番鴨源鴨疫里默氏桿菌的耐藥性及rpoB基因突變分析

林彬彬，謝碧林，王秀禎，翁漢東，程龍飛，傅光華，劉榮昌，林志敏

（1. 莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 福建 莆田 351144；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA），屬黃桿菌科（Flavobacteriaceae），革蘭氏陰性，無芽孢，無鞭毛，可形成莢膜，能感染鴨、鵝[1]、火雞和其他禽類，引起的傳染性漿膜炎是影響全世界養(yǎng)鴨業(yè)的一種接觸性、敗血癥型傳染病[2]。主要感染1～8周齡的雛鴨，惡劣的環(huán)境和不良的飼養(yǎng)管理會增加該病的死亡率，最高可達(dá)75%[3]，耐過鴨表現(xiàn)生長遲緩、料重比下降、消瘦和胴體品質(zhì)下降。從分子水平研究鴨疫里默氏桿菌耐藥性的機(jī)制機(jī)理，了解相關(guān)基因突變對鴨疫里默氏桿菌耐藥性的影響具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，疫苗對同血清型野毒的免疫保護(hù)較好，但如果流行的血清型發(fā)生變化，則免疫效果大打折扣，因此，抗生素仍然會被應(yīng)用于該病的預(yù)防或治療。然而，隨著抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛甚至不合理使用，鴨疫里默氏桿菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，耐藥譜也在不斷擴(kuò)大。不少學(xué)者也從分子水平上對鴨疫里默氏桿菌的耐藥機(jī)制展開研究。Sun等[4]對中國南方地區(qū)的103株鴨疫里默氏桿菌分離株的研究發(fā)現(xiàn)，gyrA、parC基因的突變與鴨疫里默氏桿菌對喹諾酮產(chǎn)生耐藥有關(guān)。Xing等[5]對中國80株鴨疫里默氏桿菌分離株的研究，發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏桿菌基因組多重耐藥區(qū)中ermF、ermFU和ereD基因與紅霉素抗性相關(guān)。利福平（Rifampicin，RFP）為利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，對多種病原微生物均有抗菌活性，在許多獸醫(yī)臨床藥物組方中廣泛使用。然而，近些年來報道的鴨疫里默氏桿菌分離株對利福平的耐藥情況呈逐漸上升趨勢[6-7]，利福平對傳染性漿膜炎的治療效果越來越差。有研究表明，細(xì)菌對利福平的主要耐藥機(jī)制是由利福平耐藥基因rpoB突變引起的[8]，此外藥物外排泵作用也是導(dǎo)致利福平耐藥的機(jī)制之一[7]。【本研究切入點(diǎn)】莆田市是福建省小日齡水禽交易的集散地，年交易數(shù)量超億羽，分析莆田地區(qū)鴨疫里默氏桿菌rpoB基因的突變情況，可以在一定程度上代表全省的流行情況及基因突變情況。【擬解決的關(guān)鍵問題】對鴨疫里默氏桿菌分離株rpoB基因序列進(jìn)行比對分析，探究rpoB基因突變情況與鴨疫里默氏桿菌利福平耐藥的相關(guān)性，為今后尋找新的藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2019-2021年，收集莆田市荔城區(qū)、秀嶼區(qū)等番鴨養(yǎng)殖場（戶）疑似傳染性漿膜炎的死亡番鴨，剖檢見纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎，無菌采集腦部、心臟或肝臟等組織57份。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）、麥康凱瓊脂，購自北京索萊寶科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；新生胎牛血清，購自浙江天杭生物科技股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、GeneRed核酸染料，購自天根生化科技有限公司。

1.1.3 試驗儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，DHP-9052，上海申賢；CO2培養(yǎng)箱，BPN-50CH，上海一恒；恒溫?fù)u床，SHZ-82A，國華企業(yè)；高速臺式冷凍離心機(jī)，TGL-16M，湖南湘儀；PCR儀，Genesy96T，西安天隆；水平電泳儀，DYY-12，北京六一；凝膠成像分析系統(tǒng)，Gel Doc XR+，美國BIO-RAD；微量移液器，德國Eppendorf。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定 病料劃線接種于TSA平板（含2%新生牛血清）上，置5%CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌生長情況。然后挑取單個典型菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化后的菌落挑少量接種于麥康凱平板。純化后的菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢。挑純化的菌落個數(shù)，接種于TSB（含2%新生牛血清）中，置37 ℃搖床中，160 r·min-1，震蕩培養(yǎng)24 h。將菌液保存于30%甘油保存液中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 菌株基因組DNA的提取 取純化后的細(xì)菌培養(yǎng)液，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離株的DNA，用100 μL TE緩沖液溶解所提取的DNA，放入-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計與合成 參照文獻(xiàn)[7，9]合成 RA 16S rDNA特異性引物、rpoB基因擴(kuò)增引物，引物序列及相關(guān)反應(yīng)參數(shù)見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，稀釋為10 μmol·L-1，冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列及相關(guān)參數(shù)Table 1 Primer sequence and related parameters

1.2.4 菌株的PCR鑒定 以RA 16S rDNA特異性引物進(jìn)行菌株的鑒定，PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×TaqPCR MasterMix 10 μL；上下游引物各0.5 μL；模板DNA 1 μL；ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序：96 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將所得測序結(jié)果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast在線分析。

1.2.5 菌株的耐藥表型測定 根據(jù)CLSI（2018）[10]的要求，采用K-B紙片擴(kuò)散法測定分離株對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類、酰胺醇類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、多肽類和利福霉素類等9類28種抗菌藥物的敏感性。

用接種環(huán)挑取經(jīng)純化鑒定的菌落接種于TSB（含2%新生牛血清）液體培養(yǎng)基中，置37 ℃搖床中，160 r·min-1，培養(yǎng)24 h后，取少量培養(yǎng)液使用細(xì)菌比濁管和滅菌生理鹽水調(diào)整菌液菌株含量約為1×108CFU。取100 μL調(diào)整后的菌液于TSA平板（含2%新生牛血清）上并用無菌涂布棒均勻涂布，待晾干數(shù)分鐘后，用無菌鑷子夾取不同的藥敏紙片間隔一定距離貼于TSA平板上，置5%CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察記錄結(jié)果。結(jié)果參照CLSI（2018）標(biāo)準(zhǔn)判定各分離菌株對28種抗菌藥物的敏感性。

1.2.6rpoB基因的擴(kuò)增及分析 以rpoB基因擴(kuò)增引物，擴(kuò)增各分離株中的rpoB基因片段。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×TaqPCR MasterMix 25 μL；上下游引物各1 μL；模板DNA 2 μL；ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序：96 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，利用DNASTAR Lasergene 7.0分子生物學(xué)軟件中的Clustal W程序?qū)⑺鶞y序列及其翻譯氨基酸序列與參考菌株的相應(yīng)序列ATCC 11845（登錄號：AFD56686.1）、CH3（登錄號：AIH01966.1）、HXb2（登 錄 號：AQY22366.1）、Yb2（登 錄 號：AKQ39593.1）、RCAD0392（登錄號：QOZ86257.1）進(jìn)行比對，分析rpoB基因的突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果

共分離到49株疑似鴨疫里默氏桿菌，在5%CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，TSA平板（含2%新生牛血清）上，這些菌株均形成稍隆起于培養(yǎng)基表面、邊緣整齊、半透明、直徑為0.5～1.5 mm的圓形小菌落，經(jīng)斜射光觀察可見淡藍(lán)色光澤；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長；革蘭氏染色鏡檢可見兩端鈍圓、單個或少數(shù)成對出現(xiàn)的革蘭氏陰性短桿菌。在TSB液體培養(yǎng)基（含2%新生牛血清）內(nèi)生長渾濁，底部有沉淀。

2.2 細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果

以RA 16S rDNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，49株細(xì)菌均可擴(kuò)增出與預(yù)期960 bp大小相近的單一條帶，部分菌株的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。測序獲得的序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示，與鴨疫里默氏桿菌相似性均超過99%，確定所分離的49株菌株均為鴨疫里默氏桿菌。

圖1 鴨疫里默氏桿菌的16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 Electrophoretogram of 16S rDNA amplification of R. anatipestifer

2.3 細(xì)菌的耐藥表型分析

49株鴨疫里默氏桿菌對9類28種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表2。按藥物類別分析，分離菌株對氨基糖苷類和磺胺類全部耐藥，對大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類和利福霉素類藥物的耐藥性也很高，對酰胺醇類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感性較高。按具體藥物分析，49株菌株中，90%以上菌株敏感的藥物有：頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢克肟、頭孢吡肟、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素和氟苯尼考等。本研究中，對利福平敏感的菌株只有5株，耐藥的有44株，高達(dá)89.80%。

表2 49株鴨疫里默氏桿菌分離株對28種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果Table 2 Test results on drug sensitivity of 49 R. anatipestifer isolates to 28 antibiotics %

49株鴨疫里默氏桿菌分離株的多重耐藥性情況見表3，所有分離株均表現(xiàn)為多重耐藥性，耐藥譜介于11～21種藥物，主要集中在12～14種藥物，對13種抗菌藥物耐藥的菌株最多，達(dá)34.69%。

表3 49株鴨疫里默氏桿菌分離株的多重耐藥性Table 3 Multidrug resistance of 49 R. anatipestifer isolates

2.4 rpoB基因突變分析

以rpoB基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，49株分離菌均擴(kuò)增出單一條帶，位于783 bp處，如圖2所示。測序后與RA參考序列rpoB基因氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)48株分離株的利福平耐藥決定區(qū)氨基酸出現(xiàn)了單點(diǎn)突變，突變類型有2種，分別為R494K、H491N；1株分離株的利福平耐藥決定區(qū)氨基酸出現(xiàn)了雙點(diǎn)突變，為V382I和R494K。R494K的單點(diǎn)突變最多見，共44株，占89.80%，其中43株耐利福平，1株對利福平敏感；H491N的單點(diǎn)突變有4株，占8.16%，均為利福平敏感菌；V382I和R494K的雙點(diǎn)突變僅有1株，為利福平耐藥菌（表4）。

表4 49株鴨疫里默氏桿菌耐藥株rpoB基因突變位置Table 4 Mutation locations of rpoB gene in 49 resistant strains of R. anatipestifer

圖2 鴨疫里默氏桿菌rpoB基因PCR電泳Fig. 2 Electrophoretogram of rpoB gene amplification of R. anatipestifer

3 討論

近年來，養(yǎng)殖場鴨疫里默氏桿菌的感染發(fā)病呈不斷上升趨勢，番鴨的感染情況也在逐年增長[11-12]。本研究采集福建省莆田市番鴨養(yǎng)殖場（戶）疑似發(fā)生鴨傳染性漿膜炎死亡番鴨的腦、心臟、肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離純化，并經(jīng)16S rDNA的PCR鑒定，共分離鴨疫里默氏桿菌49株。

鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，但各血清型間缺乏有效的交叉保護(hù)，使得鴨疫里默氏桿菌疫苗免疫效果不佳，臨床上常用藥物來防治鴨傳染性漿膜炎，但藥物的不規(guī)范使用造成RA耐藥菌株增多，多重耐藥性的情況經(jīng)常可見[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，分離的49株鴨疫里默氏桿菌呈明顯的廣譜耐藥性，耐藥譜介于11～21種藥物之間。程龍飛等[6]對2006-2012年間福建省及鄰近省份分離的423株鴨疫里默氏桿菌的藥敏試驗結(jié)果表明，50%以上菌株對多黏菌素B、卡那霉素、復(fù)方新諾明、林可霉素、四環(huán)素、克林霉素、利福平和氟哌酸耐藥，50%以上菌株對氟苯尼考、頭孢拉定、頭孢氨芐、阿莫西林、頭孢唑啉和壯觀霉素敏感。本研究分離的菌株，對多黏菌素B、卡那霉素、復(fù)方新諾明、利福平、諾氟沙星也是耐藥的，但對四環(huán)素敏感。左春生等[16]對分離自河南省的14株鴨疫里默氏桿菌分離株的藥敏試驗結(jié)果表明，分離株對氟苯尼考、阿莫西林、磺胺異噁唑、多黏菌素B和多西霉素耐藥性較高，對阿米卡星、鏈霉素和頭孢曲松較為敏感。本研究分離的菌株，對多黏菌素B也是耐藥的，但對氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、頭孢曲松的敏感性高，對阿米卡星、鏈霉素耐藥。朱元軍等[17]對分離自福建省的25株鴨疫里默氏桿菌的藥敏試驗結(jié)果表明，分離株對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、紅霉素、環(huán)丙沙星等高度耐藥，對四環(huán)素、強(qiáng)力環(huán)素和氟苯尼考的敏感性較強(qiáng)，本研究結(jié)果與其基本相近。由此可見鴨疫里默氏桿菌的耐藥性已普遍存在，且由于時間和地點(diǎn)的不同，耐藥性也存在一定的差異，警醒臨床上應(yīng)謹(jǐn)慎、合理地使用抗菌藥物。

程龍飛等[6]對2006-2012年間福建省及鄰近省份分離的423株鴨疫里默氏桿菌的利福平藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，51%的菌株對利福平耐藥。孫嘉凱[7]等對110株鴨疫里默氏桿菌的利福平耐藥性測定發(fā)現(xiàn)，89%的菌株對利福平有不同水平的耐藥性。而本研究對49株鴨疫里默氏桿菌的利福平藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，89.80%的菌株對利福平耐藥，表明鴨疫里默氏桿菌對利福平的耐藥性已普遍存在且有所增強(qiáng)。現(xiàn)有研究表明，細(xì)菌的rpoB基因編碼細(xì)菌RNA聚合酶β亞基，利福平能與RNA聚合酶β亞基結(jié)合，干擾細(xì)菌的RNA合成，而rpoB基因發(fā)生突變后，使得利福平無法與突變后的RNA聚合酶β亞基結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)菌對利福平耐藥，這是細(xì)菌對利福平的主要耐藥機(jī)制之一[8]。鴨疫里默氏桿菌也存在這種情況，刁東雪[18]發(fā)現(xiàn)，4株利福平耐藥鴨疫里默氏桿菌中，3株存在rpoB基因的單堿基突變，1株存在堿基的插入導(dǎo)致利福平耐藥決定區(qū)氨基酸的突變。SUN等[19]對18株鴨疫里默氏桿菌rpoB序列的比較分析和利福平最低抑菌濃度的測定，發(fā)現(xiàn)利福平耐藥決定區(qū)氨基酸的5個突變類型V382I、H491N、G502K、R494K和S539Y均與利福平耐藥有關(guān)，而3個突變類型T930A、A937T和T993A與利福平耐藥無關(guān)。劉玲俐等[20]將一株對利福平耐藥的鴨疫里默氏桿菌（RA-WH9）rpoB基因與對利福平敏感的CH3、HXb2、Yb2進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了5個利福平耐藥決定區(qū)氨基酸的突變，即D481Y、S539Y、T930A、A937T、T993A，其中D481Y的突變是否與利福平耐藥相關(guān)仍需進(jìn)一步的研究。本研究中，44株利福平耐藥菌的rpoB基因均沒有出現(xiàn)缺失突變或插入突變，但其中43株出現(xiàn)了單點(diǎn)突變，利福平耐藥決定區(qū)氨基酸的突變類型出現(xiàn)比例最高的為R494K（43/44）；1株出現(xiàn)了雙點(diǎn)突變，為R494K和V382I，這些突變均在SUN[19]等的報道中出現(xiàn)。但是本研究中，R494K和H491N兩種單點(diǎn)突變類型也分別在1株和4株利福平敏感菌中發(fā)現(xiàn)，據(jù)此我們認(rèn)為，利福平耐藥決定區(qū)氨基酸的突變可能不是決定細(xì)菌對利福平耐藥的唯一機(jī)制。根據(jù)突變類型的比例、耐藥菌和敏感菌的數(shù)量，推測莆田市鴨疫里默氏桿菌對利福平耐藥的主要機(jī)制之一是利福平耐藥決定區(qū)氨基酸的R494K單點(diǎn)突變。

4 結(jié)論

本研究共分離到49株鴨疫里默氏桿菌菌株，呈明顯的廣譜耐藥性，耐藥譜介于11～21種藥物之間，分離株對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、復(fù)方新諾明、多黏菌素B和利福平等藥物的耐藥性高，對四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類和氟苯尼考等藥物的敏感性高。莆田市鴨疫里默氏桿菌對利福平耐藥的主要機(jī)制之一是利福平耐藥決定區(qū)氨基酸的R494K單點(diǎn)突變。