肥產(chǎn)生的VSCs中占比最大的是H2S，占VSCs總量的39.0%-43.0%，H2S具有臭氣指數(shù)高（1.7×107），低嗅閾值（0.000 7 mg/m3）的特點，對人體及環(huán)境的影響巨大［5-6］。梁美生等［7］通過高溫水熱化學改性與硫酸銅溶液浸漬聯(lián)合對活性炭進行改性，改性后的活性炭對硫化氫具有較好的吸附效果。研究表明添加含碳高的物質(zhì)能夠提高堆肥氮的含量，降低氮素損失［8］。王芳等［9］研究發(fā)現(xiàn)在奶牛糞中添加9%的干雞糞和25%的褐煤能夠促進堆肥腐熟進程，降低氨氣釋放量。孫志華等［10］研究發(fā)現(xiàn)，蘑菇渣牛糞堆肥原料中加入腐殖酸煤，可加快堆肥腐熟，降低氮素損失，增加鉀的累積。西北地區(qū)的腐殖酸煤不僅儲量豐富而且品質(zhì)好，一些礦區(qū)的腐殖酸煤HA（腐殖酸）量達80%以上，在農(nóng)業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。腐殖酸作為一種天然高分子有機物質(zhì)，具有改良土壤、增加土壤團粒結(jié)構(gòu)、改善土壤保水能力等功能［11］。研究發(fā)現(xiàn)，在植物生長過程中，腐殖酸對根系生長的刺激作用是其對植物產(chǎn)生刺激作用的最初動力［12］。在堆肥發(fā)酵過程中，不同時期的功能微生物數(shù)量和多樣性結(jié)構(gòu)變化影響著堆肥基質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，從而對堆肥效果及質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響［13］。然而加入腐殖酸煤后對牛糞堆肥過程臭氣釋放量及微生物群落多樣性的影響研究較少，因此本文以鮮牛糞為原料，對比不加腐殖酸煤與加5%、10%、15%腐殖酸煤對好氧堆肥過程中臭氣釋放量及微生物群落多樣性的影響效果，為進一步開發(fā)利用腐殖酸煤及研發(fā)畜禽糞便的除臭保氮技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用鮮牛糞取自蘭州市紅古區(qū)某奶牛場，主要成分如表1所示。

表1 堆肥原料的主要成分Table 1 Main ingredients of the material composting

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗設(shè)4個處理，分別為：處理1：牛糞；處理2：牛糞+5%腐殖酸；處理3：牛糞+10%腐殖酸；處理4：牛糞+15%腐殖酸；每個處理設(shè)置3個重復。調(diào)節(jié)含水量在58%左右，混料3次使牛糞與腐殖酸煤充分混合均勻，采用槽式堆肥方式，堆體長2.2 m，寬1.8 m，高1.2 m。

1.2.2 測定指標及方法

1.2.2.1 溫度及理化指標的測定 每天上午10：00在堆體25 cm、50 cm的深度測定溫度，取測定溫度的平均值來代表堆肥過程的溫度變化。pH、有機碳、全氮的檢測參考 NY525-2012《有機肥料》中的方法；種子發(fā)芽指數(shù)的檢測參照朱新夢等［14］的方法。

1.2.2.2 氨揮發(fā)的捕獲裝置及計算方法 氨揮發(fā)的捕獲裝置參考袁玉玲的方法改進［15］，主要組件包括 1個圓柱形氣室（高20 cm，內(nèi)徑16 cm，白色，PVC材質(zhì)）、2層圓形吸收海綿（直徑16 cm，厚3 cm，聚氨基甲酸乙酯材質(zhì)。測定時在下層海綿的氨氣吸收層均勻涂布20 mL磷酸甘油混合液（50 mL磷酸+ 40 mL丙三醇，定容至1 000 mL），吸收揮發(fā)的氨氣。下層海綿距管底5 cm高度處，上層海綿與硬質(zhì)塑料管頂端平齊。在堆體的不同位置，分別放置3個通氣法氨捕獲裝置，吸收2 h后取樣。取樣時，將下層的海綿取出，迅速按試驗處理號裝入自封袋中，密封。將吸收氨氣的海綿帶回試驗室后，裝入1 000 mL的廣口瓶中，加300 mL 1.0 mol/L的KCl溶液，振蕩1 h，浸取液中的銨態(tài)氮用流動注射分析儀測定。通過以下公式計算氨氣揮發(fā)量：

式中，f為氨氣排放量［mg/（m2·h）］；C為浸提液中氨氮的含量（mg/L）；V為浸提液的體積（mL）；A為吸收氨氣的海綿的有效面積（m2）；t為采樣時間（h）。

1.2.2.3 硫化氫發(fā)量的測定方法 硫化氫氣體采用靜態(tài)箱法測定參考袁玉玲的方法改進［15］。靜態(tài)箱高14 cm，寬24 cm，長38 cm，在不擾動堆體表面狀態(tài)下罩于堆體上，箱體與堆體用堆料密封。在采樣箱的頂部上設(shè)采氣口，放置2 h后利用便攜式硫化氫探測器檢測氣體。通過如下公式計算硫化氫揮發(fā)量：

式中，f為硫化氫排放量［mg/（m2·h）］；C為靜態(tài)箱中硫化氫的濃度（mg/m3）；V為靜態(tài)箱的體積（m3）；A為靜態(tài)箱與堆體接觸的有效面積（m2）；t為采樣時間（h）。

1.2.2.4 堆肥中微生物群落代謝檢測及數(shù)據(jù)分析 取堆肥樣品5 g，加45 mL無菌生理鹽水，160 r/min下振蕩1 h，靜置后取上清液用無菌生理鹽水稀釋，稀釋濃度為10-3，將稀釋后的上清液接種于Biolog ECO板中，每孔150 μL，每個樣品3次重復，28℃培養(yǎng)，每24 h在Biolog讀書儀上讀取吸光度，連續(xù)測定120 h。

1.2.2.5 平均吸光度變化曲線（average well color development，AWCD） 對Biolog測得的吸光度數(shù)據(jù)進行平均吸光度變化計算，即：AWCD=∑（C-R）/31，其中C為每個孔的吸光度值，R為對應(yīng)孔的吸光度值［16］。

1.2.2.6 多樣性指數(shù)計算 采用培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)計算微生物群落的多樣性指數(shù)。Shannon指數(shù)（H′）用于評估豐富度，H′ =-∑（Pi×lnPi）；式中Pi為有底物的孔和對照孔的光密度值差與整板總差的比 值， 即 Pi=（Ci-R）/∑（Ci-R）。Simpson指 數(shù)（D）又稱優(yōu)勢度指數(shù)，是多樣性方面的集中性度量，D=1-∑（Pi×Pi）；其中Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率［17］。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、制圖，采用 SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同處理堆肥過程中溫度、pH、含水率的動態(tài)變化

由圖1可知，不同處理的堆體溫度變化趨勢各異。各處理堆體升溫速度差異較大，5%處理和10%處理升溫速度比CK處理和15%處理快。5%處理和10%處理在堆肥的第5天和第6天進入高溫期（＞50℃），CK處理和15%處理在第9天和11天進入高溫期。5%處理的高溫持續(xù)時間最長，為25 d，其次為10%處理，持續(xù)時間為23 d；CK處理和15%處理分別為20 d和12 d。綜上所述，從升溫和高溫持續(xù)時間考慮，牛糞初始含水率在58%左右時，添加5%的腐殖酸煤堆肥效果最佳。

圖1 不同處理堆體溫度動態(tài)變化Fig.1 Dynamic variations in temperature under different compost treatments

堆料pH值的動態(tài)變化如圖2所示，不同處理的pH值變化趨勢基本一致，都是先上升后下降，堆肥10 d-30 d，各處理堆料pH值達到最大。堆肥結(jié)束時，各理堆料pH值降到9以下，CK處理最高，為8.95；15%處理pH值最低，為8.42。

圖2 不同處理的堆料pH值動態(tài)變化Fig.2 Dynamic variations in pH value under different compost treatments

堆料含水率的動態(tài)變化如圖3所示，不同處理的含水率變化趨勢基本一致，都是逐漸下降，堆肥第10天后，各處理堆料含水率下降速度加快。堆肥結(jié)束時，各處理堆料含水率在5%處理最低，為39.05%；15%處理下含水率最高，為41.9%。

圖3 不同處理的堆料含水率動態(tài)變化Fig.3 Dynamic variations in moisture content under different compost treatments

2.2 不同處理種子發(fā)芽指數(shù)動態(tài)變化

由圖4可知，在堆肥0-10 d，15%處理的GI值升高速度最快，10%處理次之，5%處理最慢，CK處理的GI值有所降低。堆肥30 d后，各處理堆料的GI值升高速度加快，15%和10%處理的GI值始終大于CK處理和5%處理。堆肥結(jié)束時，加入腐殖酸處理的GI值均大于80%，添加腐殖酸煤處理比CK處理的GI值高6.53%-13.06%。

圖4 不同處理種子發(fā)芽指數(shù)動態(tài)變化Fig.4 Dynamic variations in germination index（GI）of seeds under different compost treatments

2.3 不同處理C/N比的動態(tài)變化

由圖5可知，隨著堆肥的進行，各處理堆料的C/N呈降低的趨勢，各處理堆料C/N在堆肥第20天后下降速度減慢。堆肥結(jié)束時，加入腐殖酸煤處理堆料的C/N均高于CK處理，并且C/N隨腐殖酸煤加入量的升高而升高。CK處理和5%處理的C/N小于20，分別為17.03和18.55。

圖5 不同處理C/N動態(tài)變化Fig.5 Dynamic variations in C/N under different compost treatments

2.4 堆料表面H2S和氨氣濃度的動態(tài)變化

從圖6可以看出，隨著堆肥時間的延長，各處理堆料表面的H2S濃度呈先上升后下降的趨勢。堆肥過程中，加入腐殖酸煤處理的堆料表面H2S濃度明顯低于未加腐殖酸煤的CK處理。各處理H2S釋放濃度的峰值出現(xiàn)時間均在第20天，CK處理最 高 為 2.05 mg/（m2·h），5% 處 理、10% 處 理、15% 處 理 的 峰 值 分 別 為 1.65 mg/（m2·h）、1.42 mg/（m2·h）、1.36 mg/（m2·h）。堆肥過程中 CK 處理的H2S平均釋放濃度最高為1.5 mg/（m2·h），添加腐殖酸煤處理的H2S平均釋放濃度比CK處理低25.17%-45.21%，可見，加入腐殖酸煤可有效降低牛糞堆肥過程中H2S的釋放量。

圖6 堆料表面H2S濃度的動態(tài)變化Fig.6 Dynamic variations in hydrogen sulfide concentration under different compost treatments

從圖7可以看出，隨著堆肥時間的延長，各處理堆料表面的NH3濃度呈先上升后下降的趨勢。堆肥過程中，加入腐殖酸煤處理堆料表面的NH3濃度明顯低于未加腐殖酸煤的CK處理。各處理NH3釋放量的峰值出現(xiàn)時間相同，都在第20天，但是峰值的大小不同，CK處理、5%處理、10%處理、15%處理的峰值分別為 32.32 mg/（m2·h）、23.24 mg/（m2·h）、19.27 mg/（m2·h）、15.94 mg/（m2·h）。CK處理、5%處理、10%處理、15%處理的NH3平 均 釋 放 濃 度 分 別 為 18.5 mg/（m2·h）、14.64 mg/（m2·h）、12.5 mg/（m2·h）、11.14 mg/（m2·h），加入腐殖酸煤處理的NH3濃度比未加腐殖酸煤的CK處理低20.81%-39.74%。可見，加入腐殖酸煤可有效降低牛糞堆肥過程中NH3的釋放量。

圖7 堆料表面NH3濃度的動態(tài)變化Fig.7 Dynamic variations in ammonia concentration under different compost treatments

2.5 添加腐殖酸煤對堆肥中微生物群落代謝活性的影響

由圖8中可以看出，添加腐殖酸處理在各階段的AWCD值明顯高于CK處理。這說明添加腐殖酸后，微生物平均活性顯著增加，并隨著堆肥時間的增加微生物平均活性不斷升高，高溫期的AWCD值增加速度高于堆肥其他時期，表明此階段微生物繁殖迅速，生理代謝旺盛；進入降溫期后，微生物活性增加速度開始下降。當腐殖酸煤添加量高于10%時，AWCD值開始下降；腐殖酸煤添加量在0-10%時，AWCD值隨腐殖酸煤的添加量增加而升高，添加腐殖酸煤處理的平均AWCD值比CK處理高22.27%-28.47%，由此可知，適當?shù)奶砑痈乘崦嚎梢蕴岣叨逊饰⑸锏拇x活性，促進堆肥腐熟進程。

圖8 堆料AWCD值的動態(tài)變化Fig.8 Dynamic variations in AWCD under different compost treatments

2.6 添加腐殖酸煤對堆肥中微生物群落多樣性的影響

發(fā)酵不同時期Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)如圖9、圖10所示，添加腐殖酸煤明顯增加了堆肥過程中的微生物多樣性，在堆肥不同階段微生物群種類增加，演替頻繁，不同的微生物種類進行不同物質(zhì)的轉(zhuǎn)化代謝，從而促進了堆肥腐熟進程。當腐殖酸煤添加量高于10%時，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)開始下降，腐殖酸煤添加量在0-10%時，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)隨腐殖酸煤的添加量增加而升高，添加腐殖酸煤處理的平均Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)比CK處理分別高2.32%-6.06%和23.21%-30.48%，由此可知，適當?shù)奶砑痈乘崦嚎梢蕴岣叨逊饰⑸锏亩鄻有裕龠M堆肥腐熟進程。

圖9 堆料Simpson指數(shù)的動態(tài)變化Fig.9 Dynamic variations in Simpson index under different compost treatments

圖10 堆料Shannon指數(shù)的動態(tài)變化Fig.10 Dynamic variationsin Shannon index under different compost treatments

3 討論

畜禽糞便和作物秸稈堆肥的過程中，銨態(tài)氮會轉(zhuǎn)變?yōu)榘睔鈸]發(fā)，造成超過65%的氮損失［18-19］。堆肥過程中氮素損失既減少了有機肥的肥效，又污染了環(huán)境。因此，農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥過程中如何減少氮素損失，提高肥料質(zhì)量，減少環(huán)境污染一直是研究者們非常關(guān)注的問題［20］。影響堆肥過程中氮素損失的主要因素包括：C/N、pH值、溫度、水分、通風量等。畜禽糞便中的氮含量較高（C/N較低），容重較大，需要與一些碳含量較高、容重較小的廢棄物（如秸稈、木屑、谷殼等）配合，來調(diào)節(jié)其C/N比和容重，可以減少由于氮含量過高或者通氣不良（反硝化作用）造成的氮素損失［21］。蘑菇渣和牛糞的聯(lián)合堆肥時，添加10%的風化煤可以加快腐熟進程，提高堆體升溫速度和有機物料的腐解速度［10］，與本研究獲得的結(jié)果相似。李榮華等［22］研究表明添加風化煤有利于豬糞堆肥的腐殖化過程進行。薛梅［23］研究發(fā)現(xiàn)將羊糞和風化煤、廢棄甜高梁稻桿結(jié)合作為堆肥主要原料，不僅可以減少環(huán)境污染，還可產(chǎn)生質(zhì)優(yōu)價廉的有機肥料。添加可利用形態(tài)的碳，可以促進微生物更迅速地利用NH4+，減少NH3的揮發(fā)損失［24］。研究表明添加木炭能促進堆肥有機物料的降解，加快堆肥腐熟脫毒，增加堆肥產(chǎn)品總氮的質(zhì)量分數(shù)，提高產(chǎn)品質(zhì)量，減少堆肥初期氨氣的揮發(fā)［25］。有學者發(fā)現(xiàn)加土和爐渣可以降低堆肥高溫期水溶性氨氮的濃度，減少氨氣的排放，有利于后期硝態(tài)氮和有機氮的形成，從而降低堆肥中氮素的損失［26］。秦莉等［27］研究表明，堆肥過程中氨氣累積釋放量隨堆料C/N比的升高依次降低。本研究獲得的結(jié)果與以上研究相似，氨氣和硫化氫的釋放量隨腐殖酸煤添加量的升高而降低，添加量為15%時，氨氣和硫化氫的釋放量最低。

堆體溫度是評判堆肥腐熟程度的重要因素［28］。本研究中各處理的高溫持續(xù)時間分別為5%處理25 d、10%處理23 d、CK處理20 d、15%處理12 d，均達到了畜禽糞便無害化衛(wèi)生要求［29］。pH值是堆肥腐熟的又一重要指標，影響堆體內(nèi)微生物的生長繁殖。從pH值變化趨勢可以推斷，添加腐殖酸煤可以抑制堆料酸堿度的升高，由于微生物氨化作用減弱，硝化作用增強，導致堆肥后期pH值下降。適合微生物生存的pH在6.70-9.00之間，過酸或過堿的都會對微生物的生長繁殖產(chǎn)生影響。本研究中腐殖酸煤添加，降低了牛糞的酸堿度，促進了堆肥腐熟進程。研究不同時期堆料的種子發(fā)芽指數(shù)（GI），不僅可以檢測堆料的植物毒性，而且獲得堆料植物毒性隨著堆肥腐熟進程的動態(tài)變化［30］。研究表明，GI是反映堆肥腐熟度的可靠指標，GI大于80%的堆肥產(chǎn)品可以確定為完全腐熟［31］。本研究中添加腐殖酸煤的處理，堆肥結(jié)束時的GI均大于80%，且GI隨腐殖酸添加量的升高而升高，說明鮮牛糞添加適量的腐殖酸煤可以提高堆肥產(chǎn)品的腐熟度。堆肥過程中，隨著堆體質(zhì)量損失和微生物降解作用，堆料總有機碳逐漸減小，使堆料C/N降低［32］。堆肥結(jié)束時，CK和 5%處理的碳氮比分別為17.03和18.55，低于20，符合堆肥腐熟度的要求［33］。10%和15%處理的碳氮比分別為20.96和22.01，高于20，究其原因可能是腐殖酸煤的加入量超過了堆肥過程中總有機碳的減少量，使C/N升高。因此在鮮牛糞堆肥過程中，腐殖酸煤的最佳加入量在5%-10%之間。

研究堆肥腐熟過程中微生物種群組成、數(shù)量以及相互之間關(guān)系，有助于了解堆肥腐熟過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化及保氮技術(shù)。堆肥過程中微生物的生長環(huán)境比較復雜，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)最多能鑒定10%左右的微生物種類［34］。Biolog 微平板技術(shù)可以通過檢測微生物群落的碳代謝來評估環(huán)境樣品的微生物代謝情況［35］。Biolog ECO板有31種碳源和一個空白對照，共96孔。當微生物利用孔中的碳源進行呼吸代謝時，孔中的四唑紫染料會進行還原反應(yīng)，孔的顏色發(fā)生變化。Biolog ECO板技術(shù)操作簡便、靈敏度高，且可最大限度地保留微生物群落原有的代謝特征，常用于環(huán)境微生物活性和功能多樣性的研究［36］。AWCD值也稱為微生物群落代謝剖面，其表示微生物的平均活性，能直觀地體現(xiàn)微生物群落反應(yīng)速度和最終達到的程度［37］。Biolog ECO研究中，計算多樣性指數(shù)能夠從不同側(cè)面反映微生物群落代謝功能的多樣性［38］。蔡涵冰等［39］研究發(fā)現(xiàn)不同好氧堆肥時期具有不同的微生物群落多樣性。本研究中添加腐殖酸煤處理的AWCD值、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)均有所升高，因此推斷適量添加腐殖酸煤可增加了堆肥過程中的微生物多樣性，在堆肥不同階段微生物群種類增加，演替頻繁，不同的微生物種類進行不同物質(zhì)的轉(zhuǎn)化代謝，從而促進了堆肥腐熟進程。

4 結(jié)論

鮮牛糞堆肥過程中添加5%-10%的腐殖酸煤，可提高堆肥微生物的多樣性指數(shù)以及堆肥產(chǎn)品的種子發(fā)芽指數(shù)，降低NH3和H2S釋放量20.82%-39.74%和25.17%-45.21%。添加適量的腐殖酸煤可以促進堆肥微生物種群演替，加快對不同物質(zhì)的轉(zhuǎn)化代謝，促進堆肥腐熟進程，提高堆肥產(chǎn)品質(zhì)量。