表達非洲豬瘟病毒CD2v與P12蛋白的重組偽狂犬病毒的構建

梁旺旺 李成龍 陳文智 豐志華 蔡少麗 陳騏

（福建省天然免疫生物學重點實驗室 福建師范大學南方生物醫學研究中心，福州 350117）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家豬及野豬引起的一種急性、出血性、烈性傳染?。?］。該病于1921年在肯尼亞首次報道，迄今已成為全球性豬養殖業難題，其致死率約為100%［2］。2018年8月，我國遼寧省沈陽市出現首例國內非洲豬瘟病例，至今疫情已擴散至全國［3］。

ASFV為雙鏈DNA病毒，病毒顆粒直徑約200 nm，具有多層結構，由類核、核殼、內包膜、衣殼和宿主衍生的外包膜組成［4］。根據毒株的不同，基因組大小介于170-190 kb之間，含約150個開放閱讀框（ORFs），至少可編碼54個結構蛋白和100多個非結構蛋白［5］。ASFV CD2v與宿主的CD2結構與功能類似，主要參與ASFV的免疫逃逸，以及感染細胞后對紅細胞的吸附［6］。在弱毒活疫苗研發過程中CD2v通常被刪除，研究表明缺失CD2v后的毒株接種家豬后無明顯臨床感染癥狀，可以保護強毒攻擊［7］。與CD2v不同，P12位于外囊膜及內囊膜上，目前P12被認為是ASFV與宿主細胞結合的配體，用重組P12蛋白孵育細胞后體外感染被阻斷，且針對P12的抗體被證明阻礙了病毒與宿主細胞的結合，但并不能完全抑制病毒結合或中和病毒感染，因此它不是導致病毒對細胞結合的唯一配體［8］。CD2v與P12通常被用作DNA疫苗、亞單位疫苗和病毒載體疫苗的研發，研究表明將CD2v與P12蛋白通過哺乳動物細胞和桿狀病毒載體表達系統表達后制成亞單位疫苗，或將CD2v與P12制成DNA疫苗或病毒載體疫苗對豬進行接種，可檢測到體液免疫反應和細胞免疫反應［9-11］。但目前并無商業化疫苗用于預防ASF，其疫苗的研發需要更多的探索。

偽狂犬病也稱奧耶斯基氏?。ˋujeszky’s disease），由偽狂犬病毒感染引起，給世界豬養殖業造成了巨大的經濟損失。偽狂犬病毒（PRV）屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科水痘病毒屬［12］。其基因組為約145 kb的雙鏈DNA，呈現圓形的完整病毒顆粒直徑在150-180 nm之間，核衣殼直徑約為110 nm［13］。其基因組中含有大量復制非必須基因，如TK、gI與gE等，這些基因通?？杀煌庠椿蛉〈?，從而構建活病毒載體疫苗［14-15］。該研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功構建了TK及gI缺失且重組表達ASFV CD2v與P12的重組弱毒株PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v），我們對該重組毒株遺傳穩定性及安全性進行了評估，為將來研發預防非洲豬瘟及偽狂犬多價疫苗提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒細胞毒株動物 pX459質粒購自Addgene，大腸桿菌（E. coli Trans 5α）購自北京全式金生物技術有限公司；PRV-Fa經典病毒株由福建省農業科學院提供；同源重組質粒pcDNA3.1-PRV-TKCD2v與pcDNA3.1-PRV-gI-P12由武漢金開瑞生物工程有限公司合成；人胚腎上皮細胞（HEK293T）與非洲綠猴腎上皮細胞（Vero）均購自ATCC（American Type Culture Collection）；ICR（Institute of Cancer Research）小鼠購自吳氏實驗動物貿易有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 2 × Phanta Max Master Mix聚合酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Lipofectamiane 2000 轉染試劑購自美國Life Techology；鼠源His（組氨酸）單克隆抗體與鼠源FLAG單克隆抗體購自北京全式金生物技術有限公司；羊抗鼠IgG購自英國Abcam；800 CW donkey anti-mouse Ab購自武漢三鷹生物技術有限公司；Gbico胎牛血清購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Opti MEM 培養基購自Life Techology。

所用的儀器包括PCR儀 2720型（美國ABI公司）；NanoDrop 微量分光光度計（賽默飛世爾科技公司）；Bio-Red凝膠成像系統（伯樂生命醫學產品有限公司）；雙色紅外激光成像儀（美國LI-COR公司）；槽式蛋白轉膜儀（美國Hoefer公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 通過https：//zlab.bio/guidedesign-resources網站設計針對PRV病毒TK及gI基因的sgRNA序列（見表1），由浙江尚亞生物合成。

表1 靶向CD2v與p12基因的sgRNA序列Table 1 sgRNA sequences targetting CD2v and p12 gene

1.2.2 表達非洲豬瘟病毒CD2v和P12的重組偽狂犬病毒的構建

1.2.2.1 敲除載體的構建 將sgRNA退火，把退火產物與BpiI酶切后的pX459質粒連接，轉化至大腸桿菌中，提取質粒進行擴增，獲得敲除載體。

1.2.2.2 重組載體pcDNA3.1-PRV-TK-CD2v與pc-DNA3.1-PRV-gI-p12的合成 從NCBI獲取CD2v基因與p12基因序列，在CD2v基因序列前分別加入 EF1α（elongation actor 1 alpha） 啟 動 子，CMV（Cytomegalovirus）增強子，CMV啟動子和綠色熒光蛋白（EGFP）序列；在p12基因序列前分別加入EF1α啟動子，CMV增強子，CMV啟動子和能表達紅色的mCherry蛋白序列，并通過武漢金開瑞生物工程有限公司分別合成在pcDNA3.1質粒上，酶切位點分別為EcoR V，BamH I；EcoR V，Hind III。

1.2.2.3 重組病毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的構建 分別以pcDNA3.1-PRV-TK-CD2v 與pcDNA3.1-PRV-gI-p12為模板通過PCR分別克隆出包含同源臂的EGFP-CD2v與mCherry-P12的基因片段；將純化后的片段與敲除載體共轉染至HEK293T細胞并接種PRV，待細胞病變至80%時，收獲細胞與上清，放置4℃待用。在Vero細胞中通過噬斑篩選獲得F0代重組病毒，經過4輪噬斑篩選，最終在Vero細胞中擴增并純化出陽性率為100% 的PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）重組病毒株。圖1為重組病毒PRVΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）構建示意圖。

Fig.1 重組毒株PRV-△gI-（p12）-△TK-（CD2v）構建示意圖Fig.1 Schematic diagram of constructing recombinant strain（PRV-△ gI-（p12）-△ TK-（CD2v））

1.2.3 重 組 毒 株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v） 的Western blot和熒光鑒定

1.2.3.1 重 組 毒 株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的Western blot分析鑒定 在1×106個Vero細胞中接種1×103TCID50重組病毒，共培養36 h后提取總蛋白，用1 mL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗殘余的培養基，加入80 μL蛋白質裂解液，用無菌細胞刮刀將細胞從培養皿中刮下，轉移至1.5 mL離心管，冰浴15 min，14 000 r/min離心10 min，吸取上清，取1 μL上清用于蛋白質濃度測定，剩余上清與5×SDS Loading Buffer混合，98℃變性5 min；進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%BSA室溫封閉2 h，TBST清洗3次后與鼠源His單克隆抗體和鼠源flag單克隆抗體分別4℃孵育8 h，TBST清洗3次后孵育二抗，TBST清洗3次后掃膜鑒定。

1.2.3.2 重 組 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的熒光鑒定 共聚焦皿中加入2×105個Vero細胞，并接種1×103TCID50的重組病毒；共培養36 h后在共聚焦顯微鏡下觀察熒光。

1.2.4 重組病毒 PRV-ΔgI-（p12）- ΔTK-（CD2v）生物學特性分析

1.2.4.1 重組病毒 PRV-ΔgI-（p12）- ΔTK-（CD2v）的遺傳穩定性測定 將重組病毒在Vero細胞上增殖30代，分別取10、20和30代細胞培養液上清，提取基因組，并用驗證引物擴增，判斷CD2v和P12能否在重組病毒中穩定存在。

1.2.4.2 重 組 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）一步生長曲線測定 將重組病毒與野生型PRV病毒各取1×103TCID50分別接種至1×106個Vero細胞，分別在接種后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h收獲培養上清及細胞并進行滴度測定。將收獲的病毒液按10倍梯度稀釋（10-1-10-7）并接種至1×106個Vero細胞中，共培養48 h后用4%的多聚甲醛固定細胞，用結晶紫染色統計噬斑并計算滴度繪制一步生長曲線。

1.2.5 重組毒株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的安全性驗證

1.2.5.1 重 組 毒 株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的生存曲線測定 30只ICR小鼠分成3組，每組各10只。在適應性飼養7 d后，第1組在小鼠右后腿肌肉注射100 μL的生理鹽水，第2組在小鼠右后腿肌肉注射100 μL滴度為1×105TCID50的重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v），第 3 組在小鼠右后腿肌肉注射100 μL滴度為1×105TCID50的野生型病毒PRV-Fa，連續觀察15 d后繪制生存曲線。

1.2.5.2 蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining） 用4%多聚甲醛固定小鼠組織12 h，用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和無水乙醇各處理30 min，后用乙醇和二甲苯1∶1混合透明處理，用二甲苯代替組織中的乙醇。組織用石蠟和二甲苯1∶1混合處理，然后植入石蠟中。將組織切成7 μm薄片，HE染色，后用顯微鏡進行形態學觀察。

2 結果

2.1 重組質粒pcDNA3.1-PRV-TK-CD2V和pcDNA3.1-PRV-gI-P12的PCR鑒定及EGFPCD2V與mCherry-P12基因片段的純化

以重組質粒為模板，使用表2中的引物3.1-P12與3.1-CD2V進行PCR擴增并純化得到片段，其結果與目的基因大小相符，如圖2-A所示。

2.2 重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的PCR鑒定

分別以野生型病毒PRV-Fa和重組病毒PRVΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的基因組為模板，用表2中的引物PRV-TK和PRV-gI進行PCR擴增，結果與片段大小相符，如圖2-B所示；針對重組病毒的左右同源臂設計引物，分別以野生型病毒PRV-Fa和重組病毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的基因組為模板用表2中的引物進行PCR擴增并測序，判斷插入位點，如圖2-C-D所示。結果表明，CD2v與p12的片段均已插入到PRV的基因組中。

圖2 同源重組片段制備及重組位點驗證Fig.2 Preparation of homologous recombinant fragment and verification of recombination sites

表2 PCR擴增引物與驗證引物Table 2 PCR primers for amplification and verfication

2.3 重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）遺傳穩定性測定

將重組病毒 PRV-ΔTK-（CD2v）-ΔgI-（p12）接種在Vero細胞中傳30代，取第10、20、30代細胞培養上清，富集病毒并提取基因組。用驗證引物擴增CD2v與p12，結果顯示均能擴增出目的基因，表明p12與CD2v基因能夠穩定存在于重組毒株基因組中（圖3-A）。

2.4 重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）western blot鑒定

在感染了重組毒株PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的Vero細胞中CD2v與P12均有表達，而感染PRVFa的Vero細胞中未檢測到CD2v與P12條帶。并且我們發現感染 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）中CD2v有3條帶，分別為26 kD C端截短形式；45 kD非糖基化全長形式；89 kD 糖基化全長形式存在，如圖3-B。這些結果說明CD2v與P12穩定表達的同時，ASFV的入侵對于CD2v的糖基化是非必須的。

2.5 重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的熒光鑒定

將野生型病毒PRV-Fa與重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）分別接種到Vero細胞中，培養24 h，通過熒光共聚焦顯微鏡檢測，研究發現接種野生型PRV-FA的Vero細胞無任何熒光，而接種重 組 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v） 的 Vero細胞中有綠色和紅色熒光如圖3-C。

圖3 遺傳穩定性鑒定Fig.3 Identification of genetic stability

2.6 重組毒株PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）一步生長曲線測定

用 Vero細胞測試了 PRV-Fa 與 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）一次性增殖曲線，如圖4-E所示，重組 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v） 在 Vero 細胞中增殖能力明顯弱于強毒株PRV-Fa。

2.7 重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的安全性評估

為了評估重組病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的生物安全性，我們用PRV-Fa與PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）兩株病毒對小鼠進行接種，如圖4-F所示，接種 PRV-Fa 組小鼠在接種第4天全部死亡，而接種 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）組小鼠觀察至15 d未見死亡。此外，我們還觀察到接種PRVFa組小鼠第3天開始出現嚴重的瘙癢，而在小鼠右后腿肌肉注射接種接種PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）組小鼠未見瘙癢癥狀，表明重組毒株安全性良好，對小鼠不具致死能力。

圖4 重組病毒一步生長曲線與小鼠生存曲線Fig.4 One-step growth curve of recombinant viruses and mice’s survival curve

2.8 小鼠病理學評估

將接種PRV-Fa與PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）兩株病毒的小鼠與空白小鼠器官進行HE染色，HE染色顯示小鼠的心臟、肝臟和腎臟無明顯變化，如圖5-A、B和5-E所示。感染PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）小鼠脾臟組織淋巴細胞增殖明顯，而PRVFa組與空白組無明顯差異，如圖5-C。PRV-Fa可導致肺部腫大與誘導腦內炎性細胞浸潤，而對其他兩組感染組則無明顯影響，如圖5-D和5-F。以上結果表明，PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的毒力與PRV-Fa相比毒力減弱，同時也可以能激活免疫應答，引起免疫細胞增殖。

圖5 小鼠組織病理學切片Fig.5 Histopathological sections of mice tissues

3 討論

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒感染引起的一種急性、出血性、烈性傳染病。該病是我國重點防范的一類動物疫?。?］。2018年8月，遼寧省沈陽市出現首例國內非洲豬瘟病例，至今疫情已擴散至全國［3］。我國為豬養殖與消費大國，豬出欄量、存欄量以及豬肉的消費量均位于全球首位，每年種豬及豬肉制品進口總量巨大，與多個國家貿易頻繁，ASF帶來的直接以及間接損失不可估量。

目前，針對非洲豬瘟疫苗制備已進行了多方面的嘗試，如構建了滅活苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、病毒活載體疫苗與DNA疫苗等，但均未商業化［16］。其中利用天然分離或敲除毒力基因的ASFV弱毒和減毒活疫苗的免疫原性較好，研究進度較為樂觀，但弱活疫苗安全性一直飽受詬病，需要綜合評價毒株的不良反應與持續性感染等安全風險，并且需要大量的臨床實驗［17］。基因工程疫苗、ASFV亞單位疫苗、核酸疫苗，在安全性、鑒別診斷等方面優勢明顯，但由于ASFV基因組龐大和免疫逃逸機制復雜，需要在充分解析ASFV主要蛋白結構與功能、感染與免疫機制上進行更全面的研究［18-19］。

CD2v與P12為非洲豬瘟病毒囊膜蛋白，其中CD2v參與非洲豬瘟病毒的免疫逃逸，是晚期表達蛋白。CD2v蛋白與T細胞表面黏附因子CD2具有相似性，且CD2v與C型凝集素蛋白為ASFV重要保護性抗原［20］。P12參與病毒的附著過程，純化的P12蛋白會與宿主細胞結合可阻止病毒與細胞的結合。因此，若能阻斷CD2v及P12的功能則可提高宿主抗病毒能力及削弱病毒侵染能力［8］。CD2v與P12免疫源性強，其作為亞單位疫苗、DNA疫苗與病毒載體疫苗免疫后可誘導體液免疫應答及細胞免疫應答。而利用桿狀病毒作為載體，表達CD2v的重組疫苗免疫豬后產生了抗體，并且攻毒后全部存活［21］。

PRV已被廣泛應用于病毒載體疫苗的研發，其主要蛋白的功能已有較為全面的了解，并同時可誘導機體產生免疫應答。TK基因為PRV主要毒力基因，TK基因的缺失可顯著降低PRV對神經細胞的侵襲性和豬的致病性，但免疫原性不受影響［22］。gI為PRV增殖過程中的非必須基因，通常在構建PRV弱毒活疫苗的過程中將其刪除，gI的刪除可降低病毒侵染能力使弱毒活疫苗更加安全［15，23］。目前，以PRV作為載體所研發的活病毒載體疫苗主要有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒-豬偽狂犬病病毒重組疫苗［24］、豬圓環病毒 II 型-豬偽狂犬病病毒重組疫苗與豬瘟病毒-豬偽狂犬病病毒重組疫苗等［25］。本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術，利用PRV作為載體分別將ASFV CD2v與p12分別插入至PRV TK與gI中構建了重組表達ASFV CD2v及P12蛋白的重組毒株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）。CD2v與P12為非洲豬瘟病毒囊膜蛋白，這兩種蛋白作為ASFV的重要抗原已被人證實安全有效。在用作亞單位疫苗與DNA疫苗時均能產生特異性抗體。本研究通過PRV活載體在vero細胞中成功表達出CD2v與P12，并且CD2v中還存在幾種CD2v糖基化亞型。因此，CD2v的糖基化可能不依賴于ASFV的感染。而缺失的TK與gI基因則使得PRV的毒力降低，大大提高了安全性。通過小鼠器官HE染色發現與野生型毒株相比缺失TK與gI的毒株不引起小鼠腦部炎癥與肺部腫大，但會引起小鼠脾臟的淋巴細胞增殖。這表明該重組病毒成功激活了小鼠的免疫系統。

本研究首次通過PRV為載體構建了表達非洲豬瘟病毒CD2v與P12蛋白的重組偽狂犬病毒，該重組毒株遺傳性狀穩定CD2v及P12可穩定表達、體外增殖能力良好、毒力弱、具有較好的安全性，其將為ASF及PR多價疫苗研發做鋪墊。但還需要更多實驗來驗證該毒株是否可作為候選疫苗株，如驗證該毒株在豬體內的有效性及可能存在的副作用。

4 結論

成功構建了表達非洲豬瘟病毒CD2v與P12蛋白的重組偽狂犬重組毒株，該重組毒株毒力弱安全性良好，該研究將為ASF疫苗研發提供新的借鑒。