豬乳外泌體對豬流行性腹瀉病毒的抑制作用

陳婷 謝梅英 魏立民 歐陽坤 程曉 張永亮

（1. 海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海口，571100；2. 生豬種業中心 廣東省動物營養調控重點實驗室 華南農業大學動物科學學院，廣州，510642；3. 廣東生態工程職業學院，廣州，510520）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是引起豬腹瀉的主要病原之一，對仔豬的致死率高達100%，給養豬業造成巨大經濟損失。截止目前，豬流行性腹瀉的治療尚無特效藥，生產中以綜合性預防手段為主［1］，研究顯示，仔豬可從乳中獲得母源抗體而得到被動免疫保護，黏膜免疫在抵抗腸道病毒PEDV的感染中發揮重要作用，可誘導產生分泌型IgA（sIgA），有效抵御病毒入侵［2］。

Exosome是一類由內吞作用形成的膜上小囊泡，可通過融合多泡體（multivesicularbodies，MVB）而釋放到細胞外環境［3］，在透射電鏡下呈圓形或杯狀磷脂雙分子層結構，直徑為40-100 nm［4-5］。研究顯示，exosome可攜帶細胞特異性生物分子，如miRNA、mRNA、DNA和蛋白質，并分泌出細胞［6］，人和牛乳汁exosome中的mRNA、miRNA可以轉運進入免疫細胞，并潛在地調控免疫細胞功能［7-8］。同時，包裹在外泌體中的乳汁miRNA可以穩定的抵抗人類消化系統的惡劣環境，并滲透進腸上皮Caco-2細胞單層屏障到達血液循環，最終作用于細胞功能［9］。人乳exosome可以抵抗消化進而被腸細胞吸收，最終在細胞核的位置發揮作用影響基因表達［10］。本課題組在2016年報道了豬乳exosome可能通過其包裹的miRNAs、mRNAs及蛋白質等組分，調控相應的基因和蛋白表達，最終促進腸道上皮細胞增殖［11］。同樣，Alison等［12］也報道了大鼠乳exosome可以增強IEC-18細胞的活力，促進增殖，刺激腸干細胞活性。然而，至今仍未見乳exosome在腸道細胞上調控PEDV病毒的報道。因此，本研究擬從細胞水平上探索豬乳exosome對PEDV的抑制作用，并進一步對其作用方式和作用途徑進行解析，以確定豬乳exosome對仔豬的腸道保護功能，為進一步揭示乳生物學功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

仔豬小腸上皮細胞 IPEC-J2完全培養基：DMEM/F12培養基+10%胎牛血清+5 ng/mL EGF +5 μg/mL 胰島素+1%雙抗（由四川農業大學陳代文老師實驗室饋贈）。

1.2 方法

1.2.1 PEDV的繁殖 Vero E6細胞（非洲綠猴腎上皮細胞系，本實驗室已保存）：DMEM+100單位/mL青/鏈霉素+10%胎牛血清FBS。PEDV CV777由本校生豬種業工程中心實驗室提供。

將保存的PEDV（strain CV777）毒株用含2.5 μg/mL胰酶的無血清DMEM稀釋1 000倍后，接種至長成單層培養的非洲綠猴腎細胞系（Vero E6），37℃吸附2 h后，加入含2%血清的DMEM在37℃、5% CO2培養箱繼續培養，72 h后收毒。將含有病毒液的細胞瓶置于-20℃冰箱，待病毒液結冰后，放置室溫，等完全融化后，再置-20℃冰箱，反復凍融3次。收獲的病毒懸液1 000 r/min離心10 min去除細胞碎片，收集病毒液上清，分裝后，-80℃保存備用。

1.2.2 豬乳exosome提取 收集10頭未免疫豬流行性腹瀉病毒疫苗的健康長白母豬分娩后0-5 d內乳汁200 mL，2 000×g，4℃，30 min離心收集上清，除去乳脂蛋白和乳腺細胞碎片后；將收集到的乳清按12 000×g，4℃，離心30 min，收集上清，去除乳脂蛋白、酪蛋白和其他細胞碎片；將收集到的乳清按110 000×g，4℃，進行超高速離心2 h，去除上清部分，獲得豬乳外泌體并存于-80℃備用。

1.2.3 結晶紫檢測

（1）IPEC-J2細胞分別按照2.5×104/cm2密度接種于24孔板，每組10個重復；按下述3種處理方式處理完后，吸去并棄掉培養基，PBS涮洗2次；每孔加入500 μL 10%甲醇，靜置 2 min，棄掉甲醇溶液，并晾干；每孔加入200 μL結晶紫染液，靜置10 min；輕輕甩去染液，PBS洗滌2次后，倒置于吸水紙上吸干水分，置于顯微鏡下觀察拍照；拍照結束后，每孔加400 μL 33%的醋酸脫色，充分溶解后，每孔取200 μL在570 nm處測定光吸收度。

（2）將細胞分為PEDV組（對照組）和PEDV +exosome組（實驗組），豬乳exosome按照預防、殺毒及感染后修復3種目的處理細胞，具體設計要求如下。

Group1（預防作用）：實驗組先添加含2.5 mg總蛋白的豬乳exosome（以蛋白質含量為計量單位，下同）處理細胞24 h，再用0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2細胞2 h；對照組先添加與豬乳exosome等體積的DMEM/F12培養基處理細胞24 h，再用0.1 MOI PEDV 感染細胞2 h，處理完72 h 后檢測（感染前添加）。

Group2（殺毒作用）：實驗組先進行等體積包含2.5 mg總蛋白的豬乳exosome與0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2細胞，混合后室溫靜置10 min，感染細胞2 h；對照組進行等體積的DMEM/F12培養基與0.1 MOI PEDV感染IPEC-J2細胞，混合后室溫靜置10 min后感染細胞2 h，處理完72 h 后檢測（同時添加）。

Group3（修復作用）：實驗組先用0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2細胞2 h，再添加包含2.5 mg總蛋白的豬乳外泌體處理72 h 后檢測；對照組先用0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2細胞2 h，再加入與豬乳exosome等體積的DMEM/F12培養基處理72 h 后檢測（感染后添加）。

1.2.4 MTT檢測 仔豬小腸上皮細胞IPEC-J2按照2.5×104/cm2密度接種于96孔板，每組12個重復；待細胞完全貼壁后生長至融合度50%-60%時，添加處理物進行處理；待細胞長至預設時間點時每孔加MTT溶液20 μL，繼續孵育4 h，終止培養并吸棄孔內培養上清液。每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分融解，570 nm波長測定各孔光吸收值。

1.2.5 絕對定量PCR檢測PEDV基因在細胞中的復制情況 通過Primer 5軟件設計病毒及其他基因定量引物，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

檢測方法如下：（1）分別在上述引物的5′端加入Nhe I、Xba I酶切位點和保護堿基序列，并用上述引物擴增PEDV中對應基因片段；（2）將所得上述基因片段同源重組至pUC19載體，通過DH5α大腸桿菌擴增質粒，試劑盒提取質粒，并測定質粒濃度，按照“每μL中質粒拷貝數=（質量/分子量）×（6.0×1023）=［質粒濃度（μg/μL）× 1 μL］× 10-6÷［（pUC19載體堿基數+插入片段堿基數）×660］×（6.0×1023拷貝數 /mol）”計算質粒拷貝數（注：每個堿基的平均分子量為330，載體為DNA雙鏈結構）；（3）按照梯度稀釋標準品質粒pUC19，通過定量PCR計算基因拷貝數和CT值之間的標準曲線；（4）提取樣本中病毒RNA，通過絕對定量PCR檢測相關基因在不同處理間拷貝數的差異。

1.2.6 蛋白質檢測（Western blot）方法 首先提取細胞或上清樣本中蛋白質，并采用BCA Protein Assay Kit試劑盒測定蛋白濃度（ThermoFisher，美國）。按20-30 μg蛋白質濃度進行Western blot檢測。具體步驟如下：（1）樣品95℃變性10 min后上樣至12% SDS-PAGE膠內，濃縮膠電流90 mA，20 min后轉電流110 mA，90 min直至分離膠底部；（2）180 mA，70-150 min恒流中將蛋白轉至PVDF膜上（時間視轉印蛋白分子大小而定）；（3）TBST 洗滌膜5次，每次5 min 之后，采用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1.5-2 h；（4）將封閉后的PVDF膜置于目的一抗反應液中4℃孵育10-16 h；（5）TBST洗滌膜5次，每次3-5 min后進行室溫二抗液中孵育1-2 h；（6）用TBST 洗滌膜5次，每次3-5 min；最后置于發光液中浸泡5 s，并采用Alpha多色熒光和化學發光凝膠成像系統中呈像。所用PEDV N蛋白及CLND 1 蛋白一抗均購自CST（ThermFisher，美國）。

1.2.7 數據統計 所有數據均采用SPSS 17.0進行分析，Duncan法進行多重比較，兩兩比較采用t-test檢驗方法。

2 結果

2.1 豬乳exosome抑制PEDV對IPEC-J2細胞活力的影響

2.1.1 細胞表型顯微鏡觀察 顯微鏡觀察結晶紫染色后細胞狀態顯示，在3種不同處理方式下，對照組細胞呈現空泡狀，數量明顯減少，且活細胞數量較少（藍色部分，圖1左）；而處理組添加豬乳exosome處理后，各組細胞布滿視野，細胞數量和存活率明顯高于對照組（藍色部分，圖1右）；提示豬乳exosome能夠抑制PEDV病毒對細胞的感染能力，且不受作用方式的影響（即乳外泌體添加順序）。

圖1 結晶紫染色細胞形態學觀察Fig. 1 Crystal violet staining and cell morphology observation

2.1.2 結晶紫染色統計 為確定豬乳exosome抑制PEDV對細胞的感染效果，在細胞表型觀察結果基礎上進一步進行細胞存活數定量分析，結果顯示，在IPEC-J2細胞中，豬乳exosome與PEDV處理的3種方式均顯著抑制PEDV對細胞的感染，增加細胞存活力（P＜0.05）（圖 2）。

圖2 細胞存活力統計Fig. 2 Cell survival activity statistics

2.1.3 MTT檢測結果 經MTT法檢測PEDV對細胞活力的影響，結果（圖3）表明在IPEC-J2細胞中，豬乳exosome與PEDV作用的3種處理方式均顯著抑制PEDV對細胞活力的影響（P＜0.05），提示豬乳外泌體可增強IPEC-J2細胞活力，抑制PEDV對細胞的感染。

圖3 MTT檢測細胞活力Fig. 3 Cell activity detected by MTT

2.2 豬乳exosome抑制PEDV在IPEC-J2細胞中的復制

為探索豬乳exosome抑制PEDV對IPEC-J2細胞感染的機理，采用絕對定量分析3種處理方式下，IPEC-J2細胞中PEDV相關基因的表達水平。結果顯示，在3種處理方式下豬乳exosome均極顯著下調PEDV 病毒 M（圖 4-A）、N（圖 4-B）、ORF3（圖 4-C）、Spike（圖 4-D）、RNA polymerase（圖 4-E）和 E（圖4-F）蛋白等基因在IPEC-J2細胞中的表達量（P＜0.01），提示豬乳exosome可能通過抑制PEDV病毒相關基因在IPEC-J2細胞內表達，從而降低PEDV在細胞內的復制。

圖4 豬乳exosome對PEDV相關基因在IPEC-J2細胞內表達的影響Fig. 4 Expressions of PEDV-related genes treated with porcine milk-derived exosome in IPEC-J2 cells

2.3 豬乳exosome抑制PEDV在細胞上清中的復制

同樣，對各處理組細胞上清中的PEDV病毒相關基因絕對定量結果顯示，3種處理方式下，細胞上清中PEDV病毒的M（圖5-A）、N（圖5-B）、ORF3（圖 5-C）、Spike（圖 5-D）、RNA polymerase（圖5-E）和E蛋白基因（圖5-F）的表達量也極顯著下調（P＜0.01），提示豬乳exosome還可在細胞外抑制PEDV病毒相關基因表達，減少病毒對IPEC-J2細胞的感染。

圖5 豬乳exosome對PEDV相關基因在IPEC-J2細胞上清中表達的影響Fig. 5 Expressions of PEDV-related genes treated with porcine milk-derived exosome in IPEC-J2 cells supernatant

2.4 豬乳exosome抑制IPEC-J2細胞凋亡基因及PEDV N蛋白表達

蛋白表達水平檢測PEDV感染的標志性N蛋白及細胞凋亡相關的CLDN1蛋白，結果顯示，在3種不同處理方式下，豬乳exosome均明顯抑制PEDV N蛋白及IPEC-J2細胞內CLDN1蛋白的表達（圖6），推測豬乳exosome可能通過抑制PEDV病毒中N蛋白的表達降低病毒粒子對細胞的感染性，同時降低細胞CLDN1基因表達對細胞凋亡的影響，從而提高細胞活力來抵抗PEDV病毒的入侵。

圖6 PEDV病毒及細胞凋亡相關蛋白表達Fig. 6 Expressions of apoptosis-related and PEDV-related proteins

2.5 豬乳exosome對IPEC-J2細胞免疫相關基因表達

對IPEC-J2細胞感染PEDV后免疫相關基因的表達結果（圖7）顯示，3種處理方式下，豬乳exosome極顯著抑制細胞內pAPN基因表達（P＜0.01），而對NF-κB基因的表達無顯著影響（P＞0.05）。此外，處理方式1（預防作用）極顯著提高IFN-α基因表達（P＜0.01），同時極顯著抑制IRF3基因表達（P＜0.01）；而在處理方式2（殺毒作用）和處理方式3（修復作用）作用下，豬乳exosome分別對IFN-α及IRF3基因表達影響不明顯（P＞0.05），提示不同作用方式下，豬乳exosome抑制PEDV病毒可能激活的細胞信號通路不同。

圖7 豬乳exosome對IPEC-J2細胞免疫相關基因表達的影響Fig. 7 Expressions of immune-related genes treated with porcine milk-derived exosome in IPEC-J2 cells

3 討論

本文通過3種不同的處理方式探討了豬乳exosome對PEDV病毒感染仔豬腸道上皮IPEC-J2細胞的作用效果，即預防、殺滅和修復3種作用方式。結果顯示，豬乳exosome無論以何種方式添加，對小豬腸道上皮細胞感染PEDV后均有提高細胞存活數量和活力的作用；進一步分析其可能的機理顯示，豬乳exosome可直接降低細胞內和細胞上清中PEDV病 毒 M、N、ORF3、Spike、RNA polymerase和 E蛋白相關基因的表達；同時對細胞內增殖凋亡相關的CLDN1蛋白及病毒感染相關的N蛋白具有明顯的抑制作用；而對細胞內免疫相關IFN-α、NF-κB、IRF3、pAPN基因的表達除處理方式2（殺滅）與3（修復）對IFN-a和IRF3基因的調節作用與其他基因不一致外，其他各處理方式對IFN-α、NF-κB、IRF3、pAPN基因的表達調節效果均統一，推測不同作用方式下，豬乳exosome在細胞內抑制PEDV可能激活的信號分子和通路存在差異。

PEDV屬于冠狀病毒，有囊膜，包含單股正鏈RNA基因組，病毒的表面由核衣殼蛋白（N），纖突糖蛋白（S）、膜蛋白（M）、小膜蛋白（E）構成［13］，復制酶多聚蛋白1ab（ORF1ab）和輔助蛋白（ORF3）是 PEDV 主要的非結構蛋白，它們僅在病毒侵染和復制過程中表達，ORF3是PEDV 中唯一的輔助蛋白，與病毒毒力有關［14-15］。有研究利用異位表達研究發現，E、N 和M 表現出抑制干擾素β（IFN-β）和干擾素調節因子3（IRF3）活性的能力。此外還參與宿主內質網應激和NF-κB 的激活反應［16］。從本研究結果7中顯示，感染PEDV病毒的各組NF-κB表達量無明顯差異，而處理方式1（預防）和2（殺滅）極顯著抑制IRF3的活性，說明豬乳exosome在腸道細胞中預防和殺滅PEDV的過程可能不是通過激活NF-κB及其通路來發揮作用。干擾素調節因子3（IRF-3）和 NF-κB 是誘導 IFN-β 發生轉錄的兩個關鍵因子，PEDV 感染能激活 NF-κB，但不能激活IRF-3。PEDV 感染能明顯抑制 dsRNA 誘導的 IRF-3核轉位及 IFN-β的產生［17］。有研究在豬小腸上皮細胞（IECs）上探究PEDV 感染抑制 IRF-3 激活的分子機制顯示，IRF-3的上游TANK 結合激酶1（TBK1）或抑制性κB 激酶ε（IKKε）介導的IFN-β的產生并不受 PEDV 感染的影響，而是通過干擾RIG-I 信號通路中的線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）的活性來抑制 IFN-β的產生實現的［17］，本研究中處理方式1和2中經豬乳exosome處理后，感染PEDV后細胞中IRF-3的表達量顯著下調，提示豬乳exosome抑制PEDV感染腸道上皮細胞的調節機制可能與上述研究類似。

棘突蛋白S 是存在于病毒粒子表面的I 型糖蛋白，決定病毒的宿主范圍和組織嗜性［18］，病毒入侵細胞時借助于S 蛋白與宿主細胞表面受體結合并通過膜融合的形式進入胞內。有研究表明在PEDV感染的腸細胞中，S 蛋白有削弱宿主I 型干擾素應答的潛能［19］，而I 型干擾素被抑制后，能促進病毒感染［20］，本研究中添加豬乳exosome后，細胞上清中S蛋白的表達量明顯降低，提示與宿主表面受體結合的PEDV病毒數量可能明顯減少；同時相比對照組細胞內的病毒S蛋白基因也極顯著降低，證明豬乳exosome有顯著抑制PEDV病毒進入腸道細胞內的作用。病毒侵入時，所有的有核細胞受到刺激會產生 I型干擾素（IFN-I），干擾素的功能多樣，不但能提高一些內在蛋白的表達，而且還可以誘導病毒感染細胞凋亡，抵抗病毒感染［21］，研究表明，PEDV可在機體內形成持續性感染來抵抗IFN-I（包括 IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-ω 4 種成員）的抗病毒作用［22］。另有研究表明，PEDV感染細胞后可通過降解STAT1影響IFN-α介導的抗病毒作用，從而促進病毒復制［23］。本研究結果顯示，處理方式1和3有促進IFN-α表達的效果，推測其可能通過上述類似機制來抵抗病毒入侵，但仍需進一步驗證。對比3種處理方式IFN-α表達量可知，在處理方式1中IFN-α表達量極顯著升高，提示豬乳exosome可能在預防腸道細胞感染PEDV的過程中效果要優于其他兩種方式。

E 蛋白在病毒感染過程中主要定位于內質網，在PEDV 出芽過程中扮演重要的角色［24］。該蛋白能夠通過上調宿主葡萄糖調節蛋白（glucose-regulated protein 78，GRP78）的表達誘導感染細胞的內質網應激反應，同時激活NF-κB 活性并上調炎癥因子IL-8 和抗凋亡分子Bcl-2 的表達［25］。該研究推測E 蛋白通過激活 NF-κB 上調 IL-8 和 Bcl-2 的表達分別促進細胞炎性反應和限制細胞凋亡，維持病毒在細胞中增殖。本研究中E蛋白表達量極顯著降低，NF-κB在各處理條件下無影響，而細胞活性升高，證明豬乳exosome能很好的抑制PEDV病毒在細胞內外增殖，提高細胞活力，但其可能的抑制機制并不是通過激活NF-κB來實現的。

膜蛋白M定位于整個宿主細胞中，主要參與病毒粒子的組裝和出芽。可誘導宿主產生IFN-α 和特異性抗體，還能介導細胞融合［26］。報道顯示，M蛋白能夠抑制豬腸道上皮細胞（IEC）周期素A（cyclin A）阻礙腸道上皮細胞生長使其停滯在細胞周期的S期，進而通過干擾細胞周期促進病毒的增殖［26］。在本研究中，經豬乳exosome處理后活細胞數量上升，細胞內M蛋白表達量下降，與上述研究結果類似，說明豬乳外泌體可能通過干預病毒粒子在細胞內的形成過程，從而促進細胞的增殖及活性。而定位于宿主細胞質中，且參與病毒基因組轉錄和合成、病毒粒子組裝以及宿主應激和免疫反應的N蛋白［17］在本研究中表達量也顯著下調，更進步證明，豬乳exosome有抑制PEDV病毒在細胞內形成的作用。

ORF3 是PEDV 唯一的輔助蛋白，可與S 蛋白相互作用調節病毒復制［27］，與病毒的毒力強弱和復制密切相關。同時與結構蛋白M 和N 相似，也表現出調控宿主細胞周期的能力。Ye 等［28］利用構建穩定表達ORF3 蛋白的Vero 細胞證實，ORF3 通過延長細胞周期的S 期和促進囊泡形成的方式以利于病毒增殖，同時相比強毒株的PEDV，穩定表達ORF3的Vero 細胞更利于弱毒株的增殖。此外，ORF3 還具有抑制PEDV 誘導的細胞凋亡功能而促進病毒的復制［29］。本研究結果顯示，經豬乳exosome處理后ORF3表達量下調，細胞活力明顯增強，進一步證明豬乳exosome有抑制病毒復制的能力。

多項報道顯示，pAPN為PEDV感染的功能性受體，PEDV利用pAPN作為主要的受體進入細胞［30-32］，本研究結果顯示，添加豬exosome后pAPN表達量極顯著降低，提示豬乳exosome可能通過作用于腸道細胞的功能性受體，從而阻止病毒進入并感染細胞。

CLDN1是細胞緊密連接蛋白claudin家族的一個成員，也是構成緊密連接結構TJs的一個組分。研究表明，CLDN1在體內外可以通過激發自噬促進食管鱗狀細胞癌ESCC細胞的增殖和遷移［33］。同時研究也表明，敲低CLDN1將直接導致肝癌細胞的增殖和遷移能力下調［34］，而在APCmin小鼠中過表達CLDN1能顯著促進結腸癌的生長和大小（4倍），并降低小鼠的存活率［35］。CLDN1在胃癌病變中顯著上調，其表達率的高低與術后存活率密切相關［36］。由此可見，CLDN1與細胞癌變和活性密切相關，本研究顯示在經PEDV處理細胞后，細胞形態脫落嚴重，活力降低，CLDN1蛋白表達上調，而經豬乳exosome處理后，以上結果均有緩解，表明豬乳exosome能抑制腸道細胞跨膜蛋白CLDN1的表達，從而增強細胞的抗感染能力，進而提高細胞活性。

4 結論

豬乳exosome能抑制PEDV病毒對腸道上皮IPEC-J2細胞的入侵能力，其可能的機制為：一方面通過直接抑制PEDV病毒感染相關的基因和蛋白的表達發揮作用，另一方面可能是通過調節腸道細胞本身關鍵受體基因或免疫相關基因表達發揮作用，或通過兩種作用機制協同從而達到降低PEDV感染力，提高腸道細胞的活力，實現豬乳exosome對腸道細胞的保護作用。