石斛屬部分植物SRAP-PCR反應體系的建立與優化

張迎輝 杜溶訖 凡莉莉 楊旺利 榮俊冬 鄭郁善 陳禮光

摘? 要：建立石斛屬（Dendrobium）植物SRAP-PCR反應體系，為石斛的品種鑒定與分類提供理論和技術基礎。采用單因素及正交試驗對反應體系中的各因子進行優化，確定最優退火溫度，并篩選有效引物。結果表明：適用于石斛屬植物SRAP最佳的反應體系為：Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 30 ng，10×PCR buffer 2.5 μL，其余用滅菌后的ddH2O補足至25 μL。最優擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，36 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循環;94 ℃變性1 min，根據不同引物的不同退火溫度復性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環;最終72 ℃延伸7 min，保存于4 ℃恒溫箱中。應用所建立的優化反應體系成功地篩選出15條多態性較高的引物。

關鍵詞：石斛屬;SRAP;反應體系;優化

中圖分類號：Q75? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： The purpose of this study was to establish an optimized SRAP system for some species of Dendrobium.Single factor and orthogonal test designs were applied to optimize five factors， Mg2+， dNTPs， Taq DNA polymerase， primer and template DNA concentration， in the SRAP amplification system.Due to different species， the concentrations of Mg2+， dNTPs， Taq DNA polymerase， primers and template DNA in the SRAP reaction system were different， and the annealing temperature and the number of cycles in the amplification program also affected the experimental results， and finally the selection and establishment of Dendrobium SRAP optimal reaction system and amplification procedure was： Mg2+ 2.5 mmol/L， dNTPs 0.25 mmol/L， Taq DNA polymerase 1.25 U， primer 0.4 μmol/L， template DNA 30 ng， and the rest were filled with ddH2O. A total of 25 μL of amplification system was formed. The optimal amplification procedure was： pre-denaturation for 5 min at 94 ℃， denaturation for 1 min at 94 ℃， renaturation for 1 min at 36 ℃， extension for 1 min at 72 ℃， 5 cycles， denaturation at 94 ℃ for 1 min， depending on the annealing temperature of the different primers refolding for 1 min， extending at 72 ℃ for 1 min， 30 cycles， and finally extending at 72 ℃ for 7 min， stored at 4 ℃ constant temperature. A total of 15 primers with high polymorphism were successfully screened out by the optimized reaction system.

Keywords： Dendrobium; SRAP; reaction system; optimization

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.004

石斛屬（Dendrobium）為蘭科（Orchidaceae）植物最大的一個屬，包含約1500～1600個種，其中我國分布有76種。雖然我國石斛屬資源在世界上的占有率比較低，但對于藥用方面的開發與利用一直走在前沿。藥用石斛的基原植物主要包含鐵皮石斛（D. officinale）、金釵石斛（D. nobile）、馬鞭石斛（D. fimhriatum）及其近似種[1]。石斛作為我國傳統類滋補的中藥，在生津益胃和清熱滋陰等方面具有功效顯著的特點，被視為保健祛病的優品[2]?，F代藥理學研究表明石斛中主要含有多糖、聯芐類、菲類等多種化學成分，其在抗腫瘤、抗氧化等方面功效良好，具有較高的藥用價值[3]。隨著價格的不斷上升，市場出現種質混雜、真偽鑒定困難等問題[4]。在石斛種質鑒定方面，傳統的性狀分析需要有長期的經驗才能判斷[5]，顯微分析前期處理過程比較復雜，應用范圍較窄，只能對顯微結構有明顯區別的品種進行鑒定[6-8]，理化分析研究范圍局限于不同化學成分、性狀相似而且沒有明顯顯微特征的石斛[9-10]。隨著現代分子生物學的快速發展，DNA分子標記技術已被廣泛應用于物種親緣關系鑒別、基因庫構建、指紋圖譜庫等領域[11-14]。分子標記技術可檢測植物不同生長發育時期的任何組織器官，具有多態性高、遺傳穩定、數量大等優勢[15]。目前，DNA分子標記在石斛屬分類鑒定方面得到廣泛應用，段媛媛等[16]對鐵皮石斛和霍山石斛（D. huoshanense）進行ISSR鑒定體系的建立與優化，可用于2種石斛的鑒別;趙庭梅等[17]研究表明基因組SSR標記在鐵皮、迭鞘（D. denneanum）和金釵石斛種間具有較好的轉移性，在種內具有良好的多態性，為石斛的遺傳研究和分子輔助育種提供依據。SRAP（Sequence-related Amplified Polymorphism）標記法是一種新型的分子標記方法，具備多態性高、引物使用效率較高、簡單快捷、分布均勻等優點。本試驗建立了適用于石斛屬植物SRAP-PCR反應體系，并篩選出有效的引物，為石斛的品種鑒定與分類提供理論和技術基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 供試的32種石斛樣品采自于福建省福安旺盛經濟林研究所石斛種質資源圃（表1）。每種石斛取樣7～10株，每株取3～5片新鮮嫩葉，裝入塑料自封袋中，用變色硅膠（硅膠與葉片體積比例至少為10∶1）迅速干燥放入冰盒中，快速將干燥的樣品帶回實驗室，并于?80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.1.2? 儀器? 主要儀器包括Mastercycler pro梯度基因擴增儀、DYY-8C電泳儀、JS-680D凝膠成像分析儀、NanoDrop2000C紫外分光光度計等。

1.1.3? 試劑? 10×PCR buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶、dNTPs Mixture（各2.5 mmol/L）試劑購于大連TaKaRa公司;DNA梯形標記（100 bp）、6×loading Buffer購自生工生物工程（上海）股份有限公司;低電滲瓊脂糖（Agarose）、核酸染料（GoodViewTM）購自北京賽百盛基因技術有限公司;羥基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）、三氯甲烷、無水乙醇等為國產分析純。SRAP引物選取8條上游引物和7條下游引物，均由尚亞生物技術有限公司合成。

1.2? 方法

1.2.1? SRAP-PCR原初反應體系及反應程序的建立? 參考顏平[18]和司更花[19]研究的蘭科植物SRAP反應體系，石斛的SRAP初始擴增反應體系如下設定：25 μL的擴增體系中含有2.5 μL 10×buffer，2.0 mmol/L MgCl2，300 μmol/L dNTPs，Taq DNA聚合酶1 U，上下游引物各0.4 μmol/L，模板DNA為30 ng。初始反應程序設定為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，36 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循環;94 ℃變性1 min，51 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環;最終72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.2? 初始引物的篩選? 選擇一個DNA模版對56對引物進行初篩，從中挑選條帶清晰、重復良好、穩定性較好的多態性引物，最終選擇的上游引物為Me1，下游引物為Em3。引物的堿基序列見表2。

1.2.3? 石斛SRAP-PCR反應體系的單因素試驗? 設計? 不同濃度Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA進行依次試驗（表3），研究各因子對SRAP反應的影響。引物選擇上游引物為Me1，下游引物為Em3。

1.2.4? 石斛SRAP-PCR反應體系的正交試驗設計? 對Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA等5個因素開展正交試驗（表4）。反應體系為25 μL，引物選擇上游引物為Me1，下游引物為Em3，含有2.5 μL 10×buffer，其余用滅菌后的ddH2O補足。

1.2.5? 擴增反應程序退火溫度及循環次數的優化? 利用單因素試驗篩選出石斛SRAP-PCR反應體系的最優退火溫度和循環次數，其中循環次數設定6個水平，分別為28、30、32、35、38、40次。退火溫度設定12個水平，分別為39.9、40.4、41.7、43.5、45.8、48.4、51.1、53.8、56.2、58.1、59.5、60.1 ℃。

1.2.6? SRAP-PCR擴增產物檢測? 取8.5 μL依據優化的反應體系和擴增程序得來的PCR產物與1.5 μL 6×loading Buffer充分混勻，加到含有核酸染料（GoodViewTM）的1.2%的瓊脂糖凝膠中，電泳45 min，電壓設為120 V，電流設為120 A，電泳結束后將凝膠放入紫外凝膠成象分析儀中檢測拍照。

2? 結果與分析

2.1? Mg2+濃度的篩選

不合理的Mg2+濃度會大大降低引物和DNA的結合效率，影響DNA和PCR產物的解鏈溫度，從而產生引物二聚體降低產物的特異性[20]。設定8個Mg2+濃度梯度，如圖1所示，當Mg2+濃度小于或等于1.0 mmol/L時，無條帶出現，當Mg2+濃度為2.5～4.0 mmol/L時，擴增條帶數一致，從降低試驗成本考慮，反應液中Mg2+最佳濃度確定為2.5 mmol/L。

2.2? DNA濃度的篩選

通常DNA濃度的高低會直接影響擴增試驗的效果，出現無擴增產物或者擴增產物不穩定的現象[21]。但本研究發現不同的DNA濃度均能擴增出清晰明亮的條帶（圖2），為節省成本，選定模板DNA的最適濃度為10 ng。

2.3? dNTPs濃度的篩選

dNTPs作為PCR擴增的基礎，參與新鏈DNA的合成，對PCR反應結果產生顯著的影響，選擇最佳dNTPs濃度對PCR反應至關重要[22]。如圖3所示，當dNTPs濃度為0.05～0.15 mmol/L時，擴增的條帶數量較少且模糊不穩定;當dNTPs濃度為0.35～0.40 mmol/L時，擴增條帶數量少，所以綜合考慮選定dNTPs的最佳濃度為0.20 mmol/L，此時條帶數量多、穩定且清晰。

2.4? Taq DNA聚合酶濃度的篩選

Taq DNA聚合酶濃度過高易出現非特異性條帶，并增加試驗成本，其濃度過低會影響新鏈合成效率，甚至無擴增[23]。當Taq DNA聚合酶濃度為0.25～0.75 U和1.50～2.00 U時，擴增的條帶數量少且模糊，當濃度為1.00 U時，擴增的條帶數量多且清晰（圖4），所以選定Taq DNA聚合酶的最佳濃度為1.00 U。

2.5? 引物濃度的篩選

在SRAP-PCR擴增反應中引物的作用是與DNA模板特異性結合，引導新鏈的合成，其濃度主要影響擴增產物的質量，濃度過高會產生錯配與非特異性產物擴增，提高引物二聚體的形成，濃度過低則無法進行有效擴增[24]。當引物濃度為0.1～0.2 μmol/L時，條帶較少且模糊;當濃度為0.3～0.8 μmol/L時，條帶穩定且清晰（圖5），綜合成本考慮，選定最佳引物濃度為0.3 μmol/L。

2.6? 正交試驗設計的直觀分析

對石斛SRAP-PCR反應體系的正交試驗設計結果進行分析，結果表明，處理7、處理8、處理12擴增的條帶多且清晰，處理1、2和處理13、14擴增的條帶較少且模糊，擴增的效果較差（圖6）。參照田艷伶等[25]的方法，依據PCR擴增反應后條帶的數量多少和條帶的明暗度、清晰度來進行評分，最佳產物記16分，最差的計1分。2次重復分別獨立統計，16種處理的分數評定分別為：3、14、13、12、1、11、15、16、2、6、7、10、4、5、8、9;5、6、12、10、9、11、13、16、1、7、8、15、2、3、4、14。

依據平均分值進行直觀分析與方差分析（表5），極差R反應出各試驗因子對SRAP反應體系的影響，R值越大，則影響越顯著[25]，因此，各試驗因子對SRAP-PCR反應體系的影響依次為：dNTPs>Mg2+>Taq DNA聚合酶>引物>模板DNA;而ki則反應各試驗因子不同水平對反應體系的影響大小，ki越大則對反應體系越有效。因此，在正交試驗設計極差分析中，SRAP-PCR標記的反應體系的最優條件為：Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 60 ng，共25 μL體系。

2.7? 循環次數和退火溫度對SRAP擴增的影響

對循環次數設定6個梯度，分別為28、30、32、35、38、40次，如圖7所示，當循環次數為38次時，擴增的條帶數量最多且清晰。

利用建立的最佳擴增體系，選擇上游引物為Me1，下游引物為Em3，對其退火溫度進行梯度篩選，當退火溫度在40～60 ℃時，自動設定的梯度溫度分別為39.9、40.4、41.7、43.5、45.8、48.4、51.1、53.8、56.2、58.1、59.5、60.1 ℃。當退火溫度為39.9、40.4、41.7、43.5、45.8、48.4 ℃時，擴增的條帶較模糊且數量少，當退火溫度為51.1、53.8、56.2、58.1 ℃時擴增條帶雖然清晰但數量少，當退火溫度為59.5 ℃時，其擴增的條帶數量多且清晰（圖8），因此，選定59.5 ℃作為上游引物為Me1，下游引物為Em3的最佳退火溫度。按此方法進一步確定了15對有效引物的最優退火溫度（表6）。

2.8? SRAP有效引物篩選及反應體系的檢測

運用正交試驗和單因素試驗設計相結合，最終確定石斛SRAP-PCR最優反應體系為Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 30 ng，2.5 μL 10×buffer，剩余用ddH2O補齊，共25 μL體系。擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，36 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循環;94 ℃變性1 min，根據引物退火溫度復性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環;72 ℃延伸7 min，最后設定4 ℃保存。依據石斛優化后的最優反應體系和擴增程序，對56對引物進行擴增，最終篩選出15對有效引物（表6）。以31種石斛屬植物和金石斛的DNA為模板，用篩選出的有效引物在已優化的SRAP反應體系及擴增程序下進行擴增，擴增條帶清晰度高（圖9），符合試驗要求。

3? 討論

SRAP分子標記具有多態性高、引物使用效率高、簡單穩定等優點[17]，但也受到反應體系中Mg2+濃度等多種因素的影響[12]，這是因為Mg2+濃度變化可能會減弱Taq DNA聚合酶活性，降低引物和DNA的結合效率，此外，Mg2+濃度變化也會影響DNA和PCR產物的解鏈溫度，從而產生引物二聚體降低產物的特異性[20]。正交試驗結果證實Mg2+濃度是影響石斛屬植物SRAP-PCR反應體系的重要因子之一。DNA做為擴增反應的基礎，其濃度過大或過小時，PCR擴增會產生許多不需要的非特異性產物或不能擴增到任何產物[21]，但本試驗中不同的DNA濃度均能擴增出清晰明亮的條帶。dNTPs濃度對擴增產物的量有較大的影響，濃度過低會導致反應速度下降，擴增產物不穩定或擴增出來的條帶模糊不清，濃度過高會提高堿基錯配率和試驗成本[22]，試驗結果表明dNTPs濃度對石斛屬植物SRAP-PCR反應體系的影響最顯著。Taq DNA聚合酶濃度對SRAP-PCR擴增產生顯著的影響，其濃度過高易出現非特異性條帶，并增加試驗成本，其濃度過低會影響新鏈合成效率，甚至無擴增[23]。在SRAP-PCR擴增反應中引物的濃度直接影響擴增產物的質量，濃度過高易出現非特異性條帶，并形成引物二聚體，濃度過低則擴增產物量無法滿足要求[24]。循環次數、退火溫度對石斛SRAP- PCR擴增產生一定的影響，循環次數減少，擴增的條帶相對減少且清晰度降低，反之循環次數越多，則會產生非特異性擴增。另外，退火溫度太高也會影響引物和模板DNA的結合率降低，從而減少條帶數。

本研究最終確定的石斛屬植物SRAP-PCR最佳反應體系為：擴增體系為25 μL，其中Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，引物0.4 μmol/L，模板DNA 30 ng，剩余用滅菌的ddH2O補足。最優擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min;36 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5次循環;94 ℃變性1 min，根據引物退火溫度復性1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環;最終72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。以上述最佳反應體系與最優擴增程序為基礎進行引物篩選，在56對引物中篩選出15對重復性較好、多態性較高、擴增條帶較為清晰的引物。