小鼠角質形成細胞培養研究進展

金銘，劉莉萍，李遇梅

(江蘇大學附屬醫院皮膚科，江蘇 鎮江 212001)

角質形成細胞又稱角蛋白形成細胞，來源于外胚層，是表皮的主要細胞類型，約占表皮的95%。根據角質形成細胞不同分化階段的細胞特點，將表皮分為5層：基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質層，其中基底層是未分化的細胞，具有分裂增殖能力[1]。角質細胞構成完整的皮膚屏障以抵御外界各種物理、化學物質和病原微生物的損傷，當這層屏障由于外傷、感染、免疫反應等原因功能受損時，將會導致一系列皮膚疾病的發生，比較典型的有銀屑病、天皰瘡、大皰性表皮松懈癥。因此目前有很多與之相關的研究，例如上皮生物學、角質細胞分化以及角質細胞刺激先天免疫反應[2]等等。近年來，為了更好地修復皮膚慢性損傷、燒燙傷，人工皮膚的研究進行得如火如荼，而角質細胞在人工皮膚的構建方面是必不可少的[3-4]。

小鼠是當前用于研究人類疾病最重要的模式生物，通過基因編輯技術，小鼠角質細胞已被廣泛用于研究表皮屏障、瘢痕形成、銀屑病等生理病理機制以及關鍵分子的調控[5-8]。其中，角質形成細胞的維持培養為此類研究提供了不可或缺的體外模型。小鼠角質細胞的培養起始于20世紀70年代，半個世紀以來，培養技術和方式在不斷改進和細化。然而，小鼠角質細胞在體外傳代過程中很容易發生分化和衰老，而且存在貼壁困難、成纖維細胞污染等問題。本文回顧了近年來國內外有關小鼠角質細胞分離培養的文獻，總結影響其體外增殖、分化的各個因素，以期建立更加優化的培養體系。

1 小鼠相關參數確定

1.1 品系的選擇

多種品系的小鼠均可用于角質形成細胞的來源，但不同的小鼠品系之間，角質細胞的培養壽命和質量各不相同。與FVB/N、CD-1、C57BL/6或SENCAR品系的小鼠相比，BALB/c小鼠角質形成細胞的初始貼壁率最低，衰老傾向最高[9]。

1.2 小鼠年齡和取材部位的選擇

不同鼠齡的小鼠取材部位不同，對于出生0～3 d的新生小鼠，最佳的取材部位是背部皮膚，因為此時是毛囊形成早期，毛囊數量很少[10]，對后續表真皮的分離影響較小。而對于成年小鼠，最佳的取材部位則是尾部而非背部，因為：① 成年小鼠的毛發周期處于休眠期(通常是出生后6～12周的背部皮膚)，此時的皮膚很薄，僅包含1～2層細胞，這將會導致角質細胞產量低下；② 成年小鼠背部皮膚的毛囊密度較高，這增加了表皮與真皮分離的困難程度；③ 尾部皮膚部位上皮細胞較厚，有3～5層角質細胞，并且還具有較低的毛囊密度，不干擾表真皮分離[2]。

2 消化酶的選擇

小鼠角質細胞的原代培養方式有3種：組織塊培養法、氣-液交界面培養法和酶消化法。目前應用最廣的是二步酶消化法[11-12]，即先使用表真皮分離酶分離表真皮，再對表皮進行消化得到角質細胞。此外，也有研究使用一步法，即在表真皮分離的同時對表皮進行消化。

2.1 表真皮消化酶

表皮和真皮通過半橋粒和基底膜帶連接。基底膜帶由包膜層、透明層、致密層和致密下層等4層結構組成，主要成分為板層素、Ⅳ型膠原等。目前有多種消化酶可用于表真皮分離，它們作用于不同的結構，產生的結果也不盡相同。

2.1.1中性蛋白酶 中性蛋白酶是目前應用最廣的表真皮分離酶[2，13]。它是由枯草芽孢桿菌經發酵提取獲得的，由于特異性作用于基底膜 Ⅳ型膠原和纖維黏連蛋白，因此只破壞半橋粒，而不破壞橋粒，不會影響表皮細胞之間的連接[14]。

2.1.2 胰蛋白酶 胰蛋白酶作用強度大，且操作最為簡單方便，也常常用于分離表真皮[9，15]。它在破壞半橋粒的同時也破壞橋粒的連接作用，因此會作用于基底細胞和棘細胞，可實現一步法分離角質形成細胞。然而，此種方法易造成基底細胞丟失和成纖維細胞污染的問題[16]。

2.1.3 嗜熱菌蛋白酶 嗜熱菌蛋白酶是從嗜熱微生物芽孢桿菌培養濾液中分離出的一種熱穩定的胞外金屬內肽酶[17]，它是特異性地作用于真皮-表皮交界處的一種特定蛋白，利用這種酶可以獲得完整的表皮[18]。Rakhorst等[19]比較了中性蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶對表真皮分離的作用，發現在中性蛋白酶的作用下，表真皮更易分離、角質細胞的產量更高。而且，由于嗜熱菌蛋白酶價格較高，因此應用不多。

綜上，考慮到酶的作用原理、效果以及產品價格等綜合因素后，目前更推薦中性蛋白酶用于表真皮的消化分離。

2.2 表皮消化酶

角質形成細胞間主要通過橋粒連接，破壞此結構可使角質細胞之間相互分離，從而收集到角質細胞。

2.2.1 胰蛋白酶-EDTA 由于乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA)能夠螯合Ca2+和Mg2+，從而破壞細胞連接促進細胞的解離，因此在胰蛋白酶中加入EDTA后，解離效果更加明顯，不僅有利于表皮角質細胞的分離，也可減少胰蛋白酶對細胞的損傷。

2.2.2 TrypLE解離酶 TrypLE解離酶不含動物和人源性成分，且對細胞的作用十分溫和。終止消化時，不需要使用胰蛋白酶抑制劑，因此可避免血清對角質形成細胞造成的負面影響。此外，TrypLE可在室溫下保存，性狀穩定。因此是替代胰蛋白酶的理想試劑。

目前的研究大多先使用中性蛋白酶分離表真皮，再通過胰蛋白酶-EDTA或者TrypLE解離酶消化表皮[20]進一步得到角質細胞。這種消化組合不僅可以在高效分離出角質細胞的同時避免成纖維細胞的污染，還能提高貼壁細胞的增殖率[12]。

3 培養基的選擇

小鼠角質細胞的培養已有50年的歷史，其培養基也在逐漸改良創新。目前，小鼠角質細胞的培養基大致可以分為含血清與不含血清兩大類。

3.1 含血清培養基

這類培養基一般在EMEM/S-MEM基礎培養基中加入胎牛血清、氯化鈣、上皮生長因子、氫化可的松等成分。其中，胎牛血清雖然富含最全面的細胞培養所需的營養物質，例如白蛋白、胎球蛋白、Ig類抗體、膽固醇等，可以幫助細胞抵御外界的各種環境變化帶來的沖擊，但血清中的鈣離子抑制角質形成細胞的生長并誘導角質形成細胞的終末分化。因此，需先用螯合樹脂處理血清，以去除包括鈣離子在內的二價和三價陽離子，才能顯著降低對細胞生長的抑制作用[21]。

3.2 不含血清培養基

這類培養基通過加入一些成分明確的血清替代成分，例如牛血清白蛋白等，可避免血清給角質形成細胞帶來的諸多不利因素。目前最常用的商業化無血清培養基有以下幾種。

3.2.1 EpiLife無血清培養基 有研究表明，與添加了螯合處理血清的培養基相比， EpiLife培養基在促進成年小鼠角質細胞增殖、保持基底細胞形態方面表現更為優秀[2]。也有研究比較了幾種不同的商業化無血清培養基，發現EpiLife在促進角質細胞增殖方面的作用較為突出[22]。

3.2.2 CnT(CELLnTEC)系列培養基 CnT系列培養基是CELLnTEC公司最新研發的針對角質細胞培養的一類培養基，根據作用原理和效果不同主要分為以下幾類，① CnT-57：含有少量(6 μg/mL)的牛垂體提取物(bovine pituitary extract, BPE)，它對于體外維持祖細胞的未分化增殖狀態具有重要作用，能提供最大的角質細胞分離效率，維持良好的原代細胞生長狀態，但也能支持原代培養中黑素細胞或成纖維細胞的生長[23]。② CnT-07：也是促祖細胞增殖培養基。與CnT-57相比，分離角質細胞后的集落形成效率稍低，但不支持除角質細胞以外的其他細胞的生長[23]，是目前使用最多的促角質細胞生長的CnT培養基。③ CnT-PR：是一種成分明確、不含動物成分的培養基。它是CnT-07培養基的改進版本，優化了培養基的成分，添加了額外的微量元素、抗氧化劑和維生素，還補充了一系列的前體細胞靶向生長因子以及輔助因子，以延長祖細胞壽命、改善生長因子與膜結合受體的結合。④ CnT-02：用于角質形成細胞的分化培養。當細胞被誘導分化時，用以代替促進增殖的CnT-57或CnT-07培養基[23]。CnT-PR-D作為CnT-02分化培養基的改良版本，添加了額外的微量元素、抗氧化劑和維生素，使得對角質細胞的分化作用更為顯著。

3.2.3 成分確定的角質形成細胞-無血清培養基(defined keratinocyte-SFM) 不添加BPE，取而代之的是生長促進劑，這些生長促進劑可維持細胞形態、生物標志物和生長特性，并可抑制成纖維細胞的增殖。此培養基鈣濃度很低(<0.1 mmol/L)，因而可用于高密度未分化角質形成細胞的分離和培養。

3.2.4 KGM-Gold角質形成細胞生長培養基 旨在支持克隆生長和高密度角質細胞增殖。在此培養基培養條件下的角質細胞能通過嚴格的質量控制，確保過大的和空泡化的細胞數量最少。

4 影響角質細胞培養的重要因素

4.1 鈣離子

鈣濃度的變化會影響角質形成細胞的分化。在不同鈣濃度培養條件下，細胞的增殖能力出現明顯的差異。研究表明，低鈣濃度下(<0.07 mmol/L)，角質形成細胞可良好增殖，但不能分化為層狀細胞；當鈣濃度超過0.1 mmol/L時，角質細胞的增殖受到抑制，而分化過程被啟動[24]。因此，目前的體外培養體系中多采用低鈣來延長原代角質形成細胞的壽命[25]，研究者也可根據實驗需要調節培養基中的鈣離子濃度。

4.2 生長因子

4.2.1 表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF) EGF是一種由53個氨基酸殘基組成的耐熱單鏈低分子多肽，參與上皮細胞成熟，它與EGF受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)結合，后者廣泛分布于哺乳動物的上皮細胞膜上，平均每個正常上皮細胞約有(2～5)×104個EGFR分子[26]，EGF和EGFR的結合會影響角質細胞的增殖、分化和遷移[27-28]。

4.2.2 角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF) KGF是成纖維細胞生長因子家族的成員，由間質來源的細胞產生，并通過與位于上皮的KGF受體連接而具有旁分泌功能[29]。KGF通過上調與DNA合成相關的基因如c-myc、CHL-1等，促進細胞有絲分裂。研究表明，KGF促進角質細胞增殖的作用強度是EGF的2～10倍[30]。

4.3 鎂離子

研究表明，培養基中添加高濃度鎂離子(最適濃度5～6 mmol/L)可使新生鼠角質形成細胞DNA含量增加3～4倍。其他二價陽離子(鍶、銅、鋅、鎳、鈹和鋇)在培養基中不能促進角質形成細胞的生長[31]。此外，鎂離子可能通過與細胞表面的蛋白螯合，形成表面蛋白膜，從而促進角質細胞貼壁生長[32]。總之，鎂離子可以促進角質細胞的增殖，提高貼壁率和細胞的生長速率。

4.4 1,25-二羥維生素D3

1,25-二羥維生素D3是膽固醇衍生物維生素D3的一種活性形式，對于骨代謝、鈣代謝的調節，細胞生長分化，免疫系統功能和中樞神經系統功能都有重要調節作用[33-34]。研究表明，1,25-二羥維生素D3通過上調周期蛋白D1(CCND1)基因和其編碼的cyclin D1蛋白表達刺激角質細胞的增殖[35]。

除了上述幾種因素外，部分激素如氫化可的松、胰島素以及霍亂毒素等都能顯著促進角質形成細胞的增殖、生長。其中胰島素通過促有絲分裂作用刺激角質形成細胞的增殖[36]；霍亂毒素作為一種環狀單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的誘導劑，對于角質細胞的生長具有較強的促進作用[37]。

5 小鼠角質細胞的應用展望

經過半個世紀的研究和探索，小鼠角質細胞的培養尤其是原代培養取得了很大的進展，然而，如何維持其干性、促進增殖依然存在著較大困難和挑戰。建立成熟完善的小鼠角質形成細胞的分離和培養體系，將有助于研究細胞間的相互作用，構建細胞分化模型以及三維皮膚替代物，進而服務于瘢痕形成、銀屑病、皮膚腫瘤等病理過程的機制探索，并助力皮膚相關的再生研究。結合最新的細胞重編程技術，還能將其應用于各類體內外的轉化研究，例如將角質細胞轉化為干細胞、黑素細胞等，這將為細胞治療和再生醫學的研究和發展帶來裨益。相信在不久的將來，一套成熟的小鼠角質細胞培養體系能夠被建立起來。