薏苡仁油對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的作用及機制研究

徐 佳，魏 莉，蔡國青，郭 倩，王運萍，楊 紅

(空軍軍醫大學西京醫院婦產科，陜西 西安 710032)

卵巢癌是婦科惡性程度較高的腫瘤，其發病率位于婦科腫瘤第二位[1]。由于卵巢癌早期病變不易發現，晚期病例缺乏有效的治療手段，其致死率在婦科腫瘤中居于首位，對女性的生命健康造成嚴重威脅。目前卵巢癌的治療包括手術切除，輔助以化療、放療以及靶向治療等綜合方案[2-3]。大多數晚期卵巢癌患者對基于鉑類的化療方案產生耐藥，并導致腫瘤復發。因此，尋找安全有效治療卵巢癌的藥物對于提高患者療效具有重要的意義。薏苡仁油是從薏苡仁的種核中提取的天然成分，含有多種活性物質，如脂類、多糖類、木脂素類、酚類和腺苷等。薏苡仁在傳統醫學具有利水除濕等作用，而經現代醫學發現其具有抗感染、提高免疫力、鎮痛以及抗腫瘤等多種藥理作用，目前多在胃癌、結腸癌、胰腺癌等領域研究[4]。然而，薏苡仁油對卵巢癌的研究較少且機制尚不清楚。本研究通過以卵巢癌SKOV3細胞為模型，探討薏苡仁油對其可能的影響及作用機制，為薏苡仁油的臨床應用提出理論依據。

1材料與方法

1.1試劑和儀器

噻唑蘭(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑(USA，Amresco公司 )；IP組織細胞裂解液(上海碧云天)；Rabbit Anti-Bax、Bcl-2、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9、P53(USA，cell signaling)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔、抗大鼠的第二抗體(USA.Santa Cruz)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)(USA.Millipore)；半干轉膜儀(USA.Bio-Red)；MD-100全自動生化儀(USA.MD)。卵巢癌細胞SKOV3源自空軍軍醫大學婦產科實驗室，薏苡仁油空軍軍醫大學藥劑科實驗室贈送。

1.2實驗藥物的配制

將薏苡仁油化學成分提取物溶解于二甲基亞砜中，根據前期試驗，配制終濃度為5μg/mL，經0.45nm濾膜過濾除菌備用。

1.3細胞培養

將人卵巢癌SKOV3細胞常規復蘇，接種于含10%新生牛血清，10×104U/L青霉素和100mg/L鏈霉素得RPMI-1640培養液中，置于37℃，體積分數5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。所有細胞株從液氮中取出后進行復蘇，置入培養箱中進行培養，待細胞鋪滿培養瓶中約80%時進行傳代，所有細胞常規傳代2次，取生長狀態良好無污染的細胞株進行后續實驗。

1.4 MTT法檢測薏苡仁油對SKOV3細胞活性的影響

取生長狀態良好的對數生長期SKOV3細胞，胰酶消化后，離心，重懸，細胞計數板計數，調整細胞濃度至5×103個細胞/mL的細胞懸液，接種于96孔板過夜。對照組加入完全培養基，實驗組分別加入含有不同濃度薏苡仁油的培養基，終濃度分別為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL，每組設6個復孔，分別培養24、48、72h后，加入20μL的5mg/mL的MTT繼續培養4h，吸棄培養液，每孔加入150μL的DMSO，酶標儀490nm檢測各孔的吸光度(A)值。

1.5 Hoechst33342/PI、AO/EB熒光染色

取細胞濃度為5×103個細胞/mL的細胞懸液，接種于24孔板中，待細胞貼壁匯集80%時，分為對照組和實驗組，實驗組采用3個不同濃度薏苡仁油進行處理(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)。繼續培養48h，細胞進行Hoechst33342/PI、AO/EB熒光染色。①Hoechst33342/PI染色：向細胞中加入用0.01mol磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)的Hoechst 33342，終濃度為10μg/mL，37℃反應10min；繼續加入用0.01mol PBS溶解的PI，使它的終濃度為10μg/mL，4℃反應20min；直接加入4%多聚甲醛固定液，與培養液按1∶3混合，固定細胞10min；棄上清，50%甘油封片，熒光顯微鏡下檢測并獲取照片。②AO/EB熒光染色：向細胞中加入用0.01mol PBS溶解的AO、EB，終濃度為50μg/mL，37℃染色10min；PBS洗脫2次，每次3min。50%甘油封片，熒光顯微鏡下檢測并獲取照片。

1.6 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

取對生長的細胞接種于培養瓶后收集細胞，1 000r/min離心10min，取沉淀加核裂解液(0.121g Tris，Nacl 0.8766g，EDTA 0.372，SDS 4g，溶至100mL去離子水中，臨用前加入蛋白酶K 100μg/mL)1mL，37℃裂解過夜，次日從水浴中取出，加1mL飽和酚抽提，6 000r/min離心5min，取上清液加1mL氯仿：異戊醇(24∶1)抽提，6 000r/min離心5min，取上清加50μL 3mmol/L乙酸鈉和2mL冷凍無水乙醇，置液氮中冰凍10min，取出12 000r/min離心10min，棄除上清，沉淀室溫放置30min晾干，加50μL TE緩沖液、5μl RNase，37℃水浴30min，加適量上樣緩沖液行1.5%瓊脂糖電泳檢測DNA降解條帶。

1.7流式細胞儀檢測凋亡

細胞接種于6孔板中，按1.5項下分組實驗，實驗結束，棄上清，用0.25% Trg消化，分別收集各組細胞于EP管中，以0.1mmol/L PBS(pH7.4)液洗滌1次，離心1 000r/min，5min，棄上清液。用190μL結合緩沖液懸浮細胞，加入5μL Annexin-V-FATC，混勻，避光室溫作用10min。再加10μL PI，混勻，避光室溫作用10min。補充結合液300μL，1h內上流式細胞儀檢測。

1.8細胞總蛋白的提取與測定

蛋白提?。悍謩e取1.7項下各實驗組細胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，吸干后多余水分，加IP組織細胞裂解液，按試劑盒說明書項下制備，混勻，4℃靜置30min；然后離心15min，取上清與BCA試劑混合，37℃ 30min，置酶標儀570nm波長處測定組織、細胞吸光度值(A值)，按公式計算出總蛋白含量。

1.9蛋白質印跡法分析細胞凋亡相關蛋白的表達

取30mg細胞總蛋白經10% SDS-PAGE凝膠電泳，轉移至PVDF膜上，以10%脫脂奶粉封閉后，分別與Caspase 3 (cell signaling，USA，1∶1 000)、Caspase 8(cell signaling，USA，1∶1 000)、Caspase9(cell signaling，USA，1∶1 000)、Bax(cell signaling，USA，1∶1 000)、Bcl-2(cell signaling，USA，1∶1 000)、GAPDH(cell signaling,USA;1∶1 000)，4℃孵育過夜，洗滌后再加第二抗體山羊抗兔HRP標記IgG(Santa Cruz，Biotechnology，USA，1∶3 000)，37℃雜交70min，化學發光、顯影、壓片。膠片結果采用Gel-pro Analyzer(Bio-Rad)成像系統進行圖像和數據處理，每項檢測均采用不同樣本重復3次。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度薏苡仁油對卵巢癌SKOV3細胞的影響

MTT試驗顯示不同濃度薏苡仁油(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL)分別作用于SKOV3細胞，與對照組比較，薏苡仁油50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用于SKOV3細胞24h、48h、72h存活率比較差異無統計學意義(t值0.563～1.027，P>0.05)。與對照組相比，400μg/mL和500μg/mL薏苡仁油濃度可在處理后24h、48h和72h顯著降低SKOV3細胞存活率(t值4.635～5.231，P<0.05)，其作用隨著時間的延長而增加，提示高濃度薏苡仁油對SKOV3細胞具有殺傷作用。因此，觀察薏苡仁油對SKOV3細胞的凋亡較好濃度選擇應為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，作用時間在48h較好，見表1。

表1 薏苡仁油對不同時間段卵巢癌細胞株SKOV3存活率的影響Table 1 Effect of Coix seed oil on the survival rate of SKOV3 ovarian cancer cells in different

2.2 不同濃度薏苡仁油對卵巢癌SKOV3細胞形態的影響

Hoechst33342/PI染色后，通過熒光顯微鏡可以觀察，對照組細胞呈均勻的藍色熒光，經薏苡仁油50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用48h后，隨著濃度的增加，凋亡細胞增多，細胞膜與細胞核呈濃縮、致密的強藍色熒光，出現凋亡小體，表明薏苡仁油可誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡，見圖1。AO/EB染色后，通過熒光顯微鏡可以觀察，對照組細胞呈均勻的綠色熒光，經薏苡仁油50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用48h后，隨著濃度的增加，凋亡細胞增多，細胞膜與細胞核呈濃縮、致密的亮黃色熒光，出現凋亡小體，表明薏苡仁油可誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡，見圖2。

圖1 Hoechst33342/PI染色薏苡仁油促進卵巢癌細胞株SKOV3的凋亡Fig.1 Hoechst33342/PI staining of Coix seed oil promoted apoptosis in SKOV3 ovarian cancer cells

圖2 AO/EB染色薏苡仁油促進卵巢癌細胞株SKOV3的凋亡Fig.2 AO/EB staining of Coix seed oil promoted apoptosis in SKOV3 ovarian cancer cells

2.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測卵巢癌SKOV3凋亡的影響

薏苡仁油50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL作用于SKOV3細胞48h后，經DNA瓊脂糖凝膠電泳后，凋亡細胞的DNA降解形成具有凋亡特征的梯形條帶，該條帶隨著薏苡仁油濃度的增高而增多，而對照組無梯形條帶。

2.4 不同濃度薏苡仁油對卵巢癌SKOV3凋亡的影響

不同濃度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL組薏苡仁油作用于SKOV3細胞48h后，與對照組相比較，細胞凋亡均顯著增多(t值分別為2.536、3.012、4.908，均P<0.05)，其中200μg/mL組細胞總凋亡率高達(27.10±5.42)%，見圖4和表2。

圖3 SKOV3細胞凋亡DNA凝膠電泳圖Fig.3 DNA gel electrophoresis of apoptosis in SKOV3 ovarian cancer cells

A：流式細胞圖顯示結果；B：流式細胞術檢測定量結果。與對照組比較，*P<0.05。圖4 流式細胞術檢測不同濃度薏苡仁油對SKOV3細胞凋亡的影響A: flow cytometry results; B: quantitative results detected by flow cytometry.Comparison with control group,*P<0.05Fig.4 Effects of Coix seed oil at different concentrations on apoptosis in SKOV3 cells detected by flow cytometry

表2 不同濃度薏苡仁油對卵巢癌細胞株SKOV3凋亡的影響Table 2 Effects of Coix seed oil at different concentrations on apoptosis in SKOV3 ovarian cancer

2.5 薏苡仁油對卵巢癌SKOV3細胞凋亡基因表達的影響

不同濃度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL組薏苡仁油作用于SKOV3細胞48h后，與對照組相比較，各濃度組Bax、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白表達均顯著增高(t值2.436～5.709，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著下降(t值2.357～4.304，P<0.05)，差異均具有統計學意義，見圖5。

A和D：Western blotting檢測結果；B：Bax蛋白相對表達量；C：Bcl-2蛋白相對表達量；E：Caspase 3蛋白相對表達量；F：Caspase 8蛋白相對表達量；G：Caspase 9蛋白相對表達量。與對照組比較，*P<0.05圖5 不同濃度薏苡仁油對SKOV3細胞凋亡基因表達的影響A and D:Western blotting detection results;B:relative expression level of Bax protein;C:relative expression level of Bcl-2 protein; E:relative expression level of Caspase 3 protein; F:relative expression level of Caspase 8 protein; G:relative expression of Caspase 9 protein.Comparison with the control group,*P<0.05Fig.5 Effects of Coix seed oil at different concentrations on expression of apoptosis gene in SKOV3 cells

3討論

3.1 薏苡仁油對腫瘤細胞的影響

卵巢癌早期病變不易發現，晚期缺乏有效的治療手段，其致死率居婦科惡性腫瘤首位。對于大多數晚期卵巢癌患者，化療是卵巢癌術后輔助治療的重要手段，但是化療耐藥性的產生是導致卵巢癌治療失敗的重要原因，故尋找有效的抗癌藥物，對提高卵巢癌患者的生存率具有重要意義[5]。薏苡仁油具有廣譜的藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、慢性潰瘍、免疫調節、肺水腫等，是具有廣闊前景的抗腫瘤藥物，目前對薏苡仁油的研究集中在其對于消化系統腫瘤、泌尿系統腫瘤抑制細胞增殖和凋亡的方面。本研究以卵巢癌SKOV3細胞作為研究模型，探討薏苡仁油對SKOV3細胞的作用及其機制。MTT實驗發現隨著薏苡仁油作用時間的延長能夠顯著降低SKOV3細胞存活率，其機制可能與促進卵巢癌SKOV3細胞凋亡或抑制卵巢癌細胞的生長、增殖、轉移有關。

3.2 薏苡仁油對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的作用

細胞凋亡是通過激活細胞內在的“自殺”機制，導致細胞程序性死亡的方式之一，涉及到多基因表達、激活并受嚴格調控，細胞凋亡受到抑制會引發腫瘤的形成、轉移及其耐藥性的產生等。在此基礎上，多項研究發現薏苡仁油可通過不同信號通路抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡，如在肝癌、食管癌、結腸癌等腫瘤中均有明顯的抗癌作用[6]。因此，為了進一步觀察薏苡仁油體外誘導SKOV3細胞凋亡，本研究通過Hoechst33342/PI染色和AO/EB染色，發現經不同濃度的薏苡仁油作用后，SKOV3細胞中凋亡細胞增多。進一步通過DNA Ladder檢測，可見具有凋亡特征的梯形條帶。不同濃度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL組薏苡仁油作用于SKOV3細胞48h后，與對照組相比較，細胞凋亡均顯著增多(P<0.05)，其中200μg/mL組細胞總凋亡率高達(27.10±5.42)%，以上結果均證實薏苡仁油具有誘導SKOV3細胞凋亡的作用，隨著薏苡仁油濃度的增加，細胞凋亡更為明顯。

3.3 薏苡仁油對卵巢癌SKOV3細胞凋亡的機制

細胞凋亡有多種途徑，Bcl-2家族和Caspase家族是細胞凋亡中的重要組成部分。Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的中心環節，包括促凋亡基因和抑制凋亡基因。其中當Bax蛋白以同源二聚體存在時，易于誘發細胞凋亡，Bcl-2可以和Bax等分子形成異源二聚體，從而抑制細胞凋亡[7]。Caspase家族中目前認為細胞凋亡的起始者分別是Caspase 2、8、9、10等，執行者Caspase 多為Caspase 3、6、7等。其中關鍵分子分別為Caspase 8與Caspase 3[8]。本研究發現，與對照組相比較，50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL組薏苡仁油濃度作用于SKOV3細胞48h后，各濃度組Bax、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白表達均顯著增高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著下降(P<0.05)。通過進一步western blotting實驗結果顯示隨著薏苡仁油的濃度升高，Caspase 3和Caspase 9蛋白表達量均逐漸增加，推測可能與Bcl-2升高在線粒體膜上形成通道蛋白，使線粒體跨膜電位下降，激活Caspase家族酶聯反應，從而誘發SKOV3細胞凋亡有關。同時，薏苡仁油Caspase 3的活化進一步促進了Bcl-2/Bax的比值增高，誘發線粒體的凋亡途徑[9]。

綜上所述，薏苡仁油顯著抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖并促進其凋亡，可能與Bcl-2表達降低、Bax和Caspase蛋白表達升高有關。薏苡仁油通過促進凋亡蛋白表達抑制卵巢癌細胞的增殖、浸潤與轉移，本研究結果將為卵巢癌治療提供新的方向。