漆黃素脂質體的制備及其質量評價

王蓓蓓，姜亞莉，林郁，許穎

(1. 江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 揚州大學附屬醫院藥劑科，江蘇 揚州 225001)

漆黃素是一種天然黃酮類化合物，又名非瑟酮。作為一種天然的黃酮類抗氧化劑，漆黃素廣泛存在于漆木科植物木蠟樹(Rhussuccedanea.L)、鹽膚木(RhuschinensisMill．)等植物以及蔬菜、水果中。研究表明，漆黃素具有廣泛的藥理活性，包括抗炎抗氧化、抗抑郁[1]、降低膽固醇，對老年小鼠腦出血誘導的神經炎癥[2]、對心肌缺血再灌注損傷[3]均具有一定的保護作用。此外，研究表明，漆黃素可能通過抑制由糖尿病誘導的p300表達以及促進MMP2的表達，從而發揮顯著改善糖尿病大鼠腎臟病變的功效[4]。更重要的是，漆黃素還具有抑制多種癌細胞如HepG2 和Hela的增殖，誘導癌細胞凋亡的作用[5]。然而，漆黃素具有水溶性較差，不易被胃腸等生物膜吸收，半衰期較短，口服生物利用度低等缺點，其臨床應用受到一定的限制。因此漆黃素新劑型的開發已經成為研究熱點。

漆黃素作為一種天然產物，相關研究主要集中于藥理活性方面，制劑的相關報道較少。目前，已報道的漆黃素制劑僅有環糊精包合物[6]，殼聚糖修飾的漆黃素聚乳酸納米粒。脂質體是一種優良的藥物載體，具有毒性低和生物相容性高等優點。此外，脂質體具有親水性內核和疏水性磷脂雙分子層，能夠有效包載親水和親脂性藥物，是最具前景的納米給藥系統之一。目前已有多種脂質體制劑用于臨床。

為解決漆黃素溶解度低、口服吸收差的問題，本實驗設計開發漆黃素脂質體，并對其理化性質進行評價，以期提高漆黃素的溶解度和生物利用度。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

漆黃素(98.58%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；膽固醇(98%)、膽酸鈉(98%)購自上海阿拉丁試劑公司；肉豆蔻酸異丙酯(IPM)、大豆卵磷脂(98%)購自上海麥克林試劑公司；甲醇、乙腈(國藥集團化學試劑有限公司)為色譜純；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)為分析純。

旋轉蒸發儀(上海亞榮儀器廠)；恒溫振蕩器(太倉華利達有限公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1260 系列，美國安捷倫科技公司)；電子天平FA2004N(上海精密儀器有限公司)；Nano Brook 90 plus PALS分析儀(美國布魯克海文儀器公司)；TecnaiG2 F30 S-TWIN場發射透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠12只，雄性，標準體重(200± 20)g，由江蘇大學實驗動物中心提供。實驗方案經過江蘇大學實驗動物倫理委員會審查。

1.3 漆黃素的定量分析方法的建立

1.3.1 漆黃素標準溶液的制備(建立體外標準曲線) 精密稱取漆黃素對照品25 mg，加少量甲醇溶解，超聲30 min后，移至250 mL的容量瓶，并用甲醇定容至刻度，得100 μg/mL 漆黃素儲備液。精密量取漆黃素母液0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得濃度分別為0.1、0.5、1、5 、10、20和50 μg/mL的漆黃素標準溶液。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇 ∶水=60 ∶40，流速：1 mL/min，檢測波長：364 nm，柱溫：25 ℃，進樣量：20 μL。內標：異甘草素。

1.3.3 血漿樣品的處理 取血漿樣品 200 μL置于1.5 mL 的離心管中，加入內標溶液異甘草素 20 μL(50 μg/mL)，渦旋30 s混勻。加入乙酸乙酯 600 μL，漩渦 2 min，萃取2次，10 000 r/min離心10 min，合并萃取液，氮氣吹干，用 100 μL流動相復溶，取20 μL進樣檢測。

1.4 脂質體的制備

采用薄膜分散法制備漆黃素脂質體。稱取處方量的大豆卵磷脂、膽固醇、膽酸鈉和肉豆蔻酸異丙酯，加入無水乙醇溶解，超聲使其充分溶解，再加入處方量的漆黃素，超聲溶解后置于旋轉蒸發儀上(50 r/min, 40 ℃)，減壓除去無水乙醇，并獲得均勻的脂質體薄膜。向其中加入適量雙蒸水，置恒溫振蕩器中水化30 min，超聲一定時間使脂質體分子分散后備用。

1.5 單因素考察

以粒徑為指標，按照“1.4”項下方法，制備不同磷脂與膽固醇總量(100、150、200 mg)，不同磷脂膽固醇比例(5 ∶1、8 ∶1、11 ∶1)及不同藥脂比(1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7)的漆黃素脂質體，以粒徑為指標，對脂質體進行處方優化。

1.6 粒徑、電位測定及形態觀察

脂質體用雙蒸水稀釋10倍，采用激光散射粒徑儀測定脂質體的粒徑、多分散系數以及Zeta電位。對漆黃素脂質體進行負染，采用場發射透射電子顯微鏡觀察漆黃素脂質體的形態。

1.7 包封率與載藥量的測定

采用超濾離心法測定漆黃素脂質體的包封率。精密移取0.5 mL漆黃素脂質體，置于超濾離心管(截留分子量8 000)中，12 000 r/min離心20 min。取超濾膜上的樣品及濾膜下的濾液分別置于2個容量瓶中，用色譜甲醇破乳定容后，HPLC法測定濃度，分別記為C1，C2，按如下公式計算漆黃素脂質體的包封率：包封率=C1/(C1+C2)×100%。處方中加入的藥物量記為W1，加入的總的輔料的量記為W2，如下公式計算漆黃素脂質體的載藥量：載藥量=(包封率×W1)/(W1+W2)×100%。

1.8 漆黃素脂質體初步穩定性試驗

精密稱取一定量漆黃素脂質體，密封于棕色玻璃瓶中，分別置于4 ℃， 25 ℃， 60 ℃恒溫干燥器中放置30 d，于第 0、15、30天取出，測定粒徑變化。

1.9 體外釋放考察

采用透析法考察漆黃素脂質體在pH 1.2 鹽酸、雙蒸水和pH 7.4 磷酸鹽緩沖液3種釋放介質中的體外釋放情況。分別取漆黃素溶液、漆黃素脂質體1 mL(含漆黃素1 mg)置于透析袋中，兩端扎緊，放入100 mL 不同的釋放介質中，(37.0±0.5) ℃，轉速為 100 r/min，分別在0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h取樣 1 mL，并及時補充同等體積同溫度的釋放介質。取出的樣品10 000 r/min離心后，取上清液，采用HPLC法測定釋放液中游離漆黃素的濃度，計算出漆黃素的累積百分釋放率，繪制累積釋放曲線。

1.10 藥物動力學實驗

健康雄性SD大鼠10只隨機分為兩組，每組5只，分別以50 mg/kg的劑量灌胃給予漆黃素混懸液和漆黃素脂質體。給藥前12 h禁食不禁水，分別在給藥后 0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h于大鼠眼眶靜脈叢取血，3 700 r/min離心10 min，吸取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存備用。血樣處理方法參照“1.3.3”方法。

漆黃素和漆黃素脂質體的血藥濃度-時間曲線采用BAPP 2.3軟件進行擬合，得到相關藥代動力學參數。Cmax為給藥后的最大血藥濃度，Tmax為給藥后血藥濃度達峰時間，t1/2為末端消除半衰期，T1/2為藥物在大鼠體內的半衰期，AUC(0-24 h)為血藥濃度-時間曲線下面積。

1.11 漆黃素體外抗腫瘤實驗

將HepG2細胞接種于96孔板中，每孔1×105個細胞，每孔100 μL培養基(含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基)于37 ℃培養箱5% CO2下培養細胞貼壁生長24 h后，用不同濃度(0.5、1、2、5、10、25、50、100 μg/mL)的漆黃素原料藥，漆黃素脂質體，空白脂質體(陰性對照)和5-Fu(陽性對照)處理72 h。每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，加入100 μL DMSO，于490 nm采用酶標儀測定光密度。

1.12 統計學方法

2 結果

2.1 方法學考察

按照“1.3.2”及“1.3.3”項下色譜條件和樣品處理方法，漆黃素、空白血漿+漆黃素+內標的HPLC色譜圖如圖1所示，表明分析方法具有良好的專屬性。

A：漆黃素；B：空白血漿+漆黃素+內標

標準曲線結果：以濃度(C)對峰面積(Y)進行回歸，得體外樣品測定標準曲線Y=19.211 3C+2.083 1，R2=0.9991，體內樣品測定的標準曲線為Y=0.3612C-0.1026,R2=0.9978。漆黃素體內外樣品測定的線性范圍均為0.1～100 μg/mL, 相對標準偏差(RSD)<2%(n=6)，日內、日間精密度，方法回收率和重復性均符合方法學要求。

2.2 單因素考察

磷脂與膽固醇的總量為150 mg時，脂質體的粒徑最小，因此選擇150 mg為磷脂與膽固醇的總量。當磷脂與膽固醇的比例為8 ∶1時，脂質體粒徑最小，因此磷脂與膽固醇的比例確定為8 ∶1。藥物與磷脂比為1 ∶6及1 ∶7時，漆黃素脂質體的粒徑差別不大，因此選擇藥脂比為1 ∶6。膽酸鈉用量與脂質體粒徑成負相關，膽酸鈉用量為110 mg時，漆黃素脂質體的粒徑最小，因此，選擇膽酸鈉用量為110 mg。見圖2。由此，通過單因素實驗得到最優處方為漆黃素22.2 mg、磷脂133.3 mg、膽固醇16.7 mg、膽酸鈉110 mg、肉豆蔻酸異丙酯60 mg。

圖2 漆黃素脂質體單因素處方篩選實驗

2.3 體外表征

粒子粒徑分布圖及形貌觀察結果如圖3所示。粒徑、電位測定結果顯示，漆黃素脂質體的粒徑為(60.32±1.08) nm，多分散系數為0.198±0.011，電位為(-31.34±1.45) mV。由透射電鏡圖可知，漆黃素脂質體粒子外形圓整，呈現為類球形，與粒徑分布儀所測結果一致。漆黃素脂質體包封率為(94.37±0.62)%，載藥量為(4.500±0.021) %。

A：漆黃素脂質體粒徑分布圖；B：漆黃素脂質體透射電鏡圖

2.4 穩定性考察

不同溫度條件下漆黃素脂質體粒徑30 d內變化較小(表1)，表明所制備的漆黃素脂質體30 d內穩定性良好。

表1 漆黃素脂質體在4 ℃、25 ℃、60 ℃下的初步穩定性考察

2.5 體外釋放

在3種介質(pH1.2 鹽酸、雙蒸水、pH7.4 磷酸鹽緩沖液)中，漆黃素的累積釋放率均低于50 %，而漆黃素脂質體的累積釋放率均高于70 %，漆黃素脂質體的累積釋放率均高于游離漆黃素。此外可以觀察到，漆黃素脂質體在pH1.2鹽酸水溶液中的累積釋放率均高于其在pH 7.4磷酸鹽緩沖液和雙蒸水中的累積釋放率。見圖4。

圖4 漆黃素原料藥及漆黃素脂質體在不同介質中的體外釋放

2.6 藥物動力學結果

漆黃素脂質體在大鼠體內各時間點的血藥濃度均高于漆黃素原料藥(圖5)。漆黃素原料藥的AUC(0-12 h)為(6.29±0.35) μg/(mL·h)，而漆黃素脂質體為(20.28±0.66) μg/(mL·h)，是漆黃素原料藥的3.22倍，具有顯著性差異(P<0.01)，見表2。同時，漆黃素脂質體的T1/2為(3.79±0.12) h，相比于漆黃素原料藥的(1.91±0.09) h，半衰期延長了1.88 h(約1倍)，具有顯著性差異(P<0.01)。因此，將漆黃素包裹于脂質體中，能有效延長漆黃素的半衰期，增加其生物利用度。

圖5 漆黃素和漆黃素脂質體的血藥濃度-時間曲線

表2 SD大鼠尾靜脈注射漆黃素和漆黃素脂質體的主要藥動學參數

2.7 抗腫瘤活性評價

MTT實驗結果顯示，陽性對照和漆黃素脂質體組的抑制率在各濃度水平均顯著高于漆黃素原料藥組。漆黃素原料藥和漆黃素脂質體對HepG2細胞均有抑制作用，且呈現為劑量依賴關系，隨著給藥濃度增加，HepG2細胞的抑制率增加。見圖6。

*：P<0.05，與漆黃素原料藥組比較

3 討論

漆黃素具有多種藥理活性，但因高親脂性和低水溶性致使口服生物利用度低，限制了其在臨床上的應用和發展[7]。為了克服這些問題，基于脂質體的藥物傳遞系統具有良好的市場前景。作為一種性質優良的藥物遞送系統，包括氯膦酸二鈉等在內的多種藥物均被制備成脂質體[8-9]。此外，脂質體已被證明可以使藥物具有很高的腫瘤蓄積性，這種腫瘤保留作用是由于脂質體藥物可以通過腫瘤的多孔毛細血管內皮滲透[10]。目前在臨床上已經有幾種脂質體形式的蒽環類藥物，這些制劑有助于降低毒性，同時又保持它們在乳腺癌和軟組織癌中的抗癌活性[10-11]。

本實驗制備的漆黃素脂質體具有合適的粒徑(60.32±1.08)nm，較窄的粒徑分布0.198±0.011和高達94.37 %的包封率。較小的粒徑有助于提高脂質體粒子穿透血管膜，進入組織臟器從而發揮作用[12]。本實驗制備的漆黃素脂質體Zeta電位為(-31.34±1.45) mV，較高的電位意味著脂質體具備更好的穩定性，原因在于脂質體粒子之間的斥力較強，不易沉積。

本實驗中，漆黃素脂質體能夠提高漆黃素的溶解度，改善漆黃素的體外釋放行為。在pH 1.2鹽酸條件下的累積釋放率均高于其在pH 7.4磷酸鹽緩沖液和雙蒸水中的累積釋放率。這與Pawar等[7]的研究結果類似。這是由于漆黃素在酸性pH下的溶解度更高，這會增加其在癌細胞中的選擇性吸收以及靶向吸收的優勢。因為在癌細胞中，pH值比正常生理pH值略偏酸性。

藥動學擬合結果表明漆黃素脂質體能延長漆黃素在體內的滯留時間，可能是由于更快的吸收以及逃避了巨噬細胞的吞噬從而延長了在體內的停留時間。脂質體可以通過以下幾種方式來影響藥物吸收：① 通過增強藥物在腸道環境中的溶解性；② 基于腸細胞的運輸和代謝過程相互作用，從而可能改變藥物的吸收、外排、轉運和腸細胞內代謝產物的形成；③ 通過改變藥物轉運到體循環的途徑(門靜脈和腸淋巴系統)，這反過來可以減少藥物代謝的首過效應，因為腸淋巴系統不經過肝臟而直接進入體循環，從而可以達到降低給藥劑量以及毒副作用的效果。脂質體是一種良好的提高生物利用度的藥物遞送系統[13]，粒子的大小會直接影響其穩定性、藥物釋放、生物分布和細胞攝取。因為大于10 nm的納米顆粒可以逃避腎臟的清除，而小于200 nm的納米顆粒可以逃避巨噬細胞的吞噬，延長了其循環半衰期，也更有利于通過EPR效應被動靶向實體腫瘤。此外，在脂質體的脂質雙膜中添加膽酸鈉可使其與腸上皮接觸時發揮膜破壞作用，從而促進藥物從脂質體中釋放，潛在地提高了藥物的口服生物利用度[14]。

本研究結果表明，漆黃素原料藥和漆黃素脂質體對于HepG2細胞均有抑制作用，且呈現為劑量依賴關系，隨著給藥濃度增加，HepG2細胞的抑制率增加。相關研究表明，漆黃素通過調控多種信號通路實現抗HepG2 細胞的增殖作用[15]，其通過降低Bcl2的表達，并降低Bax、caspase-3和多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的水平，從而誘導HepG2細胞凋亡和細胞壞死。且經過脂質體的有效包封，漆黃素對HepG2的抑制效果得到顯著增強。其抑制作用的增強可能是由于腫瘤細胞內皮屏障的異常有利于脂質體在腫瘤組織中內滲，在脂質體膜與細胞膜相互作用中，漆黃素迅速釋放、進入細胞，導致漆黃素在腫瘤細胞內的濃度增加[16]。此外，在酸性環境中，漆黃素具有較好的溶解度，能增加藥物的釋放，有助于提高漆黃素脂質體作為高效藥物遞送系統的效率。因此，腫瘤細胞所處的弱酸性環境可以觸發漆黃素從漆黃素脂質體中快速釋放，從而大大增強其細胞毒性，并降低其對正常細胞的影響。

綜上所述，本實驗通過優化制備的漆黃素脂質體具有較好的理化性質，可有效提高難溶性藥物漆黃素的溶解度及生物利用度，且體外實驗證實其對HepG2細胞具有明顯的抑制作用。本研究結果為漆黃素的臨床應用提供了參考，并為難溶性藥物的增溶提供借鑒。