金花茶組葉片生化成分評價及其最佳采收期研究

劉保財 陳菁瑛 張武君 黃穎楨 趙云青

摘? 要：本研究以26份來源于6種金花茶組植物、不同表型防城金花茶和不同月份采收的防城金花茶的成熟葉片為材料，建立同時測定蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚4種黃酮成分的HPLC法，以及優化了測定茶多酚、總黃酮、總多糖和總皂苷成分含量的紫外分光光度法，基于以上8種成分含量，結合主成分綜合評分和聚類分析的化學計量學方法，對不同來源金花茶葉片生化成分進行綜合評價。結果表明：8種成分含量在不同來源金花茶葉片中存在差異，其中無名金花茶8種成分含量均較高，四季金花茶、防城金花茶次之;8年生1—12月份采收的防城金花茶葉片中，總皂苷、總黃酮和總多糖含量均表現為升-降-升-降的變化規律，并在10月含量達到最高;5年生不同種（S1～S14）主成分綜合評分順序為：無名金花茶>四季金花茶>防城金花茶（花蕾大、花多、不抗寒、花黃且大、尖果）>顯脈金花茶>凹脈金花茶>小果金花茶;8年生不同月份（S15～S26）主成分綜合評分順序為：10月采>2月采>3月采>4月采>5月采>7月采>6月采>1月采>8月采>12月采>11月采>9月采，其中無名金花茶、四季金花茶及防城金花茶中花蕾大、花多、花黃且大等表型的金花茶葉片與2—4月份和10月份采集的8年生金花茶葉片的多指標綜合評分排序位列前10;聚類分析結果將供試26份樣品分為5類。綜上所述，金花茶葉片的生化成分與金花茶植物種類和采收期有關，無名金花茶、四季金花茶和防城金花茶中花蕾大、花多、不抗寒、花黃且大的表現型的綜合生化成分較高，初步確定防城金花茶葉片的適宜采收期為2—4月份和10月份，所建立的多指標定量結合化學計量學分析方法為金花茶組植物葉片的生化成分評價提供依據。

關鍵詞：金花茶組;多成分測定;化學計量學;品質評價;采收期

中圖分類號：S432.2? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： 26 accessions including six species of golden camellia， different phenotypes of Camellia chrysantha and C. chrysantha collected in different months were selected as the research materials. The simultaneous determination of rutin， quercetin， luteolin and kaempferiae by HPLC and the determination of tea polyphenols， flavonoids， total polysaccharides and total saponins by ultraviolet spectrophotometric were established and optimized. The quality of leaves of golden camellia from different sources was comprehensively evaluated based on the combination of the principal component comprehensive scores and clustering analysis of the eight biochemical components. There were differences in the content of the eight components in different sources. The content of the eight components in C. nitidissima was higher， followed by that of C. perpetua and C. chrysantha. The content of total saponins， total flavonoids and total polysaccharides in 8-year-old C. chrysantha collected from January to December all showed the rule of ascending-descending-ascending-descending， and reached the highest value in October. The order of the principal component comprehensive score of the 5-year-old different species （S1-S14） was as follows： C. nitidissima > C. perpetua > C. chrysantha （large flowers， many flowers， not cold-resistant， yellow flowers and large， sharp fruits） > C. euphlebi > C. impressinervis > C.nitidissima var. microcarpa. The order of the comprehensive scores of the main ingredients of the 8-year-old havested in different months （S15-S26） was October > February > March > April > May > July > June > January > August > December > November > September. Besides， the ranking of the comprehensive scores of large buds， large flowers， multi-golden flower and February to April and October harvested C. chrysantha was higher and at the first 10 ranks. Cluster analysis classified the 26 accessions could be classified into five categories. In summary， the quality of golden camellia was affected by variety， tree age and harvest time. The comprehensive biochemical compositions of C. nitidissima， C. perpetua and C. chrysantha with phenotype of large flower buds， many flowers， not cold resisdence， yellow and big flowers was better. It approved that the best harvest period of C. chrysantha was from February to April and October. The established multi-index quantitative analysis combined with chemometric analysis would provide a reference for biochemical evaluation of golden camellia.

Keywords： Camellia Sect. Chrysantha; simultaneous determination; chemometrics methods; quantitative evaluation; harvest period

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.022

金花茶組（Camellia Sect. Chrysantha Chang）屬山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia L.）植物[1]，早在李時珍《本草綱目》有載“山茶產南方……或亦云有黃色者”[2]，是茶花家族中唯一花瓣金黃色的珍稀物種，享有“茶族皇后”“植物界大熊貓”的美譽，含有黃酮類、多糖、茶多酚、皂苷等多種生理活性成分和氨基酸、蛋白質等營養成分[3]，具有清熱解毒、利尿消腫、止痢等功效[4-6]，其葉和花是廣西壯族傳統民間用藥，具有食用、觀賞和藥用的多重價值[7-9]。

目前已發現全世界分布的金花茶組植物有42種5個變種，而我國有29種5個變種[10]，主要分布在北回歸線以南，北緯21°30～22°55、東經107°36～108°33的廣西南部和西南部防城、南寧、東興等地區[11-14]。自1978年開始，福建福州、福建龍巖、湖南長沙、浙江溫州等地均開展金花茶的引種和推廣[15]，已有學者對金花茶組植物馴化栽培、優良品種選育和品質評價等展開研究[4-8， 16-18]，對其研究主要集中在生物學特征評價、總黃酮、茶多酚等多成分含量測定，有研究表明蘆丁、槲皮素、木犀草素和山奈酚是其主要黃酮類成分，也是主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌等作用[8]。迄今有關金花茶葉片綜合評價及適宜采收期的研究尚未見報道，因此本研究基于前人對金花茶葉化學成分的報道，以不同種源、同種不同表型和同一表型不同采收期的金花茶成熟葉片為研究對象，把總黃酮、總多糖、總皂苷、茶多酚及蘆丁、槲皮素、木犀草素和山奈酚等主要黃酮成分作為綜合指標，建立多成分指標結合主成分分析、聚類分析的化學計量學的綜合評價方法評價金花茶葉片，為全面、客觀地評價金花茶葉片品質和適宜采收期提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 5年生不同種源金花茶成熟葉片（編號S1～S6）于2017年5月18日采于福建省漳平市展宏金花茶專業合作社;5年生不同表型防城金花茶（Camellia chrysantha）成熟葉片（編號S7～S14）于2017年5月18日采于福建省漳平市展宏金花茶專業合作社;8年生防城金花茶不同月齡的成熟葉片（編號S15～S26）于2017年1—12月每月10日采于福建省世紀金花科技有限公司金花茶基地。所有樣品經福建省龍巖林業種苗站洪永輝教授級高工鑒定，留樣保存于福建省農業科學院藥用植物研究中心，樣品信息見表1。

對照品蘆丁（批號：100080-201409，91.9%）、木犀草素（批號：111520-201605，99.6%）購自中國食品藥品檢定研究院;槲皮素（批號：100081-200406，98%）購自中國藥品生物制品檢定所;山奈酚（批號：10051321，98%）購自上海同田生物科技有限公司。甲醇（德國Merck公司）、磷酸為色譜純（阿拉丁），水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.1.2? 儀器與設備? Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent technologies公司）;KQ-400DE超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;UV1600紫外可見分光系統（天津市拓普儀器有限公司）;R-210旋轉蒸發儀、B-491水浴鍋（瑞士Buchi公司）;予華SHZ-D循環水式真空泵（鞏義市予華儀器廠）;BP210十萬分之一天平（德國Sartorius公司）;JSP-200高速多功能粉碎機（浙江省永康市金穗機械制造廠）;Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）;Fd-1a-50真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品前處理? 金花茶成熟葉片經冷凍干燥，粉碎后，過40目篩得樣品粉末，備用。

1.2.2? HPLC法測定金花茶葉中蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量? （1）色譜條件。采用Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm），流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～20 min，35%～35% A;20～30 min，35%～55% A;30～50 min，55%～55% A），流速0.8 mL/min，檢測波長為360 nm，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。（2）對照品溶液制備。分別精密稱取對照品蘆丁6.6 mg、槲皮素1.7 mg、木犀草素1.6 mg、山奈酚1.9 mg，分別加入甲醇并定容于10 mL量瓶中，作為對照品貯備液。分別吸取2、1、1、2 mL于25 mL量瓶中，并加入甲醇定容至25 mL，即得蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚質量濃度分別為52.8、6.8、6.4、15.2 μg/mL的混合對照品貯備液，備用。

1.2.3? UV法測定金花茶葉茶多酚、總黃酮、總多糖、總皂苷含量? 茶多酚測定參照《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313— 2008）[19]，得到茶多酚待測液（Ⅰ），按福林酚氧化法測定。

總黃酮的測定參考黃興賢等[20]、韋秀芝等[21]的方法，并稍作修改后得提取流程：稱取0.5 g樣品粉末于50 mL錐形瓶中，加75%乙醇40 mL，20 ℃下超聲提取0.5 h，過濾，用75%乙醇洗滌殘渣，合并濾液定容于50 mL容量瓶中，得總黃酮待測液（Ⅱ），按亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[21]測定。

總多糖測定參考韋璐等[22]的方法，稍作修改，在提取總黃酮后，將殘渣加45 mL水于75 ℃超聲提取1 h，過濾，用水洗滌濾渣，合并濾液定容于50 mL容量瓶中，得多糖待測液（Ⅲ），按苯酚-硫酸法[23]測定。

總皂苷測定參考高麗萍等[24]的提取方法進行優化，稱取樣品粉末0.5 g于錐形瓶中，加入50 mL 75%乙醇，20 ℃下超聲0.5 h，過濾，濾液旋蒸至無醇味，轉移至分液漏斗，加入適量水飽和，正丁醇萃取2次，合并正丁醇層，旋蒸至干，加入甲醇復溶并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，作為皂苷待測液（Ⅳ），按唐昭領等[25]優化的香草醛-冰醋酸-高氯酸法進行測定。每個指標重復測定3次。

1.3? 數據處理

以測定的蘆丁等8種化學成分含量為變量，對26份不同的金花茶葉數據進行主成分分析和聚類分析，所有數據運用Excel 2007軟件和SPSS 20.0軟件進行數據處理和分析。對數據進行標準化處理后，進行主成分分析，得主成分特征向量、特征值、方差貢獻率。特征值表示對應主成分能夠反映原有信息的多少[26]，以特征值大于1的確定主成分，再以累積貢獻率≥80%為選擇主成分依據[27]。運用SPSS 20.0軟件，采用組間平方和，歐氏距離法對26份金花茶樣品進行聚類分析。

2? 結果與分析

2.1? 供試品溶液制備

預實驗考察不同提取方法（超聲和回流）、不同濃度（95%、70%、50%）乙醇作為提取溶劑及pH對4種黃酮的提取效果，結果見圖1。最終確定樣品制備方法為取金花茶葉樣品粉末1 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入50%乙醇0.1 mol/L鹽酸（10∶1）16.5 mL，密塞，稱定重量，超聲提取60 min（功率100 W，頻率50 kHz），放冷，稱定重量，用50%乙醇-0.1 mol/L鹽酸（10∶1）補足減少的重量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液。對照品與樣品的色譜圖結果見圖2。

2.2? HPLC法同時測定金花茶葉中蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量

2.2.1? 線性關系考察? 精密吸取1.2.2（2）方法制備的混合對照品儲備液0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、10 mL于10 mL量瓶中，分別加入9.95、9.9、9.75、9.5、9、8、6、4、0 mL甲醇稀釋至刻度，即得系列濃度對照品溶液。精密吸取10 μL，在1.2.2（1）項色譜條件下進樣，以質量濃度（x）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線。按3倍信噪比計算4個成分的檢測限（LOD），按10倍信噪比計算4個成分的定量限（LOQ）。結果表明（表2），蘆丁、槲皮素、木犀草素和山奈酚相關系數均大于0.9998，線性良好。

2.2.2? 精密度試驗? 精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次，記錄蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚的峰面積，結果顯示4個被測物峰面積相對標準偏差（relative standard deviation， RSD）分別為1.20%、1.82%、2.74%、1.12%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3? 穩定性試驗? 取供試品溶液分別于0、2、6、10、12、24、48 h進樣10 μL，計算得4個被測物峰面積RSD分別為0.54%、2.60%、3.25%、6.44%，結果表明供試液在48 h內穩定。

2.2.4? 重復性試驗? 精密稱取同一批金花茶葉樣品6份，按2.1方法制備供試品溶液，分別進樣，測定峰面積，計算各質量濃度的RSD。計算得4個被測物峰面積RSD分別為0.84%、2.65%、2.52%、1.79%，結果表明該方法重復性良好。

2.2.5? 回收率試驗? 取已知含量的金花茶葉粉末，每份0.5 g，共9份，精密稱定。每3份加入相同量（分別為已知含量的80%、100%、120%）的蘆丁、槲皮素、木犀草素和山奈酚對照品，按2.1方法制備供試品溶液，在1.2.2（1）色譜條件下測定含量，結果蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚平均加樣回收率分別為93.39%、95.26%、103%、95.67%，RSD分別為2.48%、2.90%、3.04%和2.79%，結果表明該回收率符合方法學考察要求，表明該方法準確度高，符合成分分析要求。

2.2.6? 樣品含量測定? 分別取不同種源和不同月齡金花茶葉樣品粉末1 g，精密稱定，按2.1方法制備供試品溶液，進樣10 μL后測定峰面積，代入標準曲線計算其含量，4種黃酮含量結果見表3。結果表明，不同種、不同月份之間的金花茶在蘆丁、槲皮素、木犀草素和山奈酚含量之間存在差異，然而這4種成分含量均較低，甚至在個別樣品中無法測試出來，可以作為不同樣品之間的化學成分標志。

2.3? UV法測定金花茶葉茶多酚、總黃酮、總多糖、總皂苷含量

由表3可見，5年生不同種的金花茶組植物品質具有一定差異，無名金花茶的茶多酚、總黃酮、總多糖、總皂苷含量均高于其他金花茶，四季金花茶次之，其次為顯脈金花茶、防城金花茶和凹脈金花茶。8年生防城金花茶1—12月采收金花茶葉，4種生理活性成分含量高低順序為總皂苷>總黃酮>茶多酚>總多糖，均在10月達到最高值，除茶多酚外，總皂苷、總黃酮和總多糖含量均表現為升-降-升-降的趨勢;蘆丁、山奈酚含量無明顯變化規律，木犀草素在1—2月含量較高，槲皮素和木犀草素在3—8月無顯著變化，槲皮素在9—12月呈逐漸上升趨勢。

2.4? 不同金花茶葉質量的化學計量學分析

2.4.1? 主成分分析? 由表4可知，特征值大于1的主成分有3個，其中第1主成分特征值為2.681，方差貢獻率為33.511%;第2和第3主成分特征值分別為2.117和1.144，方差貢獻率分別為26.461%和14.299%;按照累積貢獻率≥80%提取4個主成分，第4個主成分特征值為0.832，貢獻率為10.399%，4個主成分的累積貢獻率達84.671%。以特征向量為權重得4個主成分的表達式為：

Z1=0.241X1+0.032X2-0.099X3+0.362X4+0.565X5+0.588X6+0.166X7+0.328X8

Z2=0.106X1?0.539X2+0.564X3+0.097X4?0.101X5+0.073X6+0.561X7?0.202X8

Z3=0.737X1?0.004X2+0.036X3?0.580X4?0.141X5+0.020X6+0.007X7+0.314X8

Z4=?0.015X1+0.402X2+0.514X3+0.372X4?0.261X5?0.220X6?0.008X7+0.565X8

式中X1為蘆丁的含量，X2為槲皮素的含量，X3為木犀草素的含量，X4為山奈酚的含量，X5為茶多酚的含量，X6為總黃酮的含量，X7為總多糖的含量，X8為總皂苷的含量。

由主成分特征向量所占權重可知各指標對主成分的貢獻大小，第1主成分主要反映了總黃酮、茶多酚、總皂苷和山奈酚4個線性分量，其中總黃酮和茶多酚的特征向量達0.5以上;影響第2主成分的主要成分是木犀草素、總多糖，而與槲皮素呈顯著負相關;主成分3中，蘆丁具有關鍵正影響作用，而山奈酚則呈負相關性;主成分4則主要反映了槲皮素、木犀草素、總皂苷的含量變化影響。而總黃酮、茶多酚、總皂苷、山奈酚、木犀草素和總多糖是反映金花茶品質的綜合指標，可作為金花茶質量評價的參考指標。

以前4個主成分的貢獻率為權重，得主成分綜合評價函數F=0.33511Z1+0.26461Z2+0.14299Z3 +0.10399Z4，式中Z1、Z2、Z3、Z4為上述4個主成分，主成分綜合得分和綜合排序見表5。5年生不同種及表型（S1～S14）主成分綜合評分大小順序為：無名金花茶>四季金花茶>防城金花茶（花蕾大、花多、不抗寒、花黃且大、尖果）>顯脈金花茶>凹脈金花茶>小果金花茶，不同種之間存在較大的差異，其中以無名金花茶和四季金花茶得分最高。而8年生不同月份（S15～S26）主成分綜合評分大小順序為：10月采>2月采>3月采>4月采>5月采>7月采>6月采>1月采>8月采>12月采>11月采>9月采，表明即使同一品種在不同月份采集，得分截然不同，表明采收月份對金花茶生化成分具有較大影響，其中以10月和2月采的得分較高。

2.4.2? 聚類分析? 由圖3可知，當閾值為13時，不同來源金花茶可分為5大類。S1、S2和S24各為一類，S1（無名金花茶）的特征為第1主成分得分最高，即其茶多酚、總黃酮、總多糖、蘆丁含量最高;S2（四季金花茶）的特征為第2主成分得分最高，表現為總多糖、蘆丁等含量較高;S24（金花茶10月采）的特征是總皂苷含量最高。S21、S22、S20、S3、S7、S16、S17、S18、S19聚為一類，該類樣品大部分為8年生金花茶，第1主成分得分較高，特征為茶多酚、總黃酮、蘆丁等含量較平均;S8、S9、S25、S26、S15、S4、S6、S11、S12、S5、S14、S10、S13、S23聚為一類，該類樣品主要為5年生金花茶，樣品特征為第2、第3或第4主成分得分較高，總皂苷和木犀草素含量較高。

3? 討論

3.1? 液相提取方法和色譜條件的優化

本研究基于前人研究的方法[28-29]，進一步比較了不同濃度（95%、70%、50%）乙醇提取溶劑和pH對4種黃酮的提取效果，結果以50%乙醇?0.1 mol/L鹽酸（10∶1）提取率高。考察了回流和超聲2種提取方法對成分提取率的影響，結果顯示，回流提取率略高于超聲提取，但雜質明顯多于超聲提取，故選擇提取高效、操作更簡便的超聲提取法。

參考牛廣俊[30]測定金花茶葉黃酮的液相方法，對被測成分進行190～800 nm全波長掃描，結果4種黃酮成分在260 nm和360 nm附近均有最大吸收峰，但260 nm下雜質峰吸收干擾大，因此選擇對待測組分干擾更少的360 nm為檢測波長。同時考察了梯度洗脫以及不同流動相（甲醇∶水，甲醇∶磷酸水，甲醇∶乙酸水）對色譜分離的影響，結果表明甲醇：磷酸水洗脫峰形優于甲醇：水，且對待測峰分離效果優于甲醇∶乙酸水，雜質峰少，基線更穩定，因此采用甲醇∶磷酸水為流動相。與牛廣俊[30]的梯度洗脫方法相比，改進流動相，減少進樣量，可以達到待測成分保留時間適中、分離較好的效果。

3.2? 不同來源金花茶葉生化成分含量分析

羅昭潤等[31]研究認為金花茶需經5年栽培才能采摘加工，故本研究選擇5年及以上樹齡為研究對象。研究結果表明，5年生不同種的金花茶組（S1～S14）生化成分具有一定差異，無名金花茶引自越南，其蘆丁、茶多酚、總黃酮、總多糖、總皂苷含量均高于其他金花茶，四季金花茶次之，其次為顯脈金花茶、防城金花茶和凹脈金花茶。小果金花茶為金花茶的變種，僅分布于廣西南寧地區[32]，8種成分含量相對較低，與王坤等[33]發現從越南引種金花茶比廣西本地金花茶總黃酮等4種活性成分高的結果一致，說明不同種的金花茶直接影響葉片的品質。5年生不同表型防城金花茶（S7～S14）中S7（花多）、S9（花蕾大）和S8（花黃大）總皂苷含量達6.12%～7.30%，顯著高于其他表型金花茶，而葉肥厚和葉短圓表型的金花茶活性含量較低，與牛廣俊[30]研究的19類金花茶葉寬、葉長與品質呈正相關性結果一致，均說明葉表型影響金花茶活性成分，而表型受遺傳與環境因素雙重影響，有待進一步探討與研究。

本研究對8年生防城金花茶（S15～S26）葉片成分含量做了動態分析，4種生化活性成分含量順序為總皂苷>總黃酮>茶多酚>總多糖，均在10月含量達到最高值，而蘆丁、山奈酚、木犀草素、槲皮素含量均較低，變化規律不明顯，對生產上的采收期具有參考價值。

3.3? 不同來源金花茶葉主成分分析與聚類分析

基于化學計量學的主成分分析的綜合評分，常用于評價樣品綜合質量[34-35]，本文率先建立了以8種成分為指標進行綜合評分評價金花茶樣品的方法。5年生不同的種及表型間，無名金花茶和四季金花茶葉片品質的綜合評分均比防城金花茶、凹脈金花茶、顯脈金花茶和小果金花茶高，即無名金花茶和四季金花茶相對于其他金花茶葉片品質較優。不同表型防城金花茶中，花表型較大、顏色較黃、花數量較多的類型其葉片品質更好。8年生防城金花茶不同月份采收中，2—4月和10月采收的葉片的總黃酮、茶多酚等含量較高，其綜合評分也較高，表明春季2—4月和秋季10月適合采收防城金花茶成熟葉，其品質更優，這與生產實際基本一致，從理論上解釋了春茶和秋茶口感好、品質優的原因。

聚類分析是一種按數據內在規律客觀合理地分類的方法[26]，在閾值為13時，不同來源金花茶可分為5類，S1、S2和S24各為一類，綜合評分位于前三位，而5年生和8年生金花茶葉各聚為一類，綜合評分靠后，與主成分分析結果基本類似，說明不同種、不同樹齡及采收時間對金花茶品質均有影響，與前人研究結果基本一致[19， 33]。無名金花茶、四季金花茶和防城金花茶中花蕾大、花多、不抗寒、花黃且大的表現型的生化成分較優，即通常稱之為品質較優，可作為良種選育的材料。在采收時，應注意按種源、樹齡分批處理，并加強采收時間管理，以保證加工原料的一致性。

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責任編輯：謝龍蓮