羊水性染色體嵌合的細胞及分子遺傳學分析

崔 科，白 霞，剡紅民，賈 婷，強 榮

(西北婦女兒童醫院，陜西 西安 710061)

單個受精卵產生并具有兩種或多種不同基因型的細胞群的個體稱為嵌合體，其中具有兩種或多種性染色體核型的嵌合體為性染色體嵌合體[1]。性染色體嵌合可能會導致胎兒性器官發育不完全，增加生殖細胞腫瘤的發病風險，且異常核型位置、所占比例等的多樣性增大了產前診斷和遺傳咨詢的復雜性[2]。染色體核型分析技術是產前診斷中染色體嵌合體檢測的“金標準”，可以檢出非整倍體以及較大片段的核型異常，但其診斷周期長，且對于染色體的微小缺失和重復無法明確診斷，而染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)、染色體拷貝數變異(copy number variation，CNV)檢測對于染色體微缺失/微重復等的檢出具有獨特優勢，但不能檢出染色體平衡易位、倒位以及低比例異常嵌合[3]。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術可以直接檢測未培養羊水細胞間期細胞，明確胎兒染色體結構異常的來源和準確定位斷裂點，對最常見的非整倍體作出快速的產前診斷[4]。

本研究擬探討細胞和分子遺傳學技術聯合應用在性染色體嵌合體產前診斷中的價值，以為羊水性染色體嵌合體的遺傳咨詢提供參考。

1研究對象與方法

1.1研究對象

選取2018年1月至2020年12月在西北婦女兒童醫院產前診斷中心符合介入性產前診斷指征并行羊膜腔穿刺術，接受細胞和/或分子遺傳學分析的5 158名孕婦為研究對象，其中染色體核型分析和FISH檢測各5 158例，CMA檢測2 542例，CNV檢測770例，進一步分析40例性染色體嵌合體病例，對妊娠結局進行隨訪。所有孕婦及家屬均進行檢測前咨詢，并簽署產前診斷知情同意書。

1.2檢測方法

1.2.1采集羊水標本

經知情同意，孕婦在超聲引導下行羊膜腔穿刺術，抽取羊水30～40mL(棄去最初的1～2mL，以避免母體細胞污染)，其中羊水細胞染色體核型分析培養20mL，FISH檢測10mL，CMA/CNV檢測10mL。

1.2.2染色體核型分析

將20mL羊水分別注入2支無菌離心管，離心后在無菌操作條件下接種于2個培養瓶中，獨立于2個培養箱中靜置培養，設置培養條件為37℃和5%～6%CO2。觀察細胞生長情況，7d后換液，上清液置于第3個培養瓶中繼續培養備用，原培養瓶加培養基后繼續培養。2～3d后，進行原位收獲、制片和常規G顯帶。計數20個分裂相細胞，分析5個核型，記錄染色體數目和結構異常情況，若出現嵌合型或異常核型則加大計數。

1.2.3 FISH檢測

對10mL羊水標本選用產前診斷染色體檢測試劑盒探針(北京金菩嘉醫療科技有限公司)，按說明書進行常規操作處理。其中綠色的CSPX探針定位于Xp11.1-q11.1，紅色的CSPY探針位于Yp11.1-q11.1。熒光顯微鏡下對細胞進行分析計數，正常細胞占比>90%為正常樣本，異常細胞占比>60%為異常樣本，異常細胞占比10%～60%為嵌合型。

1.2.4 CMA/CNV檢測

對未培養的10mL羊水，按照Wizard?基因組DNA 純化試劑盒(中國北京天根生化公司)說明書進行操作，提取基因組DNA。知情同意后，根據孕婦的選擇，進行CMA或CNV檢測。CMA檢測：選取SurePrint G3 Human CGH Microarray 8×60K CGH芯片(美國 Agilent 公司)，操作步驟嚴格遵循Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit試劑盒說明書。CNV檢測：使用NextSeq CN500測序平臺測序。參考DGV、UCSC、DECIPHER、ISCA、ClinGen、OMIM、NCBI PubMed等數據庫對檢測出的CNVs進行解釋和分析。

1.3診斷標準

當兩種及以上培養物中均出現兩個及以上的異常核型且異常核型相同為真嵌合體；兩種及以上培養物中均出現不同的異常核型，或兩種及以上培養物中只存在單個異常細胞，或不同核型均只在相同培養物中存在為假嵌合體[5]。

2 結果

2.1 產前診斷指征

5 158例羊水樣本中檢出40例性染色體嵌合體，發生率為0.78%。產前診斷指征包括無創產前基因檢測(noninvasive prenatal testing，NIPT)異常(26例，65.00%)、NIPT性染色體異常(4例，10.00%)、血清學篩查高風險(4例，10.00%)、高齡(3例，7.50%)、羊水過多(1例，2.50%)、羊水偏多(1例，2.50%)和單臍動脈(1例，2.50%)，見表1。

2.2染色體核型分析結果

檢出的40例性染色體嵌合體中，5例(12.50%)為染色體結構異常嵌合體，35例(87.50%)為染色體數目異常嵌合體，見表1。染色體結構異常嵌合體的具體情況為：(1)病例1：染色體核型分析顯示其存在45,X和疑似衍生X染色體46,X,?der(X)兩種細胞系，結合FISH及CNV檢測結果，確定染色體核型為45,X[61]/46,X,psu idic(X)(p11.4)[39]，結構異常X染色體為假雙著絲粒染色體。(2)病例2和3：染色體核型分析顯示其為45,X和46,X,i(X)嵌合核型，經CMA檢測準確定位，確定結構異常X染色體為i(X)(qter→q10::q10→qter)。(3)病例4：染色體核型分析顯示其為45,X和46,X,del(X)嵌合核型，經CMA檢測準確定位，確定結構異常X染色體為del(X)(pter→q21:)。(4)病例5：見FISH檢測結果。

2.3 FISH檢測結果

在選擇FISH檢測的40例(100.00%)孕婦中，37例(92.50%)檢測結果與染色體核型分析結果一致，3例(7.50%)檢測結果與染色體核型分析結果不一致(見表1)，具體情況為：(1)病例5：染色體核型分析顯示其為45,X[23]/46,X,?del(Y)(q11.21)[26]嵌合體核型，但FISH檢測提示為X[23]/XYYY[45]/47,XYY[32]，結合CMA檢測結果，推測：①該樣本中同時存在X、XYYY和XYY三種細胞系；②XYYY細胞系中，除了正常Y染色體，還有雙著絲粒Y染色體；③XYY細胞系中，Y染色體是雙著絲粒染色體。(2)病例6：染色體核型分析顯示其為45,X[30]/46,XY[23]嵌合體核型，但FISH檢測提示為X[20]/XYY[70]/46,XY[10]，結合CMA檢測結果，推測：①該樣本中同時存在X、XYY和XY三種細胞系；②XYY細胞系中的Y染色體是雙著絲粒染色體。(3)病例7：染色體核型分析顯示其為45,X[15]/46,XY[26]嵌合體核型，但FISH檢測提示為X[12]/XYY[68]/XY[26]，結合CMA檢測結果，推測：①該樣本中同時存在X、XYY和XY三種細胞系；②XYY細胞系中的Y染色體是雙著絲粒染色體。

2.4 CMA/CNV檢測結果

在選擇CMA/CNV檢測的28例(70.00%)孕婦中，22例(78.57%)檢測結果與染色體核型分析結果一致，6例(21.43)檢測結果與染色體核型分析結果不一致，見表1。

2.5 妊娠結局

檢出的40例性染色體嵌合體中，31例選擇終止妊娠(病例13因胎兒胎心減慢引產)，終止妊娠率為77.50%；9例選擇繼續妊娠(8例順產，1例剖宮產，均未見異常，病例2 性染色體異常細胞系比例較高)，繼續妊娠率為22.50%，見表1。

表1 40例性染色體嵌合體的臨床資料和遺傳學檢測結果Table 1 Clinical data and genetic test results of the 40 cases with sex chromosome mosaicism

3討論

3.1 性染色體嵌合體的臨床特征

染色體嵌合體形成的主要原因為受精后有絲分裂期間的不分離錯誤或染色體丟失，在染色體正常的受精卵中，異常核型細胞出現得越早，其所占比例越大[6]。NIPT通過檢測母體血漿中的胎兒游離 DNA來篩查胎兒非整倍體，已經被廣泛用于21三體、18三體和13三體的產前篩查。盡管NIPT對嵌合體檢測的靈敏度和特異度較低，但仍具有重要的提示作用。本研究表明性染色體嵌合體的產前診斷指征主要為NIPT異常，劉文等[7]的研究也發現42.11%的胎兒染色體嵌合體的羊水標本為NIPT提示異常的標本。本研究中77.50%的檢測出性染色體嵌合體的孕婦選擇引產，高于既往研究的終止妊娠率[8]。雖然染色體嵌合的臨床表現與異常染色體的數目和種類有關，但發育障礙與染色體嵌合比例的關系尚未有定論，且性染色體嵌合體常在青春期后才出現生殖器發育異常、生育能力低下等癥狀，因此對性染色體嵌合體的遺傳咨詢仍需謹慎解釋，合理選擇是否終止妊娠。

3.2 細胞和分子遺傳學技術的對比

傳統的細胞遺傳學染色體核型分析技術可以檢出染色體數目異常和部分結構重排，但不能準確診斷染色體小片段結構異常和復雜易位斷裂點。本研究中染色體核型分析技術無法分辨出病例1～4的假雙著絲粒染色體、確定結構異常染色體具體的斷裂點，而聯合CMA/CNV分子遺傳學技術，不僅可以檢測微小缺失或重復，還可以綜合分析檢測結構，確定突變類型或定位微缺失/重復斷裂點等[9]。在病例5～7中，由于FISH和CMA/CNV檢測采用培養前的羊水標本，檢測出的45,X細胞所占比例低。而進行染色體核型分析時，由于45,X細胞系為優勢生長趨勢明顯的細胞系，羊水培養后該細胞系比例高，染色體結構異常的XYY和XYYY細胞系比例較低，且雙著絲粒Y染色體在300-500條帶的G顯帶時不易分辨，導致核型未能檢出。因此，由于采用培養前的羊水標本，避免了細胞培養后優勢細胞增長等情況，FISH和CMA/CNV分子遺傳學技術的檢測結果更能真實反應樣本情況[10,11]。本研究顯示部分CMA/CNV檢測結果與染色體核型分析及FISH檢測結果不一致，可能是由于CMA/CNV技術在檢測過程中需要對樣本DNA進行PCR擴增，使得原有嵌合比例發生變化，導致無法檢出較低比例嵌合體。李顯箏等[12]也認為對低比例嵌合體的產前診斷，FISH檢測優于CMA/CNV檢測。

3.3 細胞和分子遺傳學技術聯合應用在產前診斷的價值

羊水染色體核型分析是目前最常用且可靠性較高的產前診斷細胞遺傳學方法，但其細胞培養周期較長、檢測分辨率低，存在漏診和誤診的可能性。真嵌合會出現多種器官和智力發育障礙，而假嵌合會導致不必要的產前干預，給孕婦及其家屬帶來極大的身體和心理負擔[13]。FISH和CMA/CNV分子遺傳學技術具有診斷周期短、高通量、結果可靠等優點。聯合細胞和分子遺傳學技術可實現不同檢測方法的優勢互補，有效提高產前診斷性染色體嵌合體的準確性。本研究表明FISH和CMA/CNV檢測與染色體核型分析結果具有較高的一致性。Dai等[14]對4 953例具有羊膜腔穿刺術指征的孕婦進行羊水細胞染色體核型分析和FISH檢測進行產前診斷，3例為性染色體嵌合體。Zhang等[15]對104例染色體嵌合體進行分析，其中28例聯合應用染色體核型分析和CMV檢測，其認為需要采用不同的檢測方法對性染色體嵌合的檢測結果進行驗證。因此，在性染色體嵌合體的產前診斷中聯合細胞和分子遺傳學技術有助于避免醫生誤判，有針對性地開展遺傳咨詢，有效減少對孕婦及其家屬的身心傷害。

綜上所述，羊水染色體核型分析是產前診斷性染色體嵌合體的重要方法，應聯合細胞和分子遺傳學檢測技術全面地對性染色體嵌合體進行鑒別性產前診斷，以為羊水性染色體嵌合體的遺傳咨詢提供參考。