泛素E3連接酶CHIP和E4B互換U-box結構域突變體的構建及泛素化活性驗證

范宇宸 陸瑤 劉香男 趙博

（上海交通大學藥學院，上海 200240）

泛素化是由包括泛素活化酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3在內的一系列酶催化下發生的級聯反應，是真核細胞蛋白質翻譯后修飾的重要過程［1］。其中，E3識別并介導底物的泛素化，是參與泛素化的關鍵酶之一。E3根據結構和功能的不同主要分為RING家族、HECT家族、U-box家族和CRL家族［2］。作為U-box家族泛素連接酶的主要活性區域，U-box結構域的功能主要是與泛素結合酶E2相互作用，并將泛素Ub傳遞至底物蛋白上［3］。因此，U-box結構域對于該家族E3的活性至關重要。CHIP（carboxyl terminus of Hsc70/Hsp70-interacting protein）和E4B（ubiquitination factor E4B）是U-box家族泛素連接酶的2個重要成員，它們共同參與了內質網蛋白質量控制［4］。不同的是，CHIP是分子伴侶依賴型的泛素連接酶，通過N末端的TPR結構域與分子伴侶Hsc70/Hsp70相互作用介導底物的泛素化［5］；而E4B不僅具有E3的活性，還能夠充當E4，發揮延伸泛素鏈的功能［6］，因此它們一直是U-box家族泛素連接酶研究的熱點。

U-box結構域的活性與其氨基酸序列和空間結構的完整性密切相關。研究表明，發生在CHIP的U-box結構域的突變E301Q，使CHIP泛素化其底物的活性下降［7］。而通過改造E4B的U-box結構域的部分氨基酸序列，增強其與E2的親和力，能夠增強E4B的活性［8］。亦有報道表明，CHIP的U-box結構域完整序列保留的情況下，它的N末端融合一個異源性蛋白能夠特異性靶向底物蛋白，同時U-box結構域依舊能傳遞泛素，這種融合蛋白稱為嵌合泛素連接酶［9］。由此可見，U-box結構域的序列及空間結構若得以完整保留，其活性有可能得到部分保留。CHIP和E4B的U-box結構域氨基酸序列并不相似，先前的研究篩選得到的它們的潛在底物中，卻有多種共同底物［10］。為了進一步研究U-box結構域對CHIP和E4B活性的影響，我們通過互換CHIP和E4B的U-box結構域，驗證構建得到的突變體對CHIP和E4B各自底物和二者共同底物的泛素化活性。因此，基于前期研究成果，我們選取了篩選得到的CHIP的潛在底物RCC2、E4B的潛在底物NIPSNAP1、二者潛在共同底物CDC37和文獻報道的CHIP和E4B的共同底物p53［11］為實驗底物進行驗證，旨在為進一步研究CHIP和E4B的E3活性及其U-box結構域的作用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK-293T細胞購自中國科學院細胞庫；胎牛血清、DMEM培養基、opti-MEM減血清培養基購自Gibco公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞菌種由本實驗室保存并制備；pLVX-IRES-mCherry、pLVX-3′flag-IRES-mCherry、pcDNA-NIPSNAP1、pcDNACDC37、pLVX-E4B、pLVX-CHIP等質粒由本實驗室保存；高保真KOD酶購自東洋紡上海有限公司；限制酶、T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根生化科技公司；引物合成及質粒測序由生工生物公司完成；anti-flag抗體、anti-CHIP抗體、anti-E4B抗體和anti-GAPDH抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 HEK-293T細胞的復蘇和培養 從液氮罐中取出凍存的HEK-293T細胞株，迅速置入37℃水浴中，并輕輕搖晃凍存管使其在1 min內融化。加入適量完全培養基800 r/min離心2 min，再使用4 mL完全培養基重懸細胞，置于6 cm細胞培養皿中，37℃、5%CO2條件下培養。定期觀察細胞狀態，進行傳代培養。

1.2.2 底物質粒pLVX-RCC2-IRES-mCherry、pLVX-p53-IRES-mCherry的構建

1.2.2.1 底物基因RCC2和p53的PCR擴增 根據NCBI數據庫調取的RCC2和p53底物的全長CDS序列設計引物，并在RCC2基因上下游分別插入Nde I、Not I兩個酶切位點，在p53基因上下游分別插入EcoR I、BamH I兩個酶切位點，并在p53基因3′端引入flag標簽序列。引物序列如下：

RCC2-F：TACCTTCATATGCCCAGGAAGAAGGCGGC；RCC2-R：ATCTTAAAGCGGCCGCGAGGGT TCGGGGGTTGTATT；p53-F：GCGGCGGAATTCATGGAGGAGCCGCAGTCA；p53-R：ACAGTAGGATCCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGTCTGAGTCAGGCCCTTC

根據KOD酶說明書設計PCR反應體系進行擴增。

1.2.2.2 載體與底物基因連接 應用Nde I、Not I兩種限制酶酶切pLVX-3′flag-IRES-mCherry載體質粒和RCC2底物基因，應用EcoR I、BamH I兩種限制酶酶切pLVX-IRES-mCherry載體質粒和p53底物基因。載體經瓊脂糖凝膠電泳回收，底物基因經柱回收，根據底物基因與載體摩爾比7∶1計算各自用量，使用T4 DNA連接酶室溫連接1.5 h。取5 μL酶連產物加入30 μL DH5α感受態細胞，冰敷30 min，42℃熱激90 s，再冰敷2 min。用1 mL LB液體培養基37℃，220 r/min復蘇1 h，后將菌液涂布于氨芐抗性的LB平板上，37℃倒置培養過夜。次日各挑取4個單克隆小搖，提質粒后測序鑒定質粒是否構建成功。

1.2.3 Overlap PCR構建CHIP及E4B互換U-box結構域的突變體

1.2.3.1 目的片段的擴增 根據overlap PCR的技術要求設計引物，分別將CHIP A片段（CHIP基因1-675 bp）和CHIP B片段（CHIP的U-box基因676-909 bp）、E4B A片段（E4B基因1-3 678 bp）、E4B B片段（E4B的U-box基因3 679-3 906 bp）的基因序列進行擴增。引物序列為：

CHIP A-F：TTACTGGAATTCATGAAGGGCAAGGAGGAG；CHIP A-R：TCGCTTCTTCCTCTTGACGCTCCTG；CHIP B-F：TCGCTTCTTCGACGCTCCTGATGAG；CHIP B-R：ATTATTGGATCCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTGATCGCTG；E4B A-F：TCTAGTGAATTCATGGAGGAGCTGAGC；E4B A-R：GCTGTAGTCGATTTCGACATCCCCG；E4B B-F：GCTGTAGTCGGACATCCCCGACTAC；E4BB-R：ATTATTGGATCCTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTAGTCCTCCA

根據KOD酶說明書設計PCR反應體系進行擴增。

1.2.3.2 全長突變體基因的融合 將1.2.3.1中4條片段的PCR產物分別經瓊脂糖凝膠電泳回收，根據A、B片段摩爾比1∶1計算overlap PCR的各自模板用量，進行PCR反應。前8個循環體系中不加引物，A、B片段互為模板融合成全長的突變體序列，第9個循環起體系中加入A片段上游引物及B片段下游引物擴增全長序列。

1.2.3.3 全長突變體基因與載體的連接 應用EcoR I、BamH I兩種限制酶酶切pLVX-IRES-mCherry載體質粒和全長突變體目的基因。后續回收、連接及鑒定方法如1.2.2.2所述。

1.2.4 質粒轉染HEK-293T細胞 取生長狀態良好的HEK-293T細胞，胰酶消化后用新鮮培養基重懸細胞，計數，以2.2×106個的數量接種于6 cm細胞培養皿，培養過夜。移除培養基，無菌PBS洗滌細胞兩遍，加入適量opti-MEM減血清培養基。取無菌EP管兩支，一支加入質粒，另一支加入質粒質量3倍體積的PEI，分別用250 μL opti-MEM將質粒和PEI制備為均勻的溶液，室溫靜置5 min，后將PEI加入質粒中，輕輕混勻，室溫靜置20 min，隨后將PEI-質粒混合物加入預先更換培養基的細胞中，過夜培養12 h后更換為含血清的DMEM培養基。

1.2.5 底物、CHIP和E4B及其突變體在細胞中的表達檢測 1.2.4中細胞轉染44 h后，將培養基替換為含10 μmol/L MG132的培養基，37℃、5% CO2繼續培養4 h。取出培養皿，棄去培養基，4℃預冷的PBS洗細胞2遍，每皿加入400 μL 含蛋白酶抑制劑和去泛素化酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解5 min。使用細胞刮刀刮取裂解后的細胞至EP管中，置于搖床冰上繼續裂解30 min，隨后4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清即為總蛋白。BCA法對總蛋白濃度定量，根據濃度將樣品總蛋白濃度調整到一致水平，取適量裂解液煮樣，10%分離膠SDS-PAGE電泳分離，轉膜，封閉。由于4個底物上都帶有flag標簽，因此使用anti-flag抗體（1∶1 000）檢測底物表達量。由于anti-CHIP和anti-E4B兩種抗體所識別的抗原分別為CHIP和E4B的前100個氨基酸殘基所組成的肽鏈，而兩種突變體前100個氨基酸殘基與各自的野生型E3相同，因此使用anti-CHIP抗體（1∶10 000）和anti-E4B抗體（1∶5 000）檢測CHIP、E4B及其突變體的表達量。anti-GAPDH抗體（1∶10 000）檢測內參蛋白表達量。

1.2.6 免疫共沉淀驗證CHIP和E4B及其突變體對底物的泛素化情況 取1.2.5中所獲得的細胞裂解液，向1 mg總蛋白中加入6 μL anti-flag抗體偶聯的proteinG beads，搖床上4℃結合6 h，隨后4℃ 9 000 r/min離心1 min，棄上清，PBS-T洗beads 6-8次。40 μL PBS 重懸 beads，加入 10 μL 還原性 5× 蛋白上樣緩沖液，99℃煮樣10 min，取上清上樣，6%分離膠SDS-PAGE電泳分離，轉膜，封閉，anti-Ub抗體（1∶5 000）檢測底物上結合的Ub水平，反映泛素化情況。

2 結果

2.1 pLVX-RCC2-IRES-mCherry、pLVX-p53-IRES-mCherry質粒的構建

以HEK-293T細胞總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，經PCR反應擴增得到的條帶分子量符合理論值，RCC2目的基因全長1 569 bp，位于1.5 kb marker附近；p53 目的基因全長1 182 bp，位于1 kb marker附近（圖1-A、B）。目的基因與載體經酶切酶連后轉化涂板，分別挑取了4個陽性克隆小搖提取質粒，瓊脂糖凝膠電泳顯示質粒質量良好，與空載體質粒相比，電泳速率較慢（圖1-C），提示目的基因可能成功連接，經測序后序列正確，2個底物質粒均構建成功。

圖1 RCC2、p53底物質粒克隆及構建Fig.1 Plasmid cloning and construction of substrate RCC2 and p53

2.2 互換U-box的突變體pLVX-C+E-IRES-mCherry、pLVX-E+C-IRES-mCherry質粒的構建

以實驗室保存的pLVX-CHIP-IRES-mCherry、pLVX-E4B-IRES-mCherry質粒為模板，經PCR反應擴增分別得到CHIP的A片段CA和B片段CB，E4B的A片段EA和B片段EB。瓊脂糖凝膠電泳顯示，CA位于750 bp marker附近、CB位于250 bp marker附近，EA位于2 000 bp marker以上，EB位于250 bp marker附近，均符合其理論大小（圖2-A）。

隨后分別以CA和EB、EA和CB為模板，經overlap PCR融合、擴增，得到CHIP A片段與E4B B片段的融合基因，命名為C+E（CHIP基因1 bp-675 bp序列的3′端融合E4B基因第3 679-3 906 bp的U-box序列）；得到E4B A片段與CHIP B片段的融合基因，命名為E+C（E4B基因1-3 678 bp序列的3′端融合CHIP基因第676-909 bp的U-box序列）。經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，C+E條帶位于1 kb marker附近（圖 2-B），E+C條帶位于 4 kb marker附近（圖 2-C），均符合其理論大小。后經酶切、酶連、轉化、測序確 認 pLVX-C+E-IRES-mCherry、pLVX-E+C-IRES-mCherry兩種質粒構建成功。

圖2 融合基因C+E及E+C的PCR結果Fig.2 PCR results of fusion genes C+E and E+C

2.3 底物、CHIP和E4B及其突變體在HEK-293T細胞中的表達

根據實驗需要，分別轉染底物pLVX-RCC2表達質粒（圖3-A）、pcDNA-NIPSNAP1表達質粒（圖3-B）、pLVX-p53表達質粒（圖3-C）和pcDNA-CDC37表達質粒（圖3-D）。收集細胞樣品，經Western blot，pLVX-RCC2表達質粒、pcDNA-NIPSNAP1表達質粒、pLVX-p53表達質粒和pcDNA-CDC37表達質粒在HEK-293T細胞中均能正常表達，具有較高的表達量。分別與4種底物共轉染的pLVX-CHIP表達質粒、pLVX-C+E表達質粒、pLVX-E4B表達質粒和pLVX-E+C表達質粒均能夠正常表達，且與HEK-293T組相比有過表達趨勢。

圖3 底物、CHIP和E4B及其突變體的細胞內表達結果Fig.3 Intracellular expression results of substrates，CHIP，E4B and their mutants

2.4 CHIP和E4B及其突變體對底物泛素化的影響

底物RCC2的免疫共沉淀實驗結果表明，與HEK-293T組相比，過表達CHIP能夠增強RCC2的泛素化，其Ub拖尾條帶更深（圖4-A）。同時，過表達E4B不能增強RCC2的泛素化。過表達C+E能夠一定程度上增強RCC2的泛素化，但其程度不及野生型CHIP。過表達E4B或E+C則無增強泛素化的作用（圖4-A）。與RCC2類似，底物NIPSNAP1的免疫共沉淀實驗結果表明，與HEK-293T組相比，過表達E4B能夠增強NIPSNAP1的泛素化，過表達E+C亦能增強其泛素化，但其程度不及野生型E4B。過表達CHIP或C+E則無增強泛素化的作用（圖4-B）。這2個底物的實驗結果證明了，RCC2是CHIP的底物，NIPSNAP1是E4B的底物。同時，CHIP和E4B互換U-box結構域后對各自底物依舊保留了一定程度的泛素化活性。

對于底物p53和CDC37，與HEK-293T組相比，過表達CHIP或E4B均能夠增強p53和CDC37的泛素化。同時，過表達C+E能夠一定程度上增強p53和CDC37的泛素化，但其程度不及野生型的CHIP。而過表達E+C幾乎不能增強p53和CDC37的泛素化（圖4-C、D）。這2個底物的實驗結果證實了文獻報道的p53是CHIP和E4B的共同底物，同時證明了CDC37是CHIP和E4B的共同底物。與上述類似，CHIP換上E4B的U-box結構域后對CHIP和E4B的共同底物保留了部分的泛素化活性，但不同的是，E4B換上CHIP的U-box結構域后則幾乎失去了泛素化共同底物的活性。

圖4 底物RCC2、NIPSNAP1、p53、CDC37的免疫共沉淀實驗結果Fig.4 Co-immunoprecipitation experiment results of substrate RCC2，NIPSNAP1，p53 and CDC37

3 討論

泛素-蛋白酶體系統通過泛素化降解胞內蛋白起到調節細胞功能的重要作用。該系統調節包括細胞周期、基因轉錄和翻譯、細胞凋亡、細胞代謝等在內的一系列重要細胞生命活動［12］。泛素連接酶作為泛素化過程的重要參與者，在調節其特異性底物的降解及其他信號的轉導方面具有關鍵的作用。其中，U-box家族泛素連接酶CHIP和E4B及其底物在疾病發生過程中的作用越來越受到關注。例如，CHIP 在肺癌［13］、三陰性乳腺癌［14］等中呈現為抑癌蛋白，CHIP的過表達伴隨其促癌底物的降解抑制了腫瘤細胞的生長。在脊髓小腦共濟失調患者中，CHIP的U-box結構域存在突變，導致了其E3活性改變，從而加速了疾病進展［15］。也有的研究將CHIP的U-box結構域嵌合至Grb2蛋白C末端，靶向酪氨酸激酶BCR-ABL的泛素化，成為了慢性粒細胞白血病治療的潛在新手段［16］。而E4B則在肝癌［17］等癌癥中表現為促癌蛋白。在乳腺癌中，E4B促癌的可能機制是由于它對p53的泛素化降解［18］。因此，對CHIP和E4B的U-box結構域的功能進行深入研究有助于進一步闡明部分疾病的發病機理，從而開發新的治療方法。

基于以上理論基礎，本研究通過將CHIP和E4B的U-box結構域互換，分別對突變體泛素化CHIP和E4B各自底物和共同底物的活性進行考察，發現CHIP突變體C+E、E4B突變體E+C都保留了一定的活性，同時，E+C對二者共同底物的泛素化活性基本喪失了。有報道表明，E4B可以作為E4發揮鏈延長的功能，而不直接作為E3將底物泛素化，但具體發揮E4功能的區域尚不明確［19］。因此，可能在互換U-box結構域時對全長E4B蛋白的結構產生了影響，喪失了E4的活性，因而表現為部分底物泛素化活性的減弱。未來，一方面，結合涉及CHIP的U-box結構域的嵌合泛素連接酶技術，深入研究突變體C+E泛素化CHIP底物的活性；另一方面，利用免疫共沉淀技術，研究突變體C+E和E+C與底物的相互作用，進一步闡明U-box結構域對CHIP和E4B活性的作用。

4 結論

本研究基于泛素連接酶CHIP及E4B的底物，為研究U-box結構域對CHIP和E4B活性的影響，成功構建了2個互換U-box結構域的CHIP及E4B突變體C+E和E+C。經HEK-293T細胞內泛素化反應檢測底物泛素化情況，最終確定CHIP突變體C+E能夠部分保留泛素化CHIP底物的活性，E4B突變體E+C只在泛素化E4B底物時保留了部分泛素化活性，而在泛素化共同底物時活性喪失。