基于縫合法的小鼠角膜炎癥模型的構建及其意義

王怡，許晉升，孫秋悅，曹宸，丁先超，嚴志新

(1. 江蘇大學醫(yī)學院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學附屬醫(yī)院燒傷整形外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

淋巴管再生常見于炎性反應[1]、創(chuàng)傷修復[2]、組織器官移植[3]、腫瘤轉移[4]和肢體慢性淋巴水腫[5]等病變及病理過程。近年來，相繼發(fā)現淋巴管內皮細胞透明質酸受體-1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1，LYVE-1)、血管內皮細胞生長因子受體-3(vascular endothelial cell growth factor receptor-3，VEGFR-3)、prospero相關同源盒轉錄因子1 (prospero-related homeobox transcription factor 1，Prox1)和平足蛋白(podoplanin)等淋巴管特異性標志物，致胚胎淋巴管的生長和發(fā)育的研究有了快速進展[6]，但對于炎性淋巴管生長的研究仍缺乏理想的動物模型。正常角膜無血管和淋巴管生長，在各種因素刺激下，如感染、燒傷、手術或角膜移植術后等，新生血管可以從角膜緣長入角膜[7]，同時伴有炎性淋巴管生長[8]。因此，本研究通過縫合小鼠角膜進行炎性淋巴管模型的探究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器

BALB/c小鼠60只，雌性，6～8 周齡，體質量20～25 g，購自江蘇大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(蘇)202003784]，飼養(yǎng)于室溫18～24 ℃，每日光照12 h，自由攝食飲水。實驗動物處置獲得江蘇大學倫理委員會審查批準。

牛血清白蛋白(美國Sigma公司)；Alexa Fluor?大鼠抗小鼠CD31抗體(美國BioLegend公司)；兔抗小鼠LYVE-1抗體(英國Abcam公司)；Alexa Fluor?555 驢抗兔抗體(美國Invitrogen公司)；逆轉錄PCR試劑盒、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒均為美國ABI公司產品；顯微外科手術器械(上海手術器械廠)；裂隙燈顯微鏡(蘇州康捷醫(yī)療器械有限公司)；手術顯微鏡(鎮(zhèn)江中天光學儀器有限責任公司)；解剖顯微鏡(美國Motic公司)；石蠟切片機(德國Slee Mainz公司)；DU-800紫外分光光度計(美國Beckman coulter公司)；Zeiss LSM 710激光共聚焦掃描顯微鏡、Zeiss 2010 Light Edition數碼攝像系統(tǒng)均為德國Carl Zeiss公司產品。

1.2 小鼠角膜炎癥模型的建立

按隨機數字法選出15只小鼠作為正常對照，剩余小鼠行10%乙醇水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射全身麻醉聯合0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，用直徑2 mm的角膜環(huán)鉆在小鼠角膜中央輕壓作角膜壓痕，11-0尼龍縫線垂直壓痕方向縫入角膜基質內做3個“8”字縫合。為獲得標準化的血管生長，外周的縫合點選擇在角膜緣和2 mm環(huán)鉆壓痕的中央，而內側的縫合點選擇在環(huán)鉆壓痕處，手術結束后結膜囊涂紅霉素眼膏。

1.3 裂隙燈顯微鏡觀察角膜炎癥反應與血管生長

對小鼠角膜進行縫合后，于裂隙燈顯微鏡下觀察正常小鼠角膜及縫合術后3、7、12 d角膜炎癥反應、血管生長情況以及有無并發(fā)癥，并對小鼠角膜進行拍照。小鼠眼球術后常見并發(fā)癥包括感染、前房穿通、前房出血、虹膜黏連、晶狀體混濁以及眼球萎縮等，對于出現手術并發(fā)癥者排除在實驗之外。

1.4 HE染色觀察角膜組織的炎癥反應

取正常眼球及縫合術后3、7、14 d眼球，每個時間點各取3只小鼠角膜組織，在4%多聚甲醛中固定12～24 h；85 %、95 %、100 %梯度乙醇脫水，二甲苯透明20 min，共2次；60 ℃浸蠟2 h，石蠟包埋，5～6 μm切片，60 ℃烤片6～8 h；脫蠟；脫水；蘇木素染色5 min；PBS沖洗；質量分數1%鹽酸乙醇分化10 s；PBS沖洗；伊紅染色30 s；PBS沖洗；85%、95%、100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察染色結果并拍攝照片。

1.5 角膜鋪片染色觀察炎性淋巴管和血管生長

采用10%乙醇水合氯醛(4 mL/kg)予小鼠腹腔注射全身麻醉，在解剖顯微鏡下沿角膜緣處切取完整的正常小鼠角膜與術后5、7、14 d角膜(每個時間點各取3只)；漂洗，丙酮固定；2% 牛血清白蛋白+0.3% Triton X-100封閉非特異性抗原；加淋巴管內皮細胞標志物LYVE-1抗體(1 ∶500)，搖床孵育過夜；棄一抗混合液，PBS漂洗；加血管內皮細胞標志物CD31抗體(1 ∶500)，搖床避光孵育過夜；棄一抗混合液，PBS漂洗；加二抗(1 ∶1 000)，室溫搖床避光孵育45 min；漂洗，角膜轉移至載玻片，抗熒光衰退封片劑封片。在Zeiss激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察角膜基質中淋巴管與血管生長情況并拍攝照片。

1.6 qRT-PCR檢測炎性角膜中TNF-α mRNA表達

取小鼠正常角膜及縫合術后1、3、7、11、14 d角膜組織，提取RNA， 采用逆轉錄PCR試劑盒進行逆轉錄反應合成cDNA進行檢測。反應體系：4 μLTaqDNA聚合酶、上下游引物各2.5 μL、2 μL cDNA、10 μL dNTP、10 μL 緩沖液、19 μL 雙蒸水。設計引物如下，β-肌動蛋白上游：5′-TCTCATTCCTGCTTGTGGC-3′，下游：5′-CACTTGGTGGTTTGCTA-3′；TNF-α上游：5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，下游：5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。qRT-PCR條件：TaqDNA聚合酶95 ℃活化10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40個循環(huán)。以β-肌動蛋白為內參，采用2-ΔΔCt法進行定量分析，實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 正常角膜與縫合術后角膜在裂隙燈下比較

由圖1可見，裂隙燈下正常角膜呈無色透明，僅在角膜緣處(角膜與球結膜移行處)可見血管生長?？p合術后3 d，角膜明顯充血，可見新生血管開始從角膜緣處呈袢狀向角膜中央生長?？p合術后7 d，角膜基質內可見明顯的新生血管，直徑較小，部分血管末梢有吻合。縫合術后12 d，新生的血管密集、直徑明顯增粗，幾乎遍及全角膜。由于淋巴液為無色透明液體，在裂隙燈下無法觀察新生的淋巴管。

圖1 裂隙燈下觀察正常及術后角膜中血管生長情況(×25)

2.2 正常角膜與縫合術后角膜的炎癥反應

結果顯示，正常角膜基質比較致密，并且厚度較薄，沒有炎癥細胞浸潤，僅在角膜緣處可見極少量的血管與淋巴管生長，整個角膜未見血管與淋巴管生長。角膜縫合術后，基質明顯水腫、增厚，并伴有炎癥細胞浸潤，水腫約在術后3 d達到高峰，同時靠近角膜緣處的角膜基質中有明顯的血管與淋巴管生長，新生的炎性血管管腔內可見紅細胞充盈。縫合術后第7 d，角膜基質水腫明顯消退，炎性細胞浸潤減少，有較多的淋巴管與血管生長，血管管腔內有較多的紅細胞充盈?？p合術后14 d，角膜基質內水腫基本消退，與術后7 d相比，新生的炎性血管和淋巴管管腔直徑較大。見圖2。

圖2 小鼠正常角膜及術后不同時間角膜HE染色(×200)

2.3 正常角膜與縫合術后角膜炎性淋巴管和血管生長比較

正常角膜沒有血管和淋巴管生長，僅在角膜緣處可見少量淋巴管呈管狀圍繞或呈低襻狀、以膨大的盲端生長；而血管網在角膜緣圍繞淋巴管呈襻狀分布?？p合術后5 d，角膜基質中有明顯的淋巴管與血管開始從角膜緣處呈樹枝狀垂直向角膜中央生長，LYVE-1染色陽性的淋巴管腔直徑較CD31染色陽性的血管管腔直徑大，且粗細不均，生長密度低于血管，管腔末端有吻合或呈毛刺狀分布，新生血管末梢端呈尖銳毛刺狀，并可見血管尖端吻合。縫合術后7 d，角膜基質內新生的淋巴管和血管生長旺盛，淋巴管呈火焰狀向角膜中央生長，形態(tài)更加不規(guī)則，部分區(qū)域可見管腔扭曲，角膜基質內可見散在的LYVE-1弱陽性樹枝狀細胞，而角膜新生血管呈樹枝狀長入角膜，形態(tài)明顯不規(guī)則，管腔直徑大小明顯不等，血管扭曲、相互纏繞，血管生長密度大于淋巴管生長密度。縫合術后14 d，新生的淋巴管與血管幾乎遍及整個角膜，淋巴管呈不規(guī)則網格狀，向角膜中央延伸，部分淋巴管直徑變細，血管在角膜中央成團狀生長，角膜中央的密度大于角膜周邊的密度，并且血管的管腔直徑變粗。見圖3。

2.4 小鼠炎性角膜中TNF-α mRNA表達

qRT-PCR實驗結果表明，小鼠正常角膜組織中不表達TNF-αmRNA；而在小鼠炎性角膜基質中，縫合術后TNF-αmRNA表達迅速增加，于術后7 d達到高峰(P<0.05)，在術后11、14 dTNF-αmRNA表達明顯降低(P均<0.05)，并維持在低水平。見圖4。

圖3 角膜鋪片免疫熒光染色(標尺：100 μm)

*：P<0.05，與術后1 d比較

3 討論

淋巴水腫是淋巴管功能受損或發(fā)育畸形所導致的淋巴液滯留，長期的淋巴水腫可導致皮膚潰瘍、脂肪纖維化、組織惡變等[9]。目前對淋巴管、血管發(fā)育和生長的研究一般采用體外細胞實驗與動物模型兩種方法[10]，體外細胞實驗條件更容易調控，是體內實驗的補充手段。與體外細胞實驗分析相比較，體內實驗更有利于動態(tài)觀察淋巴管的再生過程，因此動物模型實驗分析更適合于淋巴管再生的研究。但動物模型建立時間長，花費大，并且部分淋巴管再生的作用是由模型本身的炎癥反應所致，致使實驗結果產生一定的偏差。先前已有裸小鼠耳輪緣進行電穿孔質粒轉染和裸小鼠角膜微囊袋法建立的裸小鼠皮膚和角膜新生淋巴管與血管生長的模型[11-13]，但具有明顯的缺陷，本實驗利用角膜透明、無淋巴管與血管生長、位于體表有利于操作和觀察等客觀特性，縫合法構建的小鼠角膜炎癥模型可以作為研究淋巴管再生的良好工具。

裂隙燈和HE染色結果表明，角膜在縫合后早期充血、水腫、炎癥細胞浸潤明顯，術后3 d即可在角膜基質中觀察到淋巴管與血管從角膜緣向角膜中央生長。隨著基質中新生的淋巴管與血管數量增多，術后7 d角膜炎癥反應開始消退，角膜厚度變薄，炎性細胞減少，這表明建立的小鼠角膜縫合模型符合炎性反應的一般規(guī)律。并且在縫合術后14 d，角膜基質水腫基本消退，炎性細胞浸潤明顯減少，淋巴管管徑變大，能夠獲得較穩(wěn)定的新生炎性淋巴管，有利于對新生淋巴管進一步的實驗研究。

此外，本研究發(fā)現角膜縫合法可以誘導炎性血管和淋巴管共同生長，并且二者生長相伴隨，都是從角膜緣向角膜中央生長，說明炎性血管的生長與炎性淋巴管的生長具有相關性。新生淋巴管的密度小于新生血管，而直徑大于新生血管，淋巴管末端及管腔鈍圓，部分遠端區(qū)域脫離淋巴管主干，游離于角膜基質中，周圍可見大量的LYVE-1弱陽性的樹枝狀形態(tài)細胞結構[14]。TNF-α是關鍵性的炎癥因子之一，其調控多個炎癥信號途徑[15-17]。本研究根據TNF-αmRNA在縫合術后的表達，結合新生淋巴管及血管生長情況可以推測，在炎癥早期，炎性反應誘導并啟動了炎性淋巴管與血管再生；而在炎癥后期，炎性淋巴管與血管的生長和塑型可能存在著內皮細胞自身激發(fā)與調控的機制。

綜上所述，縫合法小鼠角膜模型是一種典型的炎癥模型，符合炎癥反應的一般特征，是研究炎性淋巴管生長調控機制的理想工具；且在炎性反應過程中TNF-α可能參與調控炎性淋巴管的再生。