菠蘿COL基因的克隆及響應乙烯的表達特性分析

阮城城 胡福初 王祥和 郭利軍 李玉靜 范鴻雁 羅志文 陳哲 張治禮

摘? 要：COL（CONSTANS Like）基因不僅響應光周期調控，還參與植物器官的發育及非生物脅迫的響應。本研究克隆了4個菠蘿COL（AcCOL）同源基因，預測其蛋白的結構理化性質和啟動子順式作用元件，并探究AcCOL基因在乙烯利處理后的時空表達模式。結果表明：AcCOL1、AcCOL2基因分別編碼387、243個氨基酸，都含有CCT結構域，屬于第Ⅳ類COL基因;AcCOL3、AcCOL4基因分別編碼394、411個氨基酸，均含有1個B-box和1個CCT結構域，屬于第Ⅲ類COL基因。啟動子順式作用元件預測表明4個AcCOL的啟動子中均含有光響應元件、晝夜節律表達相關元件。AcCOL1和AcCOL2啟動子均含有生長素響應元件和乙烯響應元件;AcCOL3和AcCOL4啟動子均含有細胞分裂素響應元件。實時熒光定量PCR分析結果顯示，AcCOL基因主要在葉中表達。乙烯利處理后，4個AcCOL同源基因均有不同程度上調。與各自時期的對照相比，AcCOL1和AcCOL4在莖中表達上調較多;AcCOL2和AcCOL3在葉中表達上調較多。另外，AcCOL2基因在3個組織部位中與各自時期的對照相比均有顯著上調。研究表明，4個AcCOL同源基因在乙烯利處理后，表達水平均有上調;其中AcCOL2更為顯著，在3個組織部位中，與另外3個基因相比表達上調更多。說明AcCOL2基因對外施的乙烯利信號更加敏感，可能在乙烯作用途徑中發揮作用。

關鍵詞：菠蘿;乙烯利;CONSTANS Like;表達分析

中圖分類號：S813.3? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： COL （CONSTANS Like） gene not only responds to photoperiod regulation， but also participates in the development of plant organs and abiotic stress response. In this study， four homologous genes of AcCOL were cloned， then bioinformatics was used to analyze the amino acid sequence and the cis acting elements of AcCOL， finally the spatiotemporal expression pattern of the genes after ethephon treatment was explored. The results showed that the genes of AcCOL1 and AcCOL2 encoded 387 and 243 amino acids respectively， both of which contained CCT domains and belonged to the group IV COL genes; the genes of AcCOL3 and AcCOL4 encoded 394 and 411 amino acids respectively， both of which contained a b-box and a CCT domain and beloned to the class III COL genes. The prediction of promoter cis acting elements showed that the four promoters of AcCOL contained light response elements and circadian rhythm expression related elements. AcCOL1 and AcCOL2 promoters both contained auxin responsive elements and ethylene responsive elements， and AcCOL3 and AcCOL4 promoters both contained cytokinin responsive elements. The results of real-time PCR showed that the expression of AcCOL genes were mainly in leaves. After ethephon treatment， the four homologous genes of AcCOL were up-regulated in varying degrees. AcCOL1 and AcCOL4 were up-regulated in the stem， and AcCOL2 and AcCOL3 were up-regulated in the leaves. In addition， the AcCOL2 gene was significantly up-regulated in the three tissue sites compared with the control in each period. The results showed that the expression level of the four AcCOL homologous genes was up-regulated after ethephon treatment， of which AcCOL2 was more significant， and in three tissue sites， the expression was up-regulated more than the other three genes. It is suggested that AcCOL2 gene was more sensitive to ethylene signal and may play an important role in ethylene pathway.

Keywords： pineapple; ethephon; CONSTANS Like; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.002

在高等植物的生長過程中，開花是一個重要的階段，不僅決定了產量的高低，還與人類生活密切相關。隨著人們對擬南芥不斷深入的研究，形成了經典的5個成花途徑：光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、自發途徑、年齡途徑[1-2]。這些途徑彼此獨立而又相互聯系，共同形成了復雜的成花網絡[3]。

在光周期途徑中GI基因響應光照長短的變化，并調節CO基因的表達。CO基因促進下游“開花整合子”SOC1、FT等基因的轉錄，影響下游基因的表達，從而對開花時間進行調控[4]。COL蛋白一般含有2個保守結構域：B-box（BBX）和CCT（CONSTANS，CO like及TOC1）結構域[5]。不同COL基因的CCT結構域差異不大，B-box結構域的差異比較明顯，前者與核定位信號相關，后者具有蛋白互作的區域[6]。根據進化和基因結構，COL基因可以被分為四類，第Ⅰ類含有2個B-box結構域和1個CCT結構域;第Ⅱ類含有1個B-box結構域和1個序列發生變化、無正常功能的類似B-box結構域以及1個CCT結構域;第Ⅲ類含1個B-box結構域和1個CCT結構域;第Ⅳ類僅含有1個CCT結構域[7-8]。在植物的進化過程中絕大多數COL基因結構相似，都被晝夜節律和光周期調控，但也有一些COL基因產生了不同的功能[9]。AtCOL3除了在光周期中發揮負調控作用，還促進側根的發育[10];AtCOL7在高的紅光/遠紅光比例的環境中能促進莖的分枝[11]。香蕉COL1基因響應冷、真菌等脅迫并與果實成熟過程有所關聯[12]。葡萄COL1基因參與芽休眠過程，而COL5則與胚珠的發育相關[13-14]。梨COL8基因通過抑制下游SOC1、FT等基因的表達來抑制成花，超表達該基因造成擬南芥晚花[15]。由此可見，結構相似的COL基因可能發揮著不同的功能。

菠蘿（Ananas comosus L.）是多年生草本植物，著名的熱帶水果。我國是世界十大菠蘿主生產國之一，產區主要集中于華南地區，目前菠蘿已成為我國重要的熱帶經濟作物[16]。菠蘿自然成花的經濟價值較低，常會出現開花整齊度不高的現象，嚴重影響了菠蘿的上市;因此實際生產中常常采用外施乙烯利或者乙炔來提高開花整齊度與開花率，從而提高種植效益[17]。目前對乙烯利誘導菠蘿成花的分子機制尚不清楚，已研究的成花基因主要包括FT[18]、PI[19]、MADS1[20]、LFY[21]等，未見菠蘿COL基因的相關報道，乙烯利與AcCOL基因的關系也不清楚。本研究以菠蘿‘臺農4號為材料，成功克隆了4個COL同源基因，同時利用qRT-PCR技術研究COL基因在不同組織、不同時期乙烯利處理前后的表達情況，為進一步研究COL基因在乙烯利誘導菠蘿成花過程中的作用奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以菠蘿‘臺農4號品種為試材，種植于海南省澄邁縣美亭村菠蘿基地。300倍液40%乙烯利（1600 mg/L）灌心處理誘導菠蘿成花[22]，處理后2 h、4 h、6 h、8 h、1 d、2 d分別采樣，包括莖、葉、莖尖等部位或組織，同樣時間段以相同體積的清水灌心處理為對照，液氮速凍后于–70 ℃冰箱保存備用。

1.2? 方法

1.2.1? RNA的提取和cDNA的合成? 采用植物總RNA提取試劑盒（福際生物）提取葉片總RNA，Thermo反轉錄試劑盒反轉錄cDNA。

1.2.2? 引物設計與PCR反應體系? 通過擬南芥CO基因在菠蘿基因組數據庫中進行比對，獲得4個COL同源基因的序列，以此為基礎利用Primer 5.0軟件設計引物（表1）對菠蘿COL基因的ORF區進行擴增。以反轉錄的cDNA為模板，反應體系為25 μL。95 ℃預變性3 min;95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環;72 ℃延伸5 min。凝膠分析擴增結果。引物合成和測序由天一輝遠公司完成。

1.2.3? 序列分析、蛋白結構預測及系統進化樹的構建? 利用BioEidt 7.2.5軟件，對克隆得到的cDNA序列進行翻譯，然后利用NCBI的BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線軟件對測序結果進行檢索，并下載相似性>50%的蛋白序列。用NCBI中的ORF Finder （https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析AcCOL基因編碼區;用在線軟件ProtParam （http：//web.expasy. org/protparam/）對蛋白分子量、等電點等進行預測分析;用GOV IV（http：//npsa-prabi.ibcp.fr）分析蛋白二級結構;用PLACE（https：//www. dna.affrc.go.jp）預測啟動子順式作用元件;應用DNAMAN 6.06進行多序列同源性對比分析，利用MEGA 6.0采用鄰接法（neighbor-joining method）[23]構建系統進化樹。

1.2.4? 實時定量PCR反應? 以總RNA反轉錄后的cDNA為模板，EF1為內參基因[24]，每個樣品3次重復，進行實時熒光定量PCR分析。該反應在LightCycler 480實時熒光定量PCR儀上進行。實時定量PCR的反應體系為10 μL，包括1 μL cDNA，5 μL SYBR Green I Master，10 μmol/L的正反向引物各1 μL，2 μL ddH2O。數據采用2-ΔΔCT法[25]進行相對定量分析，利用Excel、GraphPad Prism 5.0等軟件進行統計學分析。

2? 結果與分析

2.1? 菠蘿AcCOL基因的克隆與序列分析

以菠蘿葉片總RNA反轉錄的cDNA為模板，成功克隆得到了4個AcCOL同源基因，分別命名為AcCOL1、AcCOL2、AcCOL3、AcCOL4。序列分析結果顯示，AcCOL1基因的開放閱讀框為1164 bp，編碼387個氨基酸;AcCOL2基因的開放閱讀框為732 bp，編碼243個氨基酸;AcCOL3基因的開放閱讀框為1185 bp，編碼394個氨基酸;AcCOL4基因的開放閱讀框為1236 bp，編碼411個氨基酸。

生物信息學分析顯示（圖1），4個AcCOL蛋白在靠近C端處都有CCT保守結構域，并且都含有折疊延伸鏈、無規則卷曲和α螺旋結構等結構。GOR IV預測發現（表2），上述3種結構在AcCOL1蛋白中的占比分別為8.01%、49.10%、42.89%，在AcCOL2蛋白中的占比分別為14.40%、67.08%、18.52%，在AcCOL3蛋白中的占比分別為19.54%、62.69%、17.77%，在AcCOL4蛋白中的占比分別為17.03%、64.72%、18.25%。

利用Protparam軟件，對AcCOL蛋白質序列的理化性質進行了預測。結果顯示，AcCOL1、AcCOL2、AcCOL3、AcCOL4蛋白理論等電點（pI）分別為5.60、8.36、5.61、5.28，脂溶指數分別為62.02、46.71、63.40、62.75，推測AcCOL1、AcCOL3、AcCOL4可能為親脂性蛋白，AcCOL2可能為親水性蛋白（表2）。

2.2? 菠蘿AcCOL基因編碼氨基酸的同源性分析

氨基酸序列比對發現，AcCOL3與AcCOL4均含有1個B-box和1個CCT結構域，屬于第Ⅲ類COL基因;AcCOL1和AcCOL2均只含有CCT結構域，屬于第Ⅳ類COL基因（圖2）。同時我們發現不同植物種類的B-box結構域中有一些序列是相對保守的，含有數個相同的氨基酸序列。二級結構預測結果顯示，4個AcCOL同源基因靠近N端的二級結構是相似的，都形成中間是折疊延伸鏈，兩端是α-螺旋的構造（圖1）。說明AcCOL1和AcCOL2基因與AcCOL3與AcCOL4基因同屬于COL家族。

2.3? 菠蘿AcCOLs系統進化分析

通過搜索NCBI數據庫，將4個AcCOL蛋白與其他物種約31個CO或COL蛋白進行系統進化分析（圖3）。結果表明，這些蛋白整體被分為4組，4個AcCOL蛋白被分為兩組。AcCOL1和AcCOL2屬于Ⅳ組，AcCOL3和AcCOL4屬于Ⅲ組。此外，從圖3也可看出，AcCOL1和AcCOL2與高羊茅FaCO及擬南芥AtCOL8的遺傳距離較近，AcCOL3與蘆筍的AoCOL9遺傳距離較近，AcCOL4與鐵皮石斛DcCOL9、春蘭CgCOL的遺傳距離較近，這些基因均與植物成花密切相關。

2.4? AcCOL啟動子順式作用元件分析

通過對4個AcCOL基因啟動子順式作用元件進行分析，其作為CO基因家族成員，啟動子區域均含有光響應元件INRNTPSADB、晝夜節律表達相關元件CIACADIANLELHC。另外，還發現了不同激素響應元件。AcCOL1和AcCOL2基因的啟動子區域均含有生長素響應元件AUXRETGA2GMGH3和乙烯響應元件ERELEE4;AcCOL3和AcCOL4基因均含有細胞分裂素響應元件CPBCSPOR（表3）。

2.5? 乙烯利處理下AcCOL基因的表達分析

乙烯利處理后，AcCOL1基因的表達在莖尖與各自時期的對照相比基本均有所上調。處理后2 d，相對表達量最高，約為對照（0 h）的1.8倍;在莖中，AcCOL1基因的表達與各自時期的對照相比基本均有顯著的上調，在處理后2 h達到最高，約為對照（0 h）的6倍;而在葉中AcCOL1基因的表達與各自時期的對照相比基本呈下調趨勢（圖4A～圖4C）。

AcCOL2基因的表達在莖尖中與對照（0 h）相比明顯下調，但與各自時期的對照相比都有顯著的上調;在莖中，AcCOL2基因的表達與各自時期的對照相比均有顯著的上調;AcCOL2基因的表達在葉中呈現先升高后降低再升高的趨勢，并且與各自時期的對照相比均有顯著的上調，處理后2 d達到最大值，約為對照（0 h）的35倍（圖4D～圖4F）。

AcCOL3基因的表達水平在莖尖中與各自時期的對照相比均有顯著的上調，在處理后8 h達到最大值，約為對照（0 h）的4.5倍;在莖中，AcCOL3基因的表達與對照（0 h）相比明顯下調，但其表達趨勢在處理后8 h內逐漸升高;AcCOL3基因的表達在葉中呈現先升高后降低的趨勢，除處理后1、2 d外，與各自時期的對照相比均有顯著的上調（圖4G～圖4I）。

EgCOL3：油棕（XP_010914103.1）;PdCOL4：海棗（XP_008789696.1）;PhCOL3：哈氏黍（XP_025825843.1）;ZmCOL3：玉米（XP_008663359.1）;SiCOL3：小米（XP_004976103.1）;SbCOL4：高梁（XP_002446734.2）;EgCOL10：油棕（XP_010942895.1）;PdCOL10：海棗（XP_008803173.1）;DcCOL9：鐵皮石斛（XP_020681736.1）;PhCOL9：哈氏黍（XP_025827948.1）;EgCOL9：油棕（XP_010942554.1）;PdCOL9：海棗（XP_008801879.1）;AoCOL9：蘆筍（XP_020264346.1）;CgCOL：春蘭（AXY87623.1）;PsCO：牡丹（AHM25240.1）;MiCO：芒果（ADX97322.1）;StCO：土豆（NP_001274795.1）;NtCO：煙草（AFY06686.1）;GhCOL4：棉花（NP_001313742.1）;FaCO：高羊茅（ADA67904.1）;SlCO1：番茄（NP_001233839.1）;TsCO：烏桕（ARS25033.1）;PvCO：菜豆（AGZ15419.1）;FaCO：草莓（ACJ06578.1）;擬南芥：AtCO （NP_197088.1）， AtCOL4 （NP_197875.1）， AtCOL5 （AAM45054.1）， AtCOL6 （AAM10103.1）， AtCOL8 （NP_15339.2.1）， AtCOL10 （NP_199636.1）， AtCOL11 （NP_193260.2）。

EgCOL3： Elaeis guineensis （XP_010914103.1）; PdCOL4： Phoenix dactylifera （XP_008789696.1）; PhCOL3： Panicum hallii （XP_025825843.1）; ZmCOL3： Zea mays （XP_008663359.1）; SiCOL3： Setaria italica （XP_004976103.1）; SbCOL4： Sorghum bicolor （XP_002446734.2）; EgCOL10： Elaeis guineensis （XP_010942895.1）; PdCOL10： Phoenix dactylifera （XP_008803173.1）; DcCOL9： Dendrobium catenatum （XP_020681736.1）; PhCOL9： Panicum hallii （XP_025827948.1）; EgCOL9： Elaeis guineensis （XP_010942554.1）; PdCOL9： Phoenix dactylifera （XP_008801879.1）; AoCOL9： Asparagus officinalis （XP_020264346.1）; CgCOL： Cymbidium goeringii （AXY87623.1）; PsCO： Paeonia suffruticosa （AHM25240.1）; MiCO： Mangifera indica （ADX97322.1）; StCO： Solanum tuberosum （NP_001274795.1）; NtCO： Nicotiana tabacum （AFY06686.1）; GhCOL4： Gossypium hirsutum （NP_001313742.1）; FaCO： Festuca arundinacea （ADA67904.1）; SlCO1： Solanum lycopersicum （NP_001233839.1）; TsCO： Triadica sebifera （ARS25033.1）; PvCO： Phaseolus vulgaris （AGZ15419.1）; FaCO： Fragaria x ananassa （ACJ06578.1）. Arabidopsis thaliana： AtCO （NP_197088.1）， AtCOL4 （NP_197875.1）， AtCOL5 （AAM45054.1）， AtCOL6 （AAM10103.1）， AtCOL8 （NP_15339.2.1）， AtCOL10 （NP_199636.1）， AtCOL11 （NP_193260.2）.

AcCOL4基因的表達在莖尖中與對照（0 h）相比明顯下調。在莖中，AcCOL4基因的表達僅在處理后2、4 h有明顯的上調，分別約為對照（0 h）的18、11倍，其他時期與對照相比基本無顯著變化;AcCOL4基因的表達在葉中呈現先升高后降低的趨勢，在處理后4 h達到最大值，約為對照（0 h）的520倍（圖4J～圖4L）。

4個AcCOL基因的表達水平在乙烯利處理后與各自時期的對照相比均有不同程度的上調，其中AcCOL2的表達最為顯著。因此，4個AcCOL基因對乙烯信號具有一定的響應，其中AcCOL2基因對其更加敏感。

3? 討論

20世紀初，人們對成花生理進行了大量的探索，隨后出現了成花研究史上2個重要的學說——“開花素”學說和“光敏素”學說，但這也僅僅是假說;直到后來成花相關基因的克隆，才令成花研究進入高速發展階段[26]。成花相關基因在擬南芥、水稻等模式生物中已經進行了深入的研究，大量的基因被鑒定了出來[27-29]。COL（CONSTANS Like）基因是重要的成花相關基因，響應日長、晝夜節奏等環境因素，COL基因家族在各種植物中廣泛存在，COL基因家族在擬南芥、水稻、大麥、大豆、甘菊中分別有17、16、9、26、11個成員[30-33]。通過與菠蘿基因組[34]比對分析，共發現菠蘿中有21個COL基因，本研究克隆獲得4個AcCOL基因，因此對該基因家族的研究仍需完善。擬南芥COL基因大致被分為3類，研究表明幾乎所有的第一類COL基因都與成花相關[35-37]。而第二類和第三類COL基因幾乎不參與光周期途徑調控的成花機制，如AtCOL9能夠抑制CO、FT的表達從而推遲成花轉變[38]。本實驗中，通過AtCO基因在菠蘿數據庫中進行比對，發現4個與其他物種的COL基因遺傳距離相近的4個基因，從而確定命名為COL同源基因。通過序列和進化樹分析，AcCOL1和AcCOL2屬于第四類基因，AcCOL3和AcCOL4屬于第三類基因，這4個基因可能通過光周期途徑以外的方式實現成花調控。水稻中的COL基因被分為2個亞組：一類含有2個不完整的B-box結構，另一類含有1個CCT結構域但沒有典型的B-box結構[39]。大麥HvCO9基因只含有CCT結構域，該基因在長日照下抑制成花但在短日照條件下促進成花[40]。有著相似結構的AcCOL1和AcCOL2也可能發揮著類似的功能。

在植物的葉中，光受體和光敏色素能夠影響CO蛋白的穩定性，CO蛋白主要在葉片的韌皮部激活FT的表達，FT蛋白通過篩管進入莖尖分生組織最終調控植物成花[41-43]。本研究中，4個AcCOL基因在葉中的表達水平除AcCOL1外，與莖尖和莖中的表達水平相比隨著時間的推移均有較為顯著的變化，這表明這3個AcCOL基因在葉中有較多的富集。在水稻中水楊酸和乙烯信號途徑與水稻稻瘟病息息相關，而超表達OsCOL9基因能明顯增加這2種物質的合成[44]。在葡萄中，外施乙烯利能夠使某些COL基因顯著上調[45]。本文中4個AcCOL基因在乙烯利處理后均有不同程度的上調，而AcCOL2基因的表達更為顯著并且該基因的啟動子包含乙烯順式作用元件。這些表明，AcCOL2可能在乙烯調控途徑中發揮重要作用。只含有1個CCT結構域的芒果COL6基因在成花誘導期和花芽分化期的臨界點有較高的表達，暗示該基因可能與花芽的發育相關[8]。本研究中擁有相似結構的AcCOL1和AcCOL2也可能發揮類似的功能。植物在逆境環境中，生長周期會縮短，成花速度也大大加快。在擬南芥中，脫落酸通過調控GI和CO基因來激活FT的表達從而提早成花[46]。脫落酸和乙烯是具有密切聯系的兩大植物激素，脫落酸能促進乙烯的生成，從而攜手在逆境條件下發揮作用[47]。乙烯利能夠促進菠蘿成花，是因為乙烯利作為一種脅迫處理，可能存在一種類似脫落酸的方式，通過調控AcCOL基因來實現成花誘導。

本研究結果表明菠蘿在乙烯利處理后，AcCOL基因的表達均有上調，其中含有乙烯順式作用元件的AcCOL2基因的表達上調更顯著，說明AcCOL2基因在乙烯調控途徑中發揮了重要的作用。而AcCOL2基因是否在乙烯利誘導菠蘿成花過程中發揮作用，尚需進行實驗加以驗證。

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責任編輯：黃東杰