10個玉米ZmbZIP基因表達模式分析

賈利強，吳洪梅，曾科美，龍金云，鄭 飛，趙秋芳，陳 曙

（1. 貴州師范學院, 貴州 貴陽 550018；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院, 廣東 湛江 524091）

0 引言

【研究意義】玉米作為重要的糧食和經(jīng)濟作用，在保障糧食安全和種植者創(chuàng)收增效中發(fā)揮著重要作用。玉米生長周期內(nèi)，經(jīng)常遭受各種逆境脅迫因子的侵害，致使產(chǎn)量下降，經(jīng)濟收入遭受損失，培養(yǎng)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)抗逆性好的玉米新品種至關重要。bZIP蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子中種類最多、分布最廣的調(diào)控因子之一，其功能在越來越多的作物中進行研究，bZIP廣泛參與植物生長發(fā)育進程及逆境脅迫響應途徑。

基于此，以玉米自交系鄭58為試驗材料，人為模擬鹽、干旱、低溫和氮缺乏脅迫，系統(tǒng)研究bZIP基因的表達模式，可以為深入挖掘這些基因的功能提供有價值的科學數(shù)據(jù)。【前人研究進展】bZIP轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于真核生物中，包括酵母、動植物等，并在其生長發(fā)育進程中發(fā)揮著重要的作用。bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征是含有bZIP結(jié)構(gòu)域，包含N端保守的堿性蛋白基序和C端保守的亮氨酸拉鏈基序，前者功能為核定位信號和靶基因的標定，而后者的功能為二聚體化，激活下游基因的表達[1]。隨著基因組測序計劃的開展，越來越多的植物bZIP基因家族成員被報道出來。 擬南芥[2]編碼78個，葡萄[3]有55個，大棗[4]有45個，禾本科作物水稻[5]、玉米[6]、高粱[7]和蕎麥[8]分別有89個、125個、92個和96個，油料作物油菜[9]、大豆[10]和芝麻[11]各含有247個、131個和63個，茄科作物番茄[12]、馬鈴薯[13]和辣椒[14]分別有69個、80個和60個。根據(jù)序列相似性、保守蛋白基序和蛋白結(jié)構(gòu)等差異，擬南芥bZIP蛋白可以劃分為10個家族[1]，而在水稻中，可以劃分為11個亞家族[5]。bZIP基因廣泛參與植物生長發(fā)育進程及逆境脅迫響應途徑[15]，諸如生物或非生物脅迫、種子萌發(fā)，開花和種子發(fā)育、激素和糖信號轉(zhuǎn)導等[16-18]。FD蛋白，bZIP家族成員之一，調(diào)控植物開花[19]，而另一個成員，HY5蛋白抑制莖的伸長和側(cè)根發(fā)育[20]。越來越多的研究表明bZIP基因在植物抵御逆境脅迫進程中也發(fā)揮著重要作用，包括水分脅迫[21]、鹽毒害[22]、溫度脅迫[23]、激素信號轉(zhuǎn)導[23-25]、病蟲害[26-27]等。擬南芥AtbZIP1、AtABF3、AtbZIP24等基因參與調(diào)控擬南芥應答溫度脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫[28-29]。水稻中的OsbZIP23、OsbZIP71和OsbZIP52也參與調(diào)控各類逆境脅迫響應途徑，超表達OsbZIP23和OsbZIP71能顯著提高水稻的抗旱和抗鹽性能[3]，而OsbZIP52則負調(diào)控水稻抵御抗旱和抗冷性能[28]。大豆GmbZIP1、GmbZIP44、GmbZIP62和GmbZIP78也參與調(diào)控各類逆境脅迫響應途徑，超表達這些基因會提高大豆的抗逆性能[30-31]。擬南芥bZIP亞家族A、D、H和S等成員廣泛參與調(diào)控N吸收效率，其中AtbZIP1是傳遞N信號途徑的主要調(diào)控因子[32]，AtHY5和AtHYH等基因調(diào)控硝態(tài)氮、銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運體以及硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶活性[20,33]，小麥TabZIP60負調(diào)控氮素吸收和小麥產(chǎn)量[34]。【本研究切入點】玉米自交系鄭58作為我國重要的骨干核心種質(zhì)資源，在各類逆境脅迫處理下，包括高鹽、干旱、低溫和硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫下，ZmbZIP響應表達模式還未見報道。【擬解決的關鍵問題】本文利用人為模擬各類逆境脅迫，設置200 mmol·L-1的NaCl溶液、20%PEG6000、4 ℃低溫和硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫試驗，選取10個ZmbZIP基因，探測這些基因的應答表達模式，以期為進一步深入研究玉米bZIP基因生物學功能提供科學數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用到的試驗材料為玉米核心自交系鄭58，保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院玉米研究中心。玉米自交系鄭58授粉揚花期，采集根、莖、葉、花和授粉15 d的嫩穗，快速液氮處理，以備后用。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米ZmbZIP的生物信息學分析 本文研究中所涉及的基因、蛋白和CDS序列來自于Phytozome v9.1數(shù)據(jù)庫（http://www.phytozome.net/）、MaizeGDB（Maize Genetics and Genomics Database）數(shù) 據(jù) 庫（http://www.maizedb.org/）和TAIR （https://www.arabi dopsis.org/）。利用在線軟件ExPasy來分析玉米ZmbZIP蛋白的分子量大小和理論等電點（http://web.exp asy.org/cgi-bin/prot-param/protparam）。依據(jù)ZmbZIP基因的物理位置，利用Mapinspect繪制其在染色體上的分布（http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-ma pinspect.html）。根據(jù)ZmbZIP基因和CDS序列，利用在線軟件GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）來分析ZmbZIP基因結(jié)構(gòu)。本文中有10個ZmbZIPs和78個AtbZIPs蛋白序列構(gòu)成的數(shù)據(jù)矩陣，利用在線軟件MAFFT進行多重比對分析，剔除非保守蛋白序列，構(gòu)成保守的bZIP蛋白序列數(shù)據(jù)矩陣，用于進化樹分析。利用MEGA X軟件中的NJ算法來分析bZIP蛋白之間的進化關系，缺失數(shù)據(jù)參數(shù)選Pairwise Deletion，模型為P-distance，校驗參數(shù)Bootstrap重復次數(shù)為1000次。

1.2.2 非生物脅迫試驗 鄭58自交系種子經(jīng)5%次氯酸鈉溶液表面消毒，28 ℃黑暗催芽，生長于Holland營養(yǎng)液中，生長條件為28 ℃光照16 h，25 ℃黑暗8 h，生長至3葉1心期，進行非生物脅迫試驗。低溫脅迫試驗是將幼苗置于4 ℃培養(yǎng)箱中進行處理，模擬干旱或鹽脅迫處理是利用20% PEG6000或200 mmol·L-1的NaCl溶液對幼苗進行脅迫處理[35]，缺氮脅迫試驗，將正常生長的玉米幼苗（NH4NO3為氮素來源，總氮濃度為2 mmol·L-1）轉(zhuǎn)移至銨態(tài)氮或硝態(tài)氮缺乏（用KNO3或NH4Cl替換NH4NO3）的營養(yǎng)液中進行脅迫處理，總氮濃度保持在2 mmol·L-1水平。在脅迫處理的0、1、6、24 h后，收集對照植株（0 h）和處理植株的第2片葉用于實時定量PCR分析。每個處理3次生物學重復，每次生物學重復取5株幼苗。

1.2.3 RNA提取及定量PCR分析 利用華越洋植物RNA快速提取試劑盒提取各樣品的總RNA，檢測其濃度和純度后（NanoDrop ND-2000），按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書完成cDNA的合成和純化（Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）。反轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋至質(zhì)量濃度為100 μg·μL-1作為擴增模板。根據(jù)目的基因序列的保守性，利用Oligo 7設計特異性引物（表1），Actin作為內(nèi)參基因。實時定量PCR分析利用Roche Light Cycler 480 System（Roche，Basel，Switzerland）定量檢測系統(tǒng)，反應系統(tǒng)10 μL，包括 SYBR Premix EXTaqTMkit 5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 3 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性 2 min；95 ℃變性 5 s，55 ℃退火 5 s， 72 ℃延伸25 s，45個循環(huán)。根據(jù)2-△△CT算法計算基因的相對表達量。對于脅迫處理的試驗數(shù)據(jù)，將各處理0 h各基因表達量設定為1，并以此來計算其他時間點的相對表達量，并使用 （平均值±標準差）來表示。

表1 ZmbZIP基因表達分析的實時熒光定量引物Table 1 qRT-PCR primers for expression analysis on ZmbZIPs

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmbZIP生物信息學分析

為了研究玉米bZIP基因的表達信息，我們選取了10個ZmbZIP基因作為本文的研究對象，其基本信息見表2。10個ZmbZIP蛋白長度從121 aa（ZmbZIP101）～246 aa（ZmbZIP3），相應的分子量從13.41 kDa～26.83 kDa。大部分ZmbZIP蛋白的理論等電點呈中性或堿性，除了ZmbZIP3（PI=5.53）和ZmbZIP101（PI=4.77）（表2）。10個ZmbZIP基因散布于8個染色體上，其中Chr1和Chr3染色體上分別有2個基因，Chr2、Chr4、Chr5、Chr6、Chr7和Chr9上分別各有一個ZmbZIP（圖1A）。基因結(jié)構(gòu)分析顯示10個ZmbZIP基因的內(nèi)含子數(shù)目變化豐富，三個基因（ZmbZIP3、ZmbZIP41和ZmbZIP52）沒有內(nèi)含子，其他基因各含有3～12個內(nèi)含子不等（圖1 B）。10個ZmbZIP蛋白N端含有典型的bZIP結(jié)構(gòu)域，包括保守的堿性蛋白序列和亮氨酸拉鏈區(qū) （圖1 C）。這10個ZmbZIP基因在該家族進化樹上的位置特殊，可歸為一大類（圖1 D）。進化樹分析結(jié)果顯示10個ZmbZIP蛋白分屬于不同的5個蛋白家族，顯示10個ZmbZIP蛋白家族起源于不同的祖先蛋白，并沿著各自的進化途徑進化而來（圖1-D）。

表2 10個玉米bZIP基因基本信息Table 2 Basic information on 10 bZIP genes of Z. mays

圖1 10個ZmbZIPs的生物信息學分析Fig. 1 Bioinformatics of 10 ZmbZIPs

2.2 ZmbZIP組織特異性表達模式分析

為了明確ZmbZIP在玉米不同組織中的表達特異性，利用qPCR技術(shù)，在玉米授粉揚花期，檢測了10個ZmbZIP基因在玉米根、莖、葉、雄花和嫩穗中的表達模式。結(jié)果顯示10個ZmbZIP基因在玉米組織中的表達模式不同，7個ZmbZIP基因（ZmbZIP3、ZmbZIP8、27、41、52、101和ZmbZIP132）主要在玉米根系中表達，是其他組織器官的2倍以上，表明這些基因在玉米的根系生長發(fā)育進程中發(fā)揮著重要的生物學功能。ZmbZIP68呈組成型表達模式，ZmbZIP85主要在玉米根系和嫩穗中表達，而ZmbZIP74主要在雄花中表達，高于其他組織器官5倍以上（圖2）。ZmbZIP基因表達模式分析顯示該家族基因在玉米生長發(fā)育進程中發(fā)揮著重要的作用。

圖2 ZmbZIP基因在玉米不同器官中的表達模式分析Fig. 2 Expressions of ZmbZIPs in different maize tissues

2.3 葉片中ZmbZIP對鹽、干旱或低溫脅迫的響應

非生物脅迫諸如干旱、高鹽和低溫脅迫會對作物葉片造成明顯影響[36]，因此，本文重點分析了玉米葉片中10個ZmbZIPs應答3種脅迫時的表達模式。由圖3可知，10個ZmbZIP基因在應對不同逆境脅迫時的響應表達模式不同。在三種逆境脅迫1 h和6 h時，ZmbZIP74和ZmbZIP101的表達量分別上升了2倍以上，表明這2個基因可能同時參與3種逆境脅迫響應機制。ZmbZIP3和ZmbZIP68的表達至少受2種逆境脅迫的誘導（＞2倍），在NaCl脅迫24 h和低溫脅迫1 h時，ZmbZIP3表達量分別上調(diào)了4倍和21倍，ZmbZIP68表達量分別上升了至少2倍，表明這2個基因在這2種逆境脅迫中發(fā)揮著作用。ZmbZIP52、ZmbZIP85和ZmbZIP132受到NaCl脅迫的明顯誘導，在脅迫處理24 h時，其表達量分別上升了4倍、2.3倍和6倍，而在PEG6000和低溫脅迫時，這3個基因多數(shù)受到明顯的抑制，比如在脅迫處理3 h時，ZmbZIP85的表達量分別下降了78%和60%，這些數(shù)據(jù)表明10個ZmbZIP基因在應對不同逆境脅迫時呈現(xiàn)不同的表達模式，預示著這些基因可能在玉米抵御不同逆境脅迫時發(fā)揮多樣的功能。

圖3 玉米葉片中ZmbZIPs應答不同脅迫時的表達模式分析Fig. 3 Expression patterns of ZmbZIPs under stresses

2.4 ZmbZIP基因?qū)Φ狈γ{迫的響應

由圖4可知，葉片中ZmbZIP基因的表達模式在不同氮元素缺乏脅迫中變化比較大。一類是硝態(tài)氮缺乏脅迫對ZmbZIP基因的影響和銨態(tài)氮缺乏脅迫不同，這類包括基因有ZmbZIP3、ZmbZIP8、ZmbZIP27、ZmbZIP74、ZmbZIP85、ZmbZIP101和ZmbZIP132，這些基因中，銨態(tài)氮缺乏脅迫誘導ZmbZIP基因的表達，而硝態(tài)氮缺乏脅迫則抑制ZmbZIP基因的表達，比如ZmbZIP132在脅迫處理1 h時，硝態(tài)氮缺乏脅迫使該基因的表達下降了64%，而銨態(tài)氮缺乏脅迫則使該基因的表達上升了8倍，表明這些基因在響應硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫時的作用機制有差異。另一類是這2種脅迫處理對ZmbZIP基因的表達影響相似，如ZmbZIP68，該基因的表達同時受2類脅迫處理的抑制，表明該基因可能在應對這2類脅迫時起著類似的作用。

圖4 玉米葉片中的ZmbZIPs應答硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫的響應表達模式Fig. 4 ZmbZIP expression patterns in maize leaves in response to nitrate or ammonium deficiency

由圖5可知，玉米根系中ZmbZIP基因的表達模式受不同氮形態(tài)缺乏脅迫調(diào)控。ZmbZIP27、ZmbZIP41和ZmbZIP68同時受硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫的抑制，尤其ZmbZIP41受硝態(tài)氮缺乏脅迫的嚴重抑制，脅迫處理1 h時，其表達量比處理前下降超過99%，銨態(tài)氮缺乏脅迫使其表達量下降超過80%，表明這2個基因在硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫中發(fā)揮著類似作用。ZmbZIP3表達的變化趨勢在硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫中類似，都是先升后降，在脅迫處理1 h時，達到最大值，之后慢慢下降。ZmbZIP8、ZmbZIP74、ZmbZIP85和ZmbZIP132的表達模式在不同氮形態(tài)脅迫中趨勢相反，其中ZmbZIP8和ZmbZIP85受硝態(tài)氮缺乏脅迫的誘導而受銨態(tài)氮缺乏脅迫的抑制，而ZmbZIP74和ZmbZIP132則受銨態(tài)氮缺乏脅迫的誘導而受硝態(tài)氮缺乏脅迫的抑制。ZmbZIP基因在硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫中的不同表達模式預示著該基因在玉米應對氮缺乏脅迫中的不同作用。

圖5 玉米根系中的ZmbZIPs在硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫時的表達模式分析Fig. 5 ZmbZIP expression patterns in maize roots in response to nitrate or ammonium deficiency

3 討論與結(jié)論

作為糧經(jīng)飼三元糧食作物，玉米在保障全球及我國糧食安全方面發(fā)揮著重要作用。然而在其生長周期內(nèi)，經(jīng)常遭受各類逆境脅迫，造成產(chǎn)量減產(chǎn)，使種植者遭受經(jīng)濟損失。所以挖掘控制逆境脅迫的遺傳因子，解析其調(diào)控的分子生理機理，對于培育抗逆性好、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的玉米新品種顯得意義重大。bZIP蛋白成員廣泛分布于植物基因組中，在調(diào)控作物抗逆性方面發(fā)揮著重要作用。本文中，逆境脅迫廣泛的調(diào)控bZIP基因的表達，這與前人的研究類似。不同逆境脅迫對ZmbZIP85基因影響因玉米種質(zhì)的不同而各異，比如，玉米自交系Han21脅迫處理時，該基因的表達沒有發(fā)生明顯改變，而在自交系Ye478中，在嚴重脅迫時該基因的表達明顯上調(diào)[6]。擬南芥中ZmbZIP85的同源基因AtbZIP1是逆境脅迫的正調(diào)控因子，提高該基因的表達能顯著的增強擬南芥的抗逆性[6]。而在本研究中，該基因應答鹽、干旱和低溫脅迫時，表達模式各異，200 mmol·L-1的NaCl溶液顯著提高該基因的表達，而20% PEG6000或4 ℃低溫脅迫明顯抑制該基因的表達，反映了該基因在不同玉米種質(zhì)中應答不同逆境脅迫時的不同調(diào)控機制。類似的結(jié)果在其他研究中也有報道，以玉米Yu882為試驗材料，ZmbZIP8、ZmbZIP41、ZmbZIP52、ZmbZIP68和ZmbZIP85明顯受到鹽脅迫的誘導[37]，而在我們的試驗中，ZmbZIP8受到鹽脅迫抑制，反映了該基因在不同種質(zhì)中的生物學功能差異。

植物根系依靠硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運體或銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運體來吸收土壤中的氮素，在這一過程中，大量轉(zhuǎn)錄因子成員參與調(diào)控氮素吸收和代謝平衡。超表達玉米DOF1基因能提高擬南芥吸收氮素能力[38]，該基因也能提高生長于低產(chǎn)土壤中水稻的產(chǎn)量，增強氮素吸收利用效率[39]。小麥TaNFYA1-6B和TaNAC2-5A能促進根系發(fā)育和激發(fā)NTR1和NRT2家族基因的表達水平，提高氮素的吸收效率和小麥的產(chǎn)量[40-41]。干旱脅迫下，小麥氮饑餓誘導基因TabZIP2也參與協(xié)調(diào)碳氮代謝平衡，提高小麥抗旱能力[42]。在本文中，葉片或根系中ZmbZIP基因廣泛受硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫的調(diào)控，在葉片或根系有些基因受兩種脅迫處理誘導的表達模式類似，比如，ZmbZIP3、ZmbZIP68、ZmbZIP74和ZmbZIP101等4個基因，而其他基因在葉片或根系受2種脅迫處理的影響不同，比如，葉片ZmbZIP27同時受2種脅迫處理的抑制，而根系中的ZmbZIP27則同時受到誘導而上調(diào)，表現(xiàn)了該基因在葉片或根系等不同組織中的不同生物學功能。