閩西南黑兔NPFFR2基因的克隆與序列分析

桑 雷，孫世坤，陳冬金，王錦祥，高承芳，陳巖鋒，謝喜平

（福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013）

0 引 言

【研究意義】閩西南黑兔是福建省優良地方品種，抗病力強、繁殖性能好、適應性強，肉質好，在閩西和閩南地區深受歡迎[1]。隨著市場的擴大，常常需要將閩西南黑兔輸送到離生產場所較遠的地域進行銷售，在運輸過程中閩西南黑兔容易產生應激。而應激會刺激內分泌系統，導致下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic pituitary adrenocortical，HPG）功能失調[2-3]，從而致使糖皮質激素分泌紊亂，最終會引起焦慮，損壞飲食行為、認知功能、晝夜節律和免疫功能[4]?！厩叭搜芯窟M展】神經肽FF（Neuropeptide FF，NPFF）是RF（精氨酸-苯丙氨酸）氨基肽家族的一員，是哺乳動物體內以FLFQPQRFa-NH2形式存在的一種類酰胺化神經肽，該家族包括催乳素釋放激素（Prolactin releasing hormone，PRLH）、纈氨酸-苯丙氨酸神經肽（Neuropeptide VF，NPVF）以及親吻素（Kisspeptin）等多肽[5]。NPFF主要分布于中樞神經系統以及性腺、皮膚和腎上腺等外周組織[6-8]。最初，NPFF是從牛腦中分離的具有鎮痛作用的小肽[9]，隨著進一步的研究發現，NPFF可以抑制γ-氨基丁酸能（GABAergic）對室旁核小細胞的投射，通過室旁核直接刺激HPA軸，增加室旁核中c-Fos蛋白的表達，促進下游糖皮質激素的分泌和焦慮行為的產生[10]。此外，NPFF還是促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）的一種同源肽，在調節生殖、消化、抗炎以及心血管功能等方面發揮著重要的作用[11-12]。NPFF有兩種前體，分別為proNPFFA和proNPFFB。proNPFFA可以水解為N端含3個特異性氨基酸的NPFF肽以及含NPSF的多肽，proNPFFB則水解產生NPFF和含有LPLRFa的多肽[13]。NPFF主要通過NPFF的受體NPFFR1和NPFF2發揮生理作用。其中，NPFFR1的特異性較弱，能和多種內源性肽結合，NPFFR2特異性好，與proNPFFA水解得到的NPFF有更高的親和力，也是NPFF的主要受體[14-15]。Lin等報道敲除小鼠的NPFFR2基因，可以使抑制小鼠HPG軸的過度活躍和減緩面對壓力時的焦慮行為[16]。【本研究切入點】關于閩西南黑兔NPFFR2基因的相關研究，以及NPFFR2作為抑制NPFF作用和緩解閩西南黑兔運輸過程應激反應的靶位點的相關研究有待深入進行?！緮M解決的關鍵問題】以閩西南黑兔為研究對象，從下丘腦組織中克隆得到NPFFR2基因cDNA全長序列，并對NPFF2基因mRNA序列特征和結構、相關蛋白的結構和亞細胞分布以及該基因的遺傳進化進行初步分析，以期為閩西南黑兔抗應激研究奠定基礎，也為人類抑郁癥的研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與組織樣品采集

選用上杭鑫源烏兔合作社飼養的6只90日齡閩西南黑兔（公母各半）作為試驗兔，麻醉后屠宰兔子，迅速采集下丘腦組織保存在液氮中備用。

1.2 NPFF2基因的克隆

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 利用總RNA提取試劑盒（Invitrogen，USA）提取閩西南黑兔下丘腦組織中的總RNA，加入DNase I（TaKaRa，Japan）進行消化，RNA的含量和純度使用凝膠電泳和Nanodrop 2000紫外分光光度計（Thermo Scientific，USA）進行檢測，并調整總RNA質量濃度至1 μg·μL-1。取2 μL總RNA，利用SuperScriptTMII反轉錄酶（Invitrogen，USA）和Oligo（dT）18反轉錄成cDNA，具體步驟：在20 μL RNase-free的離心管中分別加入Total RNA 2 μg、Oligo（dT）181 μL、10 μmol·L-1dNTPs 1 μL、添加RNAase-free至15 μL；70 ℃，5 min變性，立即放到冰上；然后依次加入5×第一鏈 buffer 4 μL、0.1 mol·L-1DTT 2 μL、RNAase抑制劑 25 unit，SuperScriptTMII RTase 200 unit，混合上述成分，離心，42 ℃溫浴1 h，-20 ℃保存。

1.2.2NPFRR2基因的擴增 參考兔NPFRR2基因預測序列（Genbank號：XM_017347500.1）設計保守區段的擴增引物（表1），以閩西南黑兔下丘腦cDNA為模板，通過雙重PCR擴增獲得其中間序列。PCR反應體系（50 μL）：模板（其中第一輪為cDNA原液，第二輪為第一輪PCR擴增產物）1 μL、2×PCR Buffer 25 μL、20 μmol·L-1上 下 游 引 物 各1 μL、1.25 unit·μL-1DNA聚合酶 1 μL，ddH2O 21 μL。反應條件：94 ℃ 預變性1 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 15 s、68 ℃1 min，30個循環。在1%的瓊脂糖凝膠中電泳所得到PCR產物，對其進行切膠回收和測序。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers applied

根據所獲得兔NPFFR2基因的中間序列，設計5′-RACE、3′-RACE特異引物和驗證引物（表1）。5′-RACE和3′-RACE PCR反應按照RACE試劑盒（TAKARA SMARTer RACE 5′/3′ Kit）說 明 書 進行。將擴增出片段分別切膠純化回收后，連接到TVector pMDTM20載體（TaKara），經菌落PCR篩選后挑取克隆測序。

用DNAStar 8.0中的SeqMan拼接5′-RACE、3′-RACE和中間序列，得到NPFFR2基因的cDNA全長，并根據獲得的cDNA全長序列重新設計引物，通過PCR擴增后測序驗證。驗證PCR反應體系（50 μL）：模板2 μL、2×PCR Buffer 25 μL、20 μmol·L-1上下游引物各1 μL、1.25 unit·μL-1DNA聚合酶 1 μL，dH2O 20 μL。驗證PCR反應條件：94 ℃ 預變性1 min；98 ℃10 s、55 ℃ 15 s、68 ℃ 1 min，35個循環。

1.3 NPFF2基因的序列分析

1.3.1 mRNA二級結構預測分析 根據測序結果用RNAfold Web Server （http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/R NAWebSuite/RNAfold.cgi）在線預測mRNA的二級結構。

1.3.2 遺傳進化分析 利用遺傳進化軟件ClustalX和MEGA-X，對獲得的閩西南黑兔NPFFR2基因cDNA序列和人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、綿羊（Ovis aries）、貓（Felis catus）、狗（Canis lupus familiaris）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）等物種進行遺傳進化分析，其中人、豬、綿羊、貓、狗、大鼠、小鼠等其他物種cDNA序列自NCBI基因數據庫下載。采用NJ法（Neighbor-Joining Methods）進行分析，計算重復1000次（Bootstrap=1000），繪制遺傳進化樹。

1.3.3 蛋白基本理化特性分析 利用在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析閩西南黑兔NPFFR2蛋白的不穩定指數、等電點、平均疏水指數和脂肪族氨基酸指數。

1.3.4 蛋白結構和亞細胞定位預測 利用在線工具SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）、PredictProtein（https://predictprotein.org/）和SWISS－ MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對閩西南黑兔NPFFR2蛋白結構域和亞細胞定位進行預測。

2 結果與分析

2.1 NPFFR2基因的克隆

以閩西南黑兔下丘腦總RNA為模板，經逆轉錄后得到cDNA。用引物NPFFR2-F1/R1和NPFFR2-F2/R2進行雙重PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1.5 kb左右可見明亮的條帶，條帶大小與設計的目的片段長度基本一致（圖1-A）?；厥蘸筮M行測序，得到該片段序列，經與NCBI數據庫兔NPFFR2基因預測序列比對，確認獲得的序列為兔NPFFR2基因編碼區部分序列。經過5′-RACE兩輪PCR擴增，在600 bp左右得到預期的條帶（圖1-B），將上述條帶回收克隆測序后與預測序列比對，發現與預期結果相符。而3′-RACE PCR擴增也在600 bp左右獲得較彌散的擴增帶（圖1-C）。

圖1 閩西南黑兔NPFFR2基因電泳結果Fig. 1 PCR amplification of NPFFR2

2.2 NPFFR2基因變異

將2.1獲得的片段切膠回收克隆到載體中，涂抹平板挑選多個菌落測序，比對后發現有兩個克隆序列在3′-UTR（Untranslated region，非翻譯區）存在差異序列，且都與預測序列相關（圖2），因此推測NPFFR2基因可能存在2個異構體，暫時分別命名為轉錄異構體1（Transcript variant 1）和轉錄異構體2（Transcript variant 2）（圖2）。將 所有序 列通過Seqman軟件拼接到一起，根據拼接序列重新設計引物NPFFR2-F5/R5進行RACE擴增后，獲得1.8 kb左右的條帶（圖1-D），擴增出來的序列與預計長度大小一致。NPFFR2基因的兩個異構體（cDNA全長分別為1815 bp和1824 bp）擁有相同的79 bp 5′-UTR，相同的1245 bp編碼區，只是在3′-UTR存在差異，分別為491 bp和500 bp（圖2）。

圖2 閩西南黑兔NPFFR2基因cDNA序列3′-UTR的序列比對Fig. 2 Alignment of 3′-UTR cDNA sequence of NPFFR2 from Minxinan black rabbit

2.3 兔NPFFR2基因mRNA二級結構預測結果

采用RNAfold Web Server在線軟件預測NPFFR2基因不同轉錄異構體mRNA二級結構時發現，3′-UTR 78、84、113-116、123、128-129、302、340、344-349和367的核酸突變會改變NPFFR2基因mRNA二級結構，導致其轉錄異構體部分結構出現明顯差異（圖2和圖3）。

圖3 NPFFR2基因mRNA二級結構預測分析Fig. 3 Predicted secondary mRNA structure of NPFFR2

2.4 NPFFR2氨基酸序列分析

通過在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）推算NPFFR2基因，發現該基因編碼414個氨基酸，蛋白分子量47.083 kDa，理論等電點9.21，不穩定系數為42.86，半衰期30 h，脂肪族氨基酸指數106.43，平均疏水指數0.292。利用在線工具SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）、Predict Protein（https://predictprotein.org/）和SWISS－MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對閩西南黑兔NPFFR2蛋白結構域和亞細胞定位進行預測，發現其編碼蛋白為跨膜蛋白，存在7個跨膜螺旋結構，分別位于48～70氨基酸、82～104氨基酸、124～146氨基酸、159～181氨基酸、218～240氨基酸、271～293氨基酸和313～335氨基酸，胞外區位于1～46氨基酸、105～122氨基酸、183～217氨基酸和296～311氨基酸，胞內區則位于其余氨基酸（圖4）。

圖4 閩西南黑兔NPFFR2蛋白的結構和亞細胞定位預測Fig. 4 Predicted structure and subcellular localization of NPFFR2 of Minxinan black rabbit

2.5 NPFFR2基因的遺傳進化分析

利用clustalX和MEGA-X軟件將克隆的2條閩西南黑兔轉錄本異構體與人（3個異構體：NM_004885.3、NM_053036.3和NM_001144756.2）、小鼠（NM_133192.3）、大鼠（NM_023980.1）、豬（4個異構體：XM_021101419.1、XM_021101420.1、XM_021101421.1和XM_021101422.1）、綿羊（KC119399.1）、貓（XM_023253059.1和XM_003985291.5）、狗（XM_003639453.5）、負鼠（XM_001374915.2）、雞（NM_001034825.2）、草龜（XM_039541327.1）、非洲爪蛙（XM_002940351.5）、紅鰭東方鲀（NM_001098648.1）12物種18個核酸序列進行遺傳進化分析。采用Neighbor-Joining法，進行1000次重復檢測，構建系統進化樹，結果表明兔和人類遺傳距離最近；其次為與狗、貓、綿羊、豬、小鼠、大鼠和負鼠；與紅鰭東方鲀、非洲爪蛙、雞、龜等非哺乳動物的遺傳距離最遠（圖5）。

圖5 閩西南黑兔NPFFR2基因與其他物種的系統進化分析Fig. 5 Phylogenetic trees of NPFFR2 of Minxinan black rabbit and other animal species

3 討論與結論

NPFF主要通過與NPFFR2結合后發揮調節阿片鎮痛和抗焦慮等功能[16]。NPFFR2屬于G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCR），這類受體的三級結構中有7個跨膜的α螺旋，在第5和第6跨膜螺旋的胞內環有鳥苷酸結合蛋白的結合位點，即位于兔NPFFR2蛋白241～270氨基酸，與配體結合后NPFFR2構象發生改變，導致G蛋白發生激活，進而調控ERK和NF-κB通路，引起細胞狀態發生改變[17-18]。

本研究借助RACE技術，從閩西南黑兔的下丘腦組織中克隆出NPFFR2基因的cDNA序列全長，獲得了2個轉錄異構體，根據NCBI基因數據庫查詢發現，人、豬、貓等哺乳動物的NPFFR2基因也存在多個轉錄異構體。序列比對結果顯示，閩西南黑兔NPFFR2基因轉錄異構體核酸變異主要發生在3′-UTR，而人、豬、貓等動物轉錄異構體的核酸變異主要集中在5′-UTR，可能與品種和組織特異性有關[19]。3′-UTR是位于mRNA編碼區序列3′-端的非翻譯區，是重要的轉錄后調節區域，其通過與微小核糖核酸（Micro ribonucleic acid，miRNA）結合，對mRNA的亞細胞定位、穩定性、轉運和翻譯等生物學過程發揮重要的調控作用[20]。例如，李素雅等報道雞Lpin1基因3′-UTR g.77C＞G變異會引起多個miRNA結合位點丟失/增加[21]。陳安利等報道家蠶卵黃膜蛋白基因BmVMP233′-UTR 核酸發生變異，從而導致其表達量明顯下降[22]。3′-UTR與動物生產性能和人類疾病密切相關，該區域的變異有可能引起基因的表達異常，從而影響動物的生產性能或導致疾病的發生[23]。孫渭博等研究發現，骨成型蛋白受體1B基因（BMPR-1B）3′-UTR上1354位堿基A→G突變會影響綿羊胎產羔數[24]。此外，王芬等發現糖原合成酶激酶 3β 基因（GSK3B）3′-UTR存在多個與阿爾茨海默病相關的突變位點[20]。通過RNAfold Web Server在線軟件預測兔NPFFR2基因轉錄異構體mRNA二級結構發現，3′-UTR的多個變異導致NPFFR2基因mRNA二級結構部分區域發生明顯變化，結構的變化必然會導致miRNA結合位點發生變化，對NPFFR2轉錄勢必有影響，需要進一步的試驗進行驗證。

本研究分離克隆了閩西南黑兔NPFFR2基因的2種轉錄異構體，并利用生物信息學方法對其轉錄本和翻譯蛋白的結構和功能進行了預測，從而為進一步高效利用閩西南黑兔NPFFR2基因提供理論支持，對兔抗應激研究貢獻力量。