MDM2環狀RNA在急性髓系白血病患者骨髓中的表達及臨床意義

趙倩，吳德龍，蘇肖宇，朱昕，楚明強，林江，鄧兆群

(1. 江蘇大學附屬人民醫院中心實驗室，江蘇 鎮江 212002； 2. 鎮江市精確診斷與治療重點實驗室，江蘇 鎮江 212002)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種血液系統惡性腫瘤，以髓系造血祖細胞的異常增殖、分化和成熟障礙為特征[1]，是成人最常見的白血病[2]。盡管強化化療和同種異體干細胞移植取得了進展，由于難治性、復發、治療耐藥性與治療相關的死亡率等原因，大多數AML患者的預后仍然較差，其5年生存率僅約為24%[3]。分子生物學的研究有助于揭示AML的發病機制，遺傳缺陷被認為是影響化療反應和患者預后的最重要因素[4]。因此，探尋潛在的分子標志物非常重要，可為優化AML患者治療方案提供指導與依據。

環狀RNA(circular RNA, circRNA)是反向剪切形成的一類非編碼RNA，無5′-3′極性和多聚腺嘌呤尾巴，近年來已被證明在癌癥生物學中具有關鍵的調節作用[5]，例如充當微小RNA(microRNA)海綿或與RNA相關蛋白結合以形成調節基因轉錄的RNA-蛋白質復合物以及編碼調節肽[6-7]。鼠雙微粒體2(murine double minute 2，MDM2)是一種重要的致癌基因，是抑癌基因p53的負調節因子，MDM2-P53相互作用的一些抑制劑已作為治療各種血液病和實體腫瘤的藥物進行了臨床試驗，MDM2具有降解p53及泛素化的功能，參與腫瘤的發生、發展，并與胚胎發育和組織分化相關[8-10]。MDM2環狀RNA(circ-MDM2)是由MDM2第4-8個外顯子環化而成，其對AML生物學功能的影響尚不清楚。

本研究檢測了AML患者骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)中circ-MDM2的表達水平，并分析circ-MDM2表達與臨床參數的關系，為AML的分子診斷及潛在的靶向治療提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 臨床標本

本研究中的骨髓標本均采自江蘇大學附屬人民醫院，包含92例初發的AML患者及22例對照組?；颊叩脑敿毰R床資料如性別、年齡、白細胞計數、血紅蛋白、血小板計數、骨髓原始細胞比例、緩解率、核型和基因突變情況來自病歷。全體參與者簽署了知情同意書，本研究經江蘇大學附屬人民醫院倫理審查委員會批準。所有患者的診斷及臨床分型標準符合法美英合作組(French-American-British Cooperative Group，FAB)和2016版世界衛生組織(World Health Organization，WHO)分型標準[11-12]。

1.2 主要材料

淋巴細胞分離液(天津TBD Sciences公司)；紅細胞裂解液(上海碧云天公司)；RNA提取試劑盒Trizol為美國Life Technologies Corporation公司產品；逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 circ-MDM2引物設計及合成 根據Circbase中基因序列，運用circPrimer1.2軟件設計實時定量PCR(qPCR)引物，引物由上海華大基因科技有限公司合成，引物序列如下，circ-MDM2上游：5′-GCCATCGAATCCGGTTCTTTT-3′，下游：5′-CTTGGCAC-GCCAAACAAATC-3′ ；ABL上游：5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′，下游：5′-TCCAACGAGCGGC-TTCAC-3′。

1.3.2 BMMNCs分離、總RNA提取及逆轉錄合成cDNA 向已取得的骨髓標本中先后加入淋巴細胞分離液與紅細胞裂解液各5 mL，分別2 000 r/min離心5 min，棄上清液后獲得BMMNCs。按Trizol說明書采用苯酚-氯仿抽提法，提取BMMNCs中的總RNA。依據逆轉錄試劑盒說明書利用隨機引物將每個樣品中2 μg的總RNA經逆轉錄PCR合成cDNA。反應條件：預變性(65 ℃ 5 min)1個循環；PCR反應(30 ℃ 10 min，45 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min)40個循環。

1.3.3 qPCR檢測circ-MDM2的表達水平 本實驗通過qPCR檢測circ-MDM2及內參基因ABL的表達。circ-MDM2表達水平的計算公式為：Ncirc-MDM2=(Ecirc-MDM2)△CT circ-MDM2(對照-實驗)÷(EABL)△CT ABL(對照-實驗)。每次實驗均含有陽性質控(目的基因質粒)和陰性質控(水)。PCR擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，跑膠結束后在RED凝膠成像儀下成像，觀察引物的特異性及確定最適退火溫度。

依據qPCR試劑盒說明書，qPCR反應系統總體積為20 μL，由2 μL cDNA、0.8 μL circ-MDM2或ABL上游、0.8 μL circ-MDM2或ABL下游、10 μL SYBR Premix TB Green、0.4 μL ROX參比染料Ⅱ及6 μL滅菌蒸餾水組成。

circ-MDM2、ABL反應條件：預變性(95 ℃ 30 s)1個循環；擴增(95 ℃ 5 s變性，61 ℃ 32 s退火，72 ℃ 30 s延伸，80 ℃ 30 s收集熒光)40個循環；解鏈程序(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)1個循環。

1.4 統計學分析

數據處理、統計學分析應用SPSS 20.0 軟件和GraphPad Prism 7.0進行。χ2檢驗、Yates校正公式或Fisher確切概率法用于兩組分類變量的比較。Mann-WhitneyU檢驗用于兩組連續性變量的比較。受試者工作特征(ROC)曲線評價circ-MDM2表達水平對AML的診斷意義。以P<0.05(雙側)為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AML患者BMMNCs中circ-MDM2的表達

circ-MDM2的表達水平以中位數(范圍)表示，對照組為0.146 8(0.000 0～1.000 0)，全體AML患者為0.144 6(0.000 0～3.074 0)，非急性早幼粒細胞白血病[AML without acute promyelocytic leukemia，AML(非APL )]患者為0.140 3(0.002 2～2.306 0)，正常核型AML(cytogenetically normal AML，CN-AML)患者為0.147 2(0.000 0～2.306 0)。與對照組相比，circ-MDM2表達水平在AML、AML(非APL )、正常核型AML患者中均明顯升高(圖1)。

圖1 circ-MDM2在對照組及AML患者中的相對表達量

2.2 circ-MDM2表達對AML的診斷效能

ROC曲線評價結果表明，曲線下面積為0.649，95%可信區間為0.523～0.776(圖2)。ROC曲線的截斷值為0.191，靈敏度為0.467，特異度為0.864。上述結果提示circ-MDM2表達水平可作為區分AML患者與對照組的潛在標志物，具有輔助診斷意義。

圖2 ROC曲線分析circ-MDM2表達用于鑒別AML和對照組

2.3 circ-MDM2表達水平與AML患者臨床參數的關系

根據ROC曲線的截斷值0.191，將AML患者分為高表達組(≥0.191)和低表達組(<0.191)，分別比較高、低表達組之間各臨床參數的差異，結果見表1。circ-MDM2低表達組CEBPA的突變率明顯高于circ-MDM2高表達組(P=0.039)；circ-MDM2高、低表達組在性別、年齡、白細胞計數、血紅蛋白、血小板計數、骨髓原始細胞比例、緩解率、染色體分型、核型及其他8個基因突變方面均無統計學差異。

2.4 circ-MDM2表達水平與AML患者預后的關系

為了闡明circ-MDM2表達水平與AML患者預后的關系，將具有隨訪資料的60例AML患者納入研究。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，circ-MDM2高、低表達組AML患者的總體生存時間和無白血病生存時間的差異均無統計學意義(P>0.05，圖3)。

表1 circ-MDM2表達與AML患者臨床參數間的關系

續表1

圖3 circ-MDM2表達對AML患者總體生存時間及無白血病生存時間的影響

3 討論

作為一種新型的RNA，circRNAs具有獨特的環狀結構，該結構源自反向剪接過程產生[13]。由于其高穩定性、組織特異性表達模式以及在各種體液中的廣泛分布，circRNAs具有作為人類疾病生物標志物的巨大潛力[14]。研究表明circRNAs在AML中存在異常表達且對AML進展有影響，如circ_0004277在新診斷未經治療的和復發的AML患者中表達均降低[15]；circ-VIM過表達是一個獨立的不良預后因素，并且與AML患者的總體生存期縮短顯著相關[16]。

MDM2已成為癌癥治療中的熱門話題，Sciot[10]已探索到阻斷MDM2-P53相互作用的分子，并因此重新建立野生型p53活性，這一結果使抗MDM2治療成為現實。Chaudhary等[17]分析了未經處理或未使用DNA損傷劑處理的結直腸癌細胞系(HCT116，RKO和SW48)的RNA-seq數據，結果發現circ-MDM2是少數源自p53誘導基因的circRNAs之一，circ-MDM2可以通過抑制p53水平來控制細胞周期進程。為了探討circ-MDM2對AML生物學功能的影響，本研究收集AML患者及對照組骨髓樣本，檢測circ-MDM2的表達水平，結果發現circ-MDM2在AML患者中表達升高，circ-MDM2的表達水平可作為區分AML患者與對照組的潛在生物標志物。

近年來研究發現除了細胞遺傳學異常外，一些基因突變在AML中對預后分層有重要價值，如正常核型AML中性梳樣蛋白1(additional sex combs like-1，ASXL1)[18]，TET癌基因家族成員2(tet oncogene family member 2 ，TET2)[19]，腎母細胞瘤1(Wilms′ tumor 1，WT1)[20]等基因突變常提示預后不良，核磷素1(nucleophosmin1，NPM1)[21]，CCAAT增強子結合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein α，CEBPA)[22]等基因突變常提示預后良好。CEBPA在AML患者中經常發生突變，在新發AML患者中發生雙等位突變率平均5%，亞洲患者的發生率更高(平均12%)，并且雙等位基因CEBPA突變被認為是一個新型預后標志物[23]。CEBPA是一種關鍵的髓系轉錄因子，它對造血干細胞自我更新和髓系分化過程中驅動轉錄程序都很重要[24-25]。本研究結果表明circ-MDM2低表達組患者CEBPA的突變率明顯高于circ-MDM2高表達組患者。Kaplan-Meier生存曲線分析表明circ-MDM2低表達組AML患者的總體生存時間與無白血病生存時間較circ-MDM2高表達組有延長趨勢，可能與circ-MDM2低表達組更易發生CEBPA突變有關。但circ-MDM2表達與CEBPA突變之間的作用機制尚不明確，需要進一步實驗加以驗證。

綜上所述，本研究顯示circ-MDM2表達上調是AML患者中常見的事件，骨髓circ-MDM2水平對AML具有一定的診斷價值，可作為區分AML患者與對照組的潛在生物標志物。circ-MDM2表達與CEBPA突變有關，與患者的總體生存時間和無白血病生存時間無明顯關系。但本研究病例數較少，后續將擴大標本量，進一步探討circ-MDM2在AML中的生物學功能。