斑馬魚(yú)（Danio rerio）mapk1基因?qū)p53基因調(diào)控研究

包林珠 時(shí)燦 盧玲兒 徐行 周澤斌 任建峰李偉明 張慶華

（1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 中國(guó)科學(xué)技術(shù)部海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心，上海 201306；3. 密歇根州立大學(xué)漁業(yè)與野生生物系，密歇根，美國(guó) 48824）

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，對(duì)多細(xì)胞生物的胚胎發(fā)育、個(gè)體生長(zhǎng)、造血、免疫系統(tǒng)成熟、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及抵御外界各種因素的干擾等方面都起著重要的作用。細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類(lèi)型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制［1］。在動(dòng)物體內(nèi)，如果細(xì)胞增殖過(guò)度，則造成癌癥；如果細(xì)胞凋亡過(guò)度，則可引起神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥［2］。腫瘤細(xì)胞的無(wú)限生長(zhǎng)是腫瘤細(xì)胞凋亡受抑制的結(jié)果，因而細(xì)胞凋亡障礙同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系［3］。MAPK信號(hào)通路由細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2），c-Jun N端激酶（JNKs）和p38組成，它們介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的一系列生物學(xué)反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、分化及凋亡［4］。MAPK1是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）中的成員，又稱細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2（ERK2），能夠介導(dǎo)多種因子導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡［5］。

TP53在許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮功能，從而調(diào)節(jié)生物繁殖、發(fā)育、基因組穩(wěn)定（DNA修復(fù)）、細(xì)胞衰老、凋亡及代謝變化等各種重要的生物學(xué)活性［6］。TP53是迄今為止在人類(lèi)惡性腫瘤分析中最常見(jiàn)的腫瘤抑制基因，在近50%的人類(lèi)癌癥中發(fā)現(xiàn)TP53 基因的突變［7］。Berghmans等［8］在 tp53-/-突變體斑馬魚(yú)（Danio rerio）中觀察到惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤的發(fā)生。TP53在監(jiān)測(cè)、預(yù)防、消除腫瘤細(xì)胞以及抑制腫瘤抑制因子方面起著重要作用［9］。大量研究表明，TP53通過(guò)兩條途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，即激活細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。

目前，斑馬魚(yú)作為常用的脊椎動(dòng)物模型為人類(lèi)疾病的認(rèn)知作出了重要貢獻(xiàn)［11］。斑馬魚(yú)TP53與人和小鼠的TP53蛋白氨基酸序列分別具有48.3%和48.5% 的同一性，而且在5個(gè)保守區(qū)域的氨基酸序列的一致性都很高，均為75%、92.3%、100%、100%和94.1%［12］，與其他模型動(dòng)物相比，斑馬魚(yú)在識(shí)別tp53基因調(diào)控的新機(jī)制方面具有許多優(yōu)勢(shì)［13］。因在斑馬魚(yú)中易于進(jìn)行正向和反向遺傳操作技術(shù)和化學(xué)篩選，使其非常適合鑒定和表征脊椎動(dòng)物tp53途徑相關(guān)的藥物和基因，如抗癌藥物喜樹(shù)堿和mdm2基因［14］。由于蛋白激酶代表了真正的藥物靶標(biāo)，尤其是ERK1/2信號(hào)，因此受到眾多生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家的極大關(guān)注［15］。有研究報(bào)道，在人HEK293T細(xì)胞中，MAPK1可通過(guò)磷酸化活化TP53基因［16］。在兔晶狀體上皮細(xì)胞（rabbit lens epithelial cells，RLECs）中，在鈣霉素的作用下，MAPK1可以促進(jìn)TP53的表達(dá)［17］。然而在斑馬魚(yú)中，mapk1基因?qū)p53基因的調(diào)控作用未有報(bào)道。由于目前在斑馬魚(yú)模型研究中缺少相應(yīng)蛋白的抗體，使得蛋白之間的調(diào)控作用存在諸多瓶頸。啟動(dòng)子作為基因的“開(kāi)關(guān)”，對(duì)于基因的時(shí)空表達(dá)特性起著至關(guān)重要的作用。報(bào)告基因是基因功能研究的有效方法之一，本研究旨在啟動(dòng)子-基因?qū)用娼⒁粋€(gè)基因間相互作用的研究系統(tǒng)，因此我們構(gòu)建了斑馬魚(yú)mapk1基因的表達(dá)質(zhì)粒和tp53報(bào)告基因，結(jié)果表明mapk1可以促進(jìn)tp53表達(dá)，明確了兩者的調(diào)控作用關(guān)系，以期為斑馬魚(yú)的細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用AB品系斑馬魚(yú)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所斑馬魚(yú)平臺(tái)，按照上海海洋大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定（SHOUDW-2016-003）進(jìn)行飼養(yǎng)。海洋動(dòng)物組織基因組 DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根科技（北京）有限公司。克隆啟動(dòng)子特征序列所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴(kuò)增序列所用聚合酶、pMDTM19-T克隆載體試劑盒購(gòu)自TaKaRa（北京）。報(bào)告基因構(gòu)建所用限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶購(gòu)自 NEB（北京）。Dual-Luciferase?報(bào)告基因活性檢測(cè)試劑盒、Fugene?HD 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Promega。配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物用簡(jiǎn)單培養(yǎng)基 Opti-MEM 購(gòu)自 Gibco Life。實(shí)驗(yàn)用人胚腎細(xì)胞（human embryonal kidney，HEK293T）、pGL3-Enhancer 載體及內(nèi)參質(zhì)粒 phRL-TK 均由海軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞（zebrafish embryo fibroblasts cell，ZF4）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 序列分析及引物設(shè)計(jì) 從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取啟動(dòng)子和氨基酸序列，使用的斑馬魚(yú)tp53啟動(dòng)子序列位于斑馬魚(yú)5號(hào)染色體，位置范圍為：NC_007116.7（24085530-24087491），斑馬魚(yú)Mapk1編碼區(qū)參考序列登錄號(hào)為NP_878308.2，人（Homo spaiens）MAPK1編碼區(qū)參考序列登錄號(hào)為NP_002736.3，小鼠（Mus musculus）MAPK1編碼區(qū)參考序列登錄號(hào)為NP_0010337 52.1。用NCBI中的Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物。用Meth primer（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）預(yù)測(cè)斑馬魚(yú)tp53啟動(dòng)子區(qū)CpG島。 用 Alibaba2.0（http：//gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html）分析tp53啟動(dòng)子序列中潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并分析該啟動(dòng)子區(qū)特征序列。用Snapgene軟件構(gòu)建質(zhì)粒圖譜，運(yùn)用DNAMAN 軟件對(duì)比不同物種的氨基酸序列。

1.2.2 斑馬魚(yú)tp53啟動(dòng)子報(bào)告基因構(gòu)建 從NCBI網(wǎng)站獲得斑馬魚(yú)tp53基因的啟動(dòng)子序列，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，選擇含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的2 000 bp左右進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序見(jiàn)表1，引物為tp53-F1和tp53-R1（表2）。在擴(kuò)增出來(lái)的tp53啟動(dòng)子序列的最前端和最后端設(shè)計(jì)添加酶切位點(diǎn)的引物tp53-F2和tp53-R2，兩個(gè)限制性內(nèi)切酶分別為Kpn I-HF和Xho I，引物中酶切位點(diǎn)加下劃線，酶切位點(diǎn)之前的3個(gè)堿基為保護(hù)堿基，用于后續(xù)的報(bào)告基因構(gòu)建。用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶分別對(duì)擴(kuò)增出來(lái)的tp53啟動(dòng)子序列和 pGL3-Enhancer質(zhì)粒（圖1-A）進(jìn)行雙酶切。得到的兩種酶切產(chǎn)物用 T4 連接酶連接，構(gòu)成pGL3-tp53-Luc質(zhì)粒（圖1-B）。連接成功后轉(zhuǎn)化至天根的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化物涂到含有氨芐抗性的普通肉湯瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，第二天挑取單個(gè)的白色菌落擴(kuò)搖菌液，通過(guò)pGL3-Enhancer通用引物，以擴(kuò)搖的菌液為模板進(jìn)行PCR，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)篩選出含有正確大小插入片段的陽(yáng)性克隆，并隨機(jī)選擇5個(gè)片段大小正確的菌液進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與目的片段參考序列進(jìn)行對(duì)比，將與參考序列對(duì)比完全一致的菌液保存，用于后續(xù)提取質(zhì)粒。

圖1 pGL3-Enhancer質(zhì)粒（A）與 pGL3-tp53-Luc重組質(zhì)粒（B）示意圖Fig. 1 Schematic diagram of pGL3-Enhancer plasmid（A）and pGL3-tp53-Luc recombinant plasmid（B）

表1 PCR試劑及體系Table 1 PCR reagents and systems

表2 實(shí)驗(yàn)所用的引物序列Table 2 Primer sequences used in the experiment

1.2.3 斑馬魚(yú)tp53啟動(dòng)子報(bào)告基因活性檢測(cè) 人胚胎腎細(xì)胞HEK293T所需的培養(yǎng)液為含有10% FBS的DMEM，將HEK293T細(xì)胞置于37℃，含有5%濃度CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，將HEK293T細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞密度約為5.0×104個(gè)/孔。等細(xì)胞匯合度達(dá)到70%，將配置好的轉(zhuǎn)染體系（表3）在28℃中放置15 min后物添加至細(xì)胞培養(yǎng)板的1個(gè)孔中，以pRL-TK質(zhì)粒作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染后，將HEK293T細(xì)胞放在37℃含有5%濃度CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后用Promega的 Dualluciferase?Reporter Assay System進(jìn)行雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定，計(jì)算 firefly luciferase 與 Renilla luciferase 的比值，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表3 檢測(cè)tp53啟動(dòng)子報(bào)告基因活性的轉(zhuǎn)染體系Table 3 Transfection system for detecting tp53 promoter reporter gene activity

斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞ZF4所需的培養(yǎng)液為含有10% FBS的DMEF12，將ZF4細(xì)胞置于28℃，含有5% 濃度CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染體系和檢測(cè)方式與HEK293T細(xì)胞一致。

1.2.4 mapk1的CDS序列的擴(kuò)增 在斑馬魚(yú) mapk1編碼區(qū)CDS（coding sequence）序列的兩端設(shè)計(jì)引物。用Trizol提取斑馬魚(yú)總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用CDS上下游引物和高保真酶擴(kuò)增目的片段。PCR擴(kuò)增體系同表1，引物為表2中的mapk1-F1和mapk1-R1，擴(kuò)增條件為：在98℃下預(yù)變性3 min；在98℃下變性30 s，在67℃下退火10 s，在72℃下延伸3 min，此處共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，將與目的序列長(zhǎng)度一致的條帶用天根的DNA回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化到天根的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化物涂到含有氨芐抗性的普通肉湯瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，第2天進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色單個(gè)菌落擴(kuò)搖菌液，通過(guò)pMD19-T通用引物，以擴(kuò)搖的菌液為模板進(jìn)行PCR，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)篩選出含有正確大小插入片段的陽(yáng)性克隆，并隨機(jī)選擇5個(gè)片段大小正確的菌液進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與參考序列相一致的菌液提質(zhì)粒用于后續(xù)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。

1.2.5 構(gòu)建pCMV-Tag2B-mapk1表達(dá)質(zhì)粒 以上一步連接pMD19-T成功的質(zhì)粒為模板，利用加酶切位點(diǎn)的上下游引物mapk1-F2和mapk1-R2（表2）和高保真酶擴(kuò)增含有酶切位點(diǎn)的目的片段，擴(kuò)增條件同上。雙酶切位點(diǎn)為EcoR I和Xho I，引物中酶切位點(diǎn)加下劃線，酶切位點(diǎn)之前的3個(gè)堿基為保護(hù)堿基。經(jīng)電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增后條帶單一的PCR產(chǎn)物純化，純化產(chǎn)物與pCMV-Tag2B質(zhì)粒（圖2-A）分別進(jìn)行雙酶切。雙酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接，構(gòu)建pCMV-Tag2B-mapk1質(zhì)粒（圖2-B），轉(zhuǎn)化至 100 μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)經(jīng)過(guò)熱擊冰置后，加入500 μL 無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇。取適量復(fù)蘇后的挑單克隆搖菌，陽(yáng)性克隆一部分送測(cè)序，一部分保存菌液。將測(cè)序成功的菌液提取質(zhì)粒，并進(jìn)行雙酶切檢測(cè)。

圖2 pCMV-Tag2B質(zhì)粒（A）與pCMV-Tag2B-mapk1重組質(zhì)粒（B）示意圖Fig. 2 Schematic diagram of pCMV-Tag2B plasmid（A）and pCMV-Tag2B-mapk1 recombinant plasmid（B）

1.2.6 檢測(cè)mapk1對(duì)tp53作用 人胚胎腎細(xì)胞HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)于 10% FBS-DMEM 培養(yǎng)液中，置于5% CO2，37℃的培養(yǎng)箱中，每2 d 傳代 1 次。HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前 24 h 接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種的細(xì)胞密度約 5.0×104/孔，匯合率達(dá)到 70%。 將 內(nèi) 參 質(zhì) 粒 phRL-TK、pGL3-tp53-Luc、pCMV-Tag2B和pCMV-Tag2B-mapk1配制成310 ng每孔的轉(zhuǎn)染復(fù)合物（表4）。復(fù)合物混勻后于 28℃孵育 15 min，加到上述24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染后的HEK293T 細(xì)胞放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng) 36 h 后按照 Promega Dual-Luciferase?Reporter Assay System 使用說(shuō)明進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，計(jì)算firefly luciferase 與 Renilla luciferase 的比值。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

表4 轉(zhuǎn)染復(fù)合物配制表Table 4 Formulation table of transfected compound

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú)tp53啟動(dòng)子序列分析結(jié)果

從NCBI網(wǎng)站獲得斑馬魚(yú)tp53基因的啟動(dòng)子序列，具體序列信息如圖3，約2 000 bp，以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1。經(jīng) AliBaba 2.0 軟件預(yù)測(cè)該序列包含Oct-1（TATGTAAAGC）、Sp-1（AGATCCCGCC）、c-Jun（CTGACGTCAC）、CREB（CTGACGTCAC）、CREBP1（CTGACGTCAC）、NF-kappa B1（AGGGGAATCC）和RAR-alpha1（TTGAACTTTT）等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，均已在序列中標(biāo)注出來(lái)。通過(guò) Meth Primer軟件在該啟動(dòng)子片段中沒(méi)有預(yù)測(cè)到CpG 島（圖4）。

圖3 斑馬魚(yú)tp53啟動(dòng)子特征序列分析Fig. 3 Analysis of the characteristic sequence of the tp53 promoter in zebrafish

圖4 Meth primer-Design 軟件預(yù)測(cè) tp53 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島Fig. 4 Prediction of CpG island in tp53 promoter region by Meth Primer-Design software

2.2 成功構(gòu)建出斑馬魚(yú)tp53啟動(dòng)子報(bào)告基因載體

將斑馬魚(yú)tp53啟動(dòng)子片段連接到pGL3-Enhancer質(zhì)粒上，構(gòu)建出pGL3-tp53-Luc重組質(zhì)粒。pGL3-tp53-Luc重組質(zhì)粒通過(guò)雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳結(jié)果得到兩個(gè)條帶。約5.0 kb 的為pGL3-Enhancer，約2.0 kb 的為tp53啟動(dòng)子片段（圖5）；隨后對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒送測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證pGL3-tp53-Luc構(gòu)建正確。

圖5 pGL3-tp53-Luc雙酶切檢驗(yàn)Fig. 5 Double enzyme restriction assay of pGL3-tp53-Luc

2.3 tp53報(bào)告基因在HEK293T和ZF4細(xì)胞中均有活性

將對(duì)照組pGL3-Enhancer和實(shí)驗(yàn)組pGL3-tp53-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胚胎腎細(xì)胞HEK293T和斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞ZF4中。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在HEK293T中，pGL3-tp53-Luc的luciferase活性是pGL3-Enhancer的17倍左右（圖6-A），在 ZF4細(xì)胞中，pGL3-tp53-Luc的 luciferase活性是pGL3-Enhancer的9倍左右（圖6-B）。表明本研究成功構(gòu)建斑馬魚(yú)tp53啟動(dòng)子，并且該啟動(dòng)子具有良好的表達(dá)活性。

圖6 pGL3-tp53-Luc活性Fig. 6 Activity of pGL3-tp53-Luc

2.4 成功構(gòu)建出pCMV-Tag2B-mapk1表達(dá)質(zhì)粒

將斑馬魚(yú)mapk1 CDS序列連接到pCMV-Tag2B質(zhì)粒上，構(gòu)建出pCMV-Tag2B-mapk1表達(dá)質(zhì)粒。我們運(yùn)用 DNAMAN 軟件將斑馬魚(yú)Mapk1與人和小鼠的MAPK1氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)和人的Mapk1一致性為91.33%，斑馬魚(yú)和小鼠的Mapk1一致性為90.79%（表5）。用斑馬魚(yú)cDNA作為模板，以斑馬魚(yú)mapk1 CDS序列的兩端設(shè)計(jì)引物，PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，擴(kuò)增的條帶與目標(biāo)條帶大小相符。mapk1 CDS序列大小為 1 110 bp（圖7-A）。把表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Tag2B-mapk1雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳結(jié)果分別得到兩條目的條帶，4 324 bp為pCMV-Tag2B載體的條帶，1 110 bp為mapk1的CDS序列片段（圖7-B）。隨后對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒送測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證pCMV-Tag2B-mapk1構(gòu)建正確。

表5 斑馬魚(yú)與人和小鼠mapk1基因氨基酸序列對(duì)比Table 5 Comparison of amino acid sequences of mapk1 gene between zebrafish and human and mouse

圖7 mapk1 CDS片段擴(kuò)增（A）和 pCMV-Tag2B-mapk1雙酶切檢驗(yàn)（B）Fig. 7 mapk1 CDS fragment amplification（A）and pCMV-Tag2B-mapk1 double enzyme restriction assay（B）

2.5 斑馬魚(yú)mapk1可促進(jìn)tp53表達(dá)

將pCMV-Tag2B-mapk1和下游tp53啟動(dòng)子報(bào)告基因pGL3-tp53-Luc共同轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，在24 h后進(jìn)行l(wèi)uciferase驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)組的luciferase活性是對(duì)照組的3倍左右（圖8），表明表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Tag2B-mapk1可以促進(jìn)報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-tp53-Luc的表達(dá)。

圖8 pCMV-Tag2B-mapk1和pGL3-tp53-Luc共同轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞后熒光素酶相對(duì)表達(dá)量Fig. 8 Relative expression of luciferase in the HEK293T cells co-transfected with pCMV-Tag2B-mapk1 and pGL3-tp53-Luc plasmids

3 討論

細(xì)胞凋亡對(duì)維護(hù)正常組織和器官的細(xì)胞恒定與生長(zhǎng)平衡、乃至機(jī)體衰老等方面具有重要的調(diào)控作用［18］。斑馬魚(yú)與人類(lèi)的基因相似度高達(dá)87%，目前，在斑馬魚(yú)基因庫(kù)中鑒定出許多與哺乳動(dòng)物凋亡相關(guān)的基因家族，如tp53，caspase及其他凋亡調(diào)控基因等［19］，表明大部分凋亡通路在斑馬魚(yú)和高等脊椎動(dòng)物的進(jìn)化上有很高的保守性。因此，在細(xì)胞凋亡與發(fā)育研究領(lǐng)域，斑馬魚(yú)被認(rèn)為是一種有效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

MAPK1在應(yīng)激條件下調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要性已被廣泛研究［4，20-22］；在人類(lèi)細(xì)胞中，MAPK1活化TP53是DNA損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制［23］；然而斑馬魚(yú)mapk1基因?qū)p53基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用目前未知。本研究采用基因重組技術(shù)將斑馬魚(yú) tp53基因啟動(dòng)子連接到具有多克隆位點(diǎn)的 pGL3-Enhancer載體質(zhì)粒上，構(gòu)建能夠瞬時(shí)表達(dá)斑馬魚(yú) tp53活性的報(bào)告基因載體質(zhì)粒pGL3-tp53-Luc，通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)，在HEK293T細(xì)胞和ZF4細(xì)胞中，斑馬魚(yú)tp53啟動(dòng)子均表現(xiàn)出很高的活性，與對(duì)照組相比，活性分別高達(dá)17%和9%，表明pGL3-tp53-Luc質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過(guò)氨基酸序列對(duì)比，斑馬魚(yú)Mapk1蛋白氨基酸序列與人類(lèi)的一致性高達(dá)91.33%，與小鼠的一致性高達(dá)90.79%，表明mapk1基因在斑馬魚(yú)、人類(lèi)與小鼠中的功能是保守的。通過(guò)基因重組技術(shù)將斑馬魚(yú)mapk1基因編碼區(qū)序列連接到pCMVTag2B載體上，構(gòu)建能夠發(fā)揮mapk1基因功能的pCMV-Tag2B-mapk1表達(dá)質(zhì)粒。將pGL3-tp53-Luc與pCMV-Tag2B-mapk1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)，表明斑馬魚(yú)mapk1基因可促進(jìn)tp53基因表達(dá)。

轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄［24］。對(duì)斑馬魚(yú)tp53基因候選啟動(dòng)子的生物信息分析得到8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，它們分別是Oct-1、Sp1、c-Jun、CRE-BP1、CREB、NF-kappaB1和 RAR-alpha1；但是未檢測(cè)到mapk1的結(jié)合位點(diǎn)。研究顯示，Sp1參與了與細(xì)胞增殖、凋亡抗性和血管生成有關(guān)的基因的調(diào)控［25］，NF-kappaB1能夠調(diào)節(jié)翻譯水平上的TP53表達(dá)［26］。在哺乳動(dòng)物中，c-Jun通過(guò)轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞中的TP53來(lái)抑制凋亡［27］，CREB信號(hào)傳導(dǎo)在缺氧誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和軟骨細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［28］。同時(shí)，有研究證明 c-Jun［29］與CREB［30］是mapk1的下游調(diào)控靶點(diǎn)。所以本研究中，mapk1有可能直接通過(guò)調(diào)控c-Jun或CREB活性來(lái)促進(jìn)tp53表達(dá)，也可能通過(guò)其他基因發(fā)揮間接作用，具體調(diào)控方式有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生信網(wǎng)站分析，得知斑馬魚(yú)tp53基因的啟動(dòng)子區(qū)無(wú)CpG島位點(diǎn)，包含7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；斑馬魚(yú)與人和小鼠MAPK1氨基酸的一致性分別為91.33%和90.79%。用雙酶切法構(gòu)建了斑馬魚(yú)tp53基因的啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-tp53-Luc與mapk1基因的表達(dá)載體質(zhì)粒pCMV-Tag2B-mapk1。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)，得知pGL3-tp53-Luc在HEK293T中的luciferase活性是pGL3-Enhancer的17倍左右，在 ZF4細(xì)胞中的luciferase活性是pGL3-Enhancer的9倍左右。在HEK293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)pCMV-Tag2B-mapk1 質(zhì)粒后pGL3-tp53-Luc的luciferase活性是對(duì)照組的3倍左右。