紅景天苷靶向VEGF/HIF-1α信號通路調控缺氧介導的大鼠肺動脈高壓▲

周爭光 周 勇 常振宇

(1 安徽醫科大學附屬宿州醫院心血管內科，宿州市 234000，電子郵箱：979181923@qq.com；2 西藏農牧學院動物科技學院，林芝市 860000)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種由多種病因導致肺部動脈壓超出正常界值的綜合征，主要通過血管收縮、肺血管重構來誘發右心衰竭，導致患者發生腹水甚至死亡[1]。低氧可以刺激肺動脈平滑肌細胞異常增殖從而誘發PAH，而肺血管重構是低氧性肺動脈高壓(hypoxia-induced pulmonary hypertension，HPH) 不可逆轉的關鍵因素和血管變化特征。血管內皮生長因子(vascular endo-thelial growth factor，VEGF)又稱為血管通透因子，其在機體含氧量較低的條件下具有促進血管增生的作用[2]。在缺氧環境下，機體中VEGF的含量明顯增加，這表明VEGF的表達受缺氧的調節[3-4]。低氧誘導因子(hypoxia-induced factor，HIF)-1α是具有轉錄活性的核蛋白，肺臟為其作用的主要靶器官。動物實驗表明，HIF-1α在PHP大鼠肺臟組織中的表達上調，由此推測HIF-1α是HPH發病的關鍵[4]。HIF-1α可能通過誘導VEGF表達上調引起血管腔狹窄，導致肺血管重建等的發生，從而引發HPH[5]。

紅景天是一種較為珍貴的野生植物，主要生長在晝夜溫差大的高原地區，作為中草藥，其具有益氣活血的功效[6]，同時具有抗衰老、免疫調節、預防老年癡呆等作用。紅景天苷為紅景天提取物，具有抗缺氧的作用，可用于高原反應的治療[7]。李龍等[8]的研究表明，添加一定比例紅景天粉的日糧可顯著增加高原缺氧環境中肉雞的抗氧化自由基的能力。而HPH是罹患高原肺水腫、高原性心臟病等高原性疾病的初始環節。因此，本研究建立HPH大鼠模型，分析紅景天苷對HPH大鼠的干預效果以及對大鼠體內HIF-1α、VEGF表達的影響，為進一步研究HPH的臨床治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 選擇90只健康Wistar 大鼠，雌雄各半，30日齡，體重(150±10)g，購自湖北省實驗動物研究中心(許可證號：2019-0077)。采用隨機數字表法隨機分為對照組、模型組、紅景天苷干預組，每組30只。按常規飼養條件進行飼養，即環境溫度21℃～27℃，相對濕度為40%～70%，自由攝食和飲水。

1.2 主要儀器與試劑 ProOx-810型低壓低氧艙購自上海塔望智能科技有限公司，3K15型高速冷凍離心機購自Sigma公司，超微壓力導管購自ADInstruments公司(批號：SPR-864)，BP-28生物信號采集處理系統購自高碑市新航機電設備有限公司， Biosignals Professional(8通道)多導儀購自PLUX公司，ChemiDoc XRS+凝膠成像儀購自Bio-Rad公司，Qubit核酸定量儀購自Invitrogen公司，LightCycler 480 PCR儀購自Roche公司。紅景天苷購自上海源葉生物科技有限公司(批號：10338-51-9)；二喹啉甲酸試劑盒購自白鯊生物科技(批號：BL521A)，兔抗鼠多克隆VEGF抗體(批號：A00623)、兔抗鼠多克隆HIF-1α抗體(批號：M00013)、山羊抗兔辣根過氧化物酶-IgG(批號：BA1056)購自武漢博士德生物工程有限公司，內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自ABclonal生物科技有限公司(批號：A19056)，聚偏二氟乙烯膜購自MilliPore公司(批號：IPVH00010)、顯影定影試劑(批號：P0019)購自碧云天公司，電泳緩沖液為自配；TRIzol試劑購自Applygen公司(批號：R1030)，反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司(批號：AT101)。

1.3 建模和干預方法 參照文獻[9]的方法建立大鼠HPH模型，將模型組和紅景天苷干預組大鼠放于低壓低氧艙(大氣壓約為50 kPa，氧濃度約為10%)，每天8 h，其余時間為常壓常氧環境，持續4周。進入低壓低氧艙的當天開始，紅景天苷干預組每天按32 mg/kg腹腔注射0.2%紅景天苷(用生理鹽水配置)，模型組大鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水，1次/d，持續4周。兩組均先進行低壓低氧干預，再進行藥物干預，對照組大鼠于常壓常氧環境中飼養，未給予任何干預。

1.4 右心室相關指標和平均肺動脈壓的檢測 實驗結束后當天，大鼠禁食5 h，然用0.3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉各組大鼠，同時給予肌內注射0.1%的阿托品(0.5 mL/100 g)以減少腺體的分泌防止造成氣道堵塞。麻醉成功后，將大鼠固定于操作臺上，首先通過右心導管插入術將超微壓力導管連接生物信號采集處理系統以測定右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)。測完RVSP后，剝離右頸外靜脈，沿近心端緩慢插入含有10 U/mL肝素的導管，然后結扎血管，松開止血鉗，由壓力傳感器將壓力信號傳輸給多導儀，于松開止血鉗開始記錄0 h、1 h、2 h、4 h、8 h壓力值，描繪壓力曲線，記錄平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)。測壓后開胸取心臟，并稱取右心室重量和左心室加室間隔的重量，右心室肥厚指數=右心室重量/左心室加室間隔的重量，稱量完畢后將心臟組織放于10%福爾馬林固定液中固定24 h。

1.5 蛋白免疫印跡實驗檢測VEGF和HIF-1α蛋白的表達 取各組大鼠肺組織分別置于已預冷的RIPA裂解液和PMSF抑制劑中(RIPA與PMSF體積比為1 ∶100，共0.5 L)，組織勻漿，提取蛋白，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min。將上清轉移至新的離心管中，用二喹啉甲酸試劑盒測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，變性10 min。每孔加樣3 μL，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，采用含5%的脫脂奶粉封閉液封閉膜3 h后，滴加一抗(稀釋體積比為1 ∶500，抗體用TBST稀釋)，4℃過夜，用TBST于室溫下漂洗5 min×4次。以山羊抗兔辣根過氧化物酶-IgG為二抗(稀釋體積比為1 ∶5 000，抗體用TBST稀釋)，37℃孵育2 h，用TBST于室溫下漂洗5 min×4次。滴加ECL發光液孵育1～2 min，放入凝膠成像儀中曝光成像。并利用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH蛋白灰度值的比值作為目的蛋白表達水平。

1.6 實時熒光定量PCR檢測VEGF mRNA和HIF-1α mRNA的表達 采用常規TRIzol法提取不同組小鼠肺組織總RNA，用核酸定量儀對RNA的純度和濃度進行檢測，將檢測合格的RNA(A260/A280=1.8～2.1)反轉錄成cDNA，保存于-20℃。通過GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)獲取內參基因GAPDH及目的基因VEGF、HIF-1α的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，由北京擎科生物科技有限公司合成引物，引物序列見表1。用LightCycler 480 PCR儀檢測VEGF、HIF-1α mRNA相對表達量。PCR反應體系為20 μL，包括cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1 μL，2×Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應程序：95℃預變性15 min；95℃變性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt方法計算目的基因mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.7 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠右心室相關指標的比較 模型組、紅景天苷干預組大鼠的RVSP和右心室肥厚指數均高于對照組，但紅景天苷干預組大鼠的RVSP和右心室肥厚指數均較模型組下降(均P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠RVSP和右心室肥厚指數的比較(x±s)

2.2 各組大鼠各時間點mPAP的比較 連續監測8 h內，各個時間點模型組的mPAP均高于對照組，而除1 h時外，其他各個時間點紅景天苷干預組的mPAP均低于模型組(均P<0.05)。見表3。

表3 3組小鼠各個時間點mPAP的比較(x±s,mmHg)

2.3 各組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α蛋白表達水平的比較 與對照組相比，模型組、紅景天苷干預組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α蛋白的相對表達水平升高(均P<0.05)；與模型組相比，紅景天苷干預組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α 蛋白的相對表達水平降低(均P<0.05)。見表4和圖1。

表4 3組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖1 各組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α蛋白的表達情況

2.4 各組大鼠肺組織VEGF和HIF-1α mRNA相對表達水平的比較 與對照組相比，模型組、紅景天苷干預組大鼠肺組織 VEGF、HIF-1α mRNA 的相對表達水平均升高(P<0.05)；與模型組相比，紅景天苷組大鼠肺組織VEGF mRNA的相對表達水平降低(均P<0.05)，但是紅景天苷干預組與模型組大鼠肺組織的HIF-1α mRNA相對表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 3組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α mRNA相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

近年來，眾多國內外學者對HPH的發生機制進行了深入研究,現在普遍認為HPH的發生有兩大關鍵點：一是前期低氧性肺血管收縮，二是后期肺血管重建[10]。但至今其發生機制尚不完全清楚，大多數學者認為HPH的發生由多方面原因造成，例如離子通道活性被激活或抑制、氧不充足時導致損傷、多基因調控等因素[11]。多個研究表明，HPH的發生與機體缺氧密不可分，而在其中起關鍵作用的是VEGF和HIF。例如，?？萚5]研究發現，新生HPH大鼠的肺組織中HIF-1α mRNA表達上調，HIF-1α在HPH的發病機制中發揮重要作用；李福祥等[12]的研究結果顯示，在低氧情況下，大鼠體內肺動脈細胞的HIF-1α mRNA及蛋白表達量都超過正常范圍。王娟梅等[13]指出，缺氧的新生鼠體內VEGF蛋白表達水平升高，并且和低氧時長呈正相關；Tuder等[14]研究發現，重度PAH患者存在肺動脈血管內皮損傷，且肺動脈血管內皮細胞中HIF-1α與VEGF的mRNA表達量增加； Christou等[15]的研究表明，大鼠生存于10%低氧環境1～3周，肺內的VEGF mRNA表達明顯增強，肺動脈、支氣管末梢上皮、平滑肌細胞和肺泡內的VEGF蛋白呈強陽性表達；如果缺乏HIF-1α的表達，VEGF mRNA水平顯著降低，且即使在低氧條件下，VEGF mRNA也未被誘導表達[16]。

本研究采用低壓低氧法建立大鼠HPH模型，4周后模型組大鼠RVSP和mPAP較對照組增加，這表明利用低壓低氧法成功構建HPH大鼠模型。紅景天苷具有消腫止痛、減緩衰老、抗缺氧、加快血管血液流動[17]，以及減慢疲勞程度、清除自由基、調節大腦神經系統、緩解肌肉抽搐的功能[18-19]。結合HIF-1α的作用，我們推測這些功能可能與HIF-1α的生物調節有一定聯系。因此，我們利用紅景天苷干預HPH大鼠，觀察其干預效果，并通過檢測肺組織VEGF和HIF-1α的表達探討其可能的干預機制。結果顯示，相比于模型組大鼠，紅景天苷干預組大鼠mPAP和右心室肥厚指數均降低，這表明紅景天苷能有效控制HPH的發展。另外，模型組大鼠肺組織中VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表達均上調，與既往研究[12,14]結果相似；而紅景天苷干預組大鼠肺組織中VEGF mRNA和蛋白、HIF-1α蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)。由此推測：紅景天苷通過下調HIF-1α蛋白的表達間接抑制HIF-1α上調下游靶基因VEGF蛋白的作用，降低缺氧對內皮細胞的損壞，改善肺動脈血管收縮、舒張因子的動態失衡，并降低肺血管平滑肌增殖，抑制肺血管重構，從而有效遏制HPH的發展。

綜上所述，紅景天苷可能通過下調肺組織血管收縮因子HIF-1α和VEGF水平，從而干預HPH的發展，但是其具體的作用機制還有待進一步探究。